CCF20130428021

•    Do 0,15 ml tej mieszaniny dodajemy 2 ml formamidu

•    Po wymieszaniu wirujemy przez 5 min przy 3000 obr/min i mierzymy na spektrofotometrze wobec próby zerowej (formamid) przy filtrze 546nm.

Metoda cytochemiczna

•    Mieszamy w równych objętościach (po 0,3 ml) pełnej heaprynizowanej krwi i 0,1% NBT i inkubujemy w 37”C (lub 22) w łaźni wodnej przez 15 min

•    Po tym czasie wykonujemy rozmazy na szkiełkach, utrwalamy je alkoholem metylowym przez 5 min, suszymy i barwimy przez 20 min 0,1% safraniną

•    Uczymy pod mikroskopem 100 kolejnych leukocytów z zabarwionymi na różowo złogami, określając ilość komórek zdolnych do redukcji NBT w postaci - % komórek NBT dodatnich (NBT+).

Indeks fagocytamy - średnia liczba bakterii sfagocytowanych przez jedną komórkę fagocytującą

O Do probówki wprowadzamy 0,2ml zawiesiny makrofagów i 0,2ml zawiesiny gronkowca (Sfc aureus 209P) i po wymieszaniu inkubujemy w łaźni wodnej w temp. 37'C przez 45min O Z zawiesin wykonujemy rozmazy na szkiełkach podstawowych

O Suszymy je na powietrzu i barwimy metodą Pappenheima (2 ml barwnika May-Grunwalda na 3 min; 2ml wody destylowanej na 1 min; spłukać wszystko i nalać 3 ml roztworu Giemsy - lOml wody destylowanej + 15 kropel barwnika Giemsy - na 30 min; spłukać wszystko wodą i wysuszyć na powietrzu)

O Jądra leukocytów obojętnochłonnych barwią się na ciemnoniebiesko, cytoplazma na różowoniebiesko, a same bakterie na niebieskofioletowo

O Preparaty oglądamy pod mikroskopem, licząc w 100 kolejnych makrofagach ilość sfagocytowanych bakterii O Wynik przedstawiamy jako: iF= Liczba sfagocytowanych bakterii/Liczba makrofagów fagocytujących

RBA (Respiratory Burst Activity) - ocena zdolności wewnątrzkomórkowego niszczenia bakterii przez fagocyty krwi - wybuch tlenowy PKA (Potential Killing Acttoity) - ocena zdolności bójczej bakterii przez fagocyty krwi O Do wszystkich rzędów(kolumny l-10)dodajemy po lOOul podłoża(a,b,c)

O Do wszystkich dołków w kolumnach 1-10 dodajemy po 100 ul zawiesiny wyizolowanych limfocytów od pacjenta(pacjent 1 -kolumna 1,pacjent 2 - kolumna 2itd. na płytce max 10 prób)

<5 Kolumna ll=próba „zero", pozostaje pusta

O Kolumna 12= kontrola - do każdego dołka po 200 ul samego podłoża, bez dodatku komórek O Inkubacja - 2h w 37st C lub do 24 h w lodówce O Wirujemy płytkę 2-5min przy 600-800 obr/min i wylewamy zawartość O Do rzędów A i B(kolumny 1-10,12) dodajemy po 100 ul 0,1% zawiesiny NBT w PBS(a) - Kontrola O    Do rzędów C-E (kolumnyl-10,12) dodajemy po 100 ul PMA w 0,1 % NBT (koncentracja 1 ul PMA/lml 0,1% NBT(b) - RBA

O    Do rzędów F-H (kolumny l-10,12)dodajemy po 100 ul zawiesiny bakterii(gronkowca) w 0,1% NBT (koncentracja 1 część bakterii

+ 2 części 0,1% NBT(c) - PKA O Inkubacja 37st.C przez 30 min. Wylewamy medium

O Do wszystkich dołków dodajemy po 100 ul alkoholu absolutnego na 2-5min i wylewamy O Płuczemy 3x70% etanolem(po 100 ul/dołek)

O Suszymy w powietrzu (można przechowywać kilka m-cy)

O Odczyt

o Do wszystkich dołków dodajemy po 120 ul 2-n KOH i 140 ul DMSO

o Wytrząsamy 2 min. PO 5 min odczytujemy na spektrofotometrze przy długości fali - 620 nm. Komórki rybie inkubujemy w 22st.C

o Przy rybach do rozdziału stosujemy wyższe wartości obrotów i czas(35-45 min - 2700obr/min)

25. Białka ostrej fazy- znaczenie w immunologii klinicznej

BIAŁKA OSTREJ FAZY w diagnostyce immunologicznej i monitorowaniu chorób

Odpowiedź ostrej fazy - zespół reakcji obronnych organizmy zmierzający do ograniczenia zapalenia, usunięcie czynnika zakaźnego lub uszkadzającego oraz przywrócenia homeostazy.

Wynikiem reakcji ostrej fazy jest pojawienie się białek ostrej fazy.

Do funkcji białek ostrej fazy należą:

•    Wzmocnienie odpowiedzi nieswoistej

®    Zwiększenie aktywności chemotaktycznych

•    Wiązanie i dezaktywacja wolnych rodników

®    Aktywacja dopełniacza

•    Udział w procesach krzepnięcia i fibrynolizy

•    Ochrona organizmu przez utratą żelaza

®    Zapobiegają uogólnieniu procesu zapalnego

»    Wiążą uszkodzone fragmenty tkanek

22