02

2.    Dokonać pomiaru absorbancji przy ). = 260 i 280 nm.

3.    Obliczyć stosunek /4₂₆₀M₂₈₀; jeżeli wartość tego stosunku jest zbliżona do 1,8 dli DNA lub do 2,0 dla RNA, to można oszacować ilość DNA lub RNA, korzystając z tego, że A₂₆₀ = 1 odpowiada 50 pg/ml dwuniciowego DNA i 40 pg/ml RNA.

Uwagi:

1)    Metoda ta pozwala oszacować ilość kwasów nukleinowych bez rozróżnienia pomiędzy DNA i RNA, dlatego też należy brać pod uwagę, że gdy bada się preparal DNA zawierający znaczące ilości RNA — lub odwrotnie, to oszacowanie jest obarczone większym błędem niż w przypadku jednorodnego preparatu, oraz że otrzymana wartość absorbancji dotyczy obydwu kwasów.

2)    Zamiast buforu TE (odcz. I) można zastosować inny bufor lub H₂0.

3)    Szacując ilość kwasów nukleinowych należy pamiętać, że relacje między wartościami absorbancji i stężenia podane są dla drogi optycznej równej 1 cm, odpowiadającej standardowym kuwetom; stosując kuwety o skróconej długości drogi optycznej należy brać po uwagę zmniejszenie wartości absorbancji odpowiadające danemu stężeniu. Jeśli zastosowano kuwety o długości drogi optycznej n [cm], wartość absorbancji należy podzielić przez n. Przykład: z pomiaru absorbancji w kuwecie o długości drogi optycznej 0,5 cm otrzymano wartość 0,237. Zakładamy, że badany preparat jest preparatem czystego DNA, wówczas stężenie DNA w próbce (c) wynosi:

= 23,7 |ig/ml

50 pg/ml- 0,237 0^5

Ćwiczenie 10.34. Fluorescencyjne analizy ilościowe kwasów nukleinowych (J. Samb-

rook i wsp. 1989: Molecular cloning. A laboratory manuał. Book 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, E.5-E.7)

Jeśli stężenie DNA jest tak małe, że nie można zastosować spcktrofotometrycznci analizy ilości DNA (zazwyczaj poniżej 250 ng/ml) lub DNA jest w poważnym stopniu zanieczyszczony substancjami absorbującymi promieniowanie UV, to szybkim sposobem oceny ilości DNA jest wykorzystanie fluorescencji wywołanej światłem UV przez cząsteczki bromku etydyny interkalujące pomiędzy sąsiednie pary zasad DNA. Natężenie fluorescencji jest proporcjonalne do całkowitej masy DNA, wobec tego ilość DNA w próbce można określić przez porównanie natężenia fluorescencji w próbce z natężeniem fluorescencji próbki o znanej ilości DNA (standardu) lub lepiej zbioru takich próbek o różnej zawartości DNA. Tymi metodami można badać próbki zawierające I 5 ng DNA. Dalsze informacje dotyczące analizy fluorescencyjnej kwasów nukleinowych podano w pod-rozdz. 10.2.2.

Zasada: W ćwiczeniu porównuje się wizualnie natężenie fluorescencji bromku etydyny związanego z DNA w badanej próbce z natężeniem fluorescencji szeregu próbek wzorcowych.

432