GENETYKA Anna Sadakierska Chudy , Grażyna Dąbrowska str8

58 Rozdział 5

mórkowej. Protoplastyzacja polega na miejscowym braku lub niedorozwoju ściany komórkowej, skutkiem czego błona cytoplazmatyczna styka się bezpośrednio ze środowiskiem.

Komórki wytwarzają białkowy czynnik kompetencji, którego ilość zmienia się w czasie wzrostu bakterii (bakterie niewytwar/ające tego czynnika nie ulegają transformacji). Czynnik kompetencji wchodzi w interakcję z błonowym receptorem, który po aktywacji wysyła sygnał do chromosomowego DNA i umożliwia ekspresję genów kompetencji (ryc. 5.4a). Produktami tych genów są białka specyficzne dla stanu kompetencji, jednym z nich są autolizyny. które ułatwiają ekspozycję nukleaz i białek wiążących DNA na powierzchni komórki. W takim stadium komórka jest zdolna do pobrania DNA z otoczenia. W warunkach naturalnych źródłem DNA są obumarłe komórki bakteryjne uwalniające DNA do podłoża.

Dwuniciowc fragmenty DNA są absorbowane na powierzchni komórki za pomocą białek wiążących (ryc 5.4b). Nuklcazy degradują jedną nić DNA, natomiast druga nić łączy się z białkami specyficznymi dla stanu kompetencji i zostaje wprowadzona do wnętrza komórki. Obce genomowe DNA odszukuje w genomie

biatka wiążące DNA

nukleazy czynnik

kompetencji

(a)

obce DNA

a) rozwój kompetencji ▲ - czynnik kompetencji

M - receptor ■ - autolizyny

• - białka wiążące DNA

O - nukleazy b) transformacja

^ białka specyficzne dla stanu kompetencji

Ryc. 5.4. Mechanizm transformacji gospodarza homologiczny odcinek i w procesie rekombinacji (podwójny Crossing over) dochodzi do wymiany pojedynczych nici DNA. Wprowadzone DNA może być identyczne lub może nieco różnić się od DNA gospodarza, wówczas obie nici nie mogą właściwie parować i powstaje heterodupleks. Heterodupleks ulega replikacji i w czasie podziału połowa komórek potomnych otrzymuje chromosom z włączonym obcym DNA.

Komórki Bacillus subtilis (bakterie Gram-dodatnie) pobierają dwuniciowy homologiczny lub heterologiczny (z dowolnego organizmu) DNA do przestrzeni pcriplazmatycznej, przecinają na mniejsze fragmenty i degradują jedną nić. Pojedyncza nić przechodzi do wnętrza komórki i zostaje włączona w genom gospodarza na drodze rekombinacji. Białko rec A pomaga w odszukaniu homologicznych sekwencji.

Bakterie Haemophilus influenzae (bakterie Gram-ujemne) pobierają tylko homologiczny DNA, do komórki wnika do 10 fragmentów DNA, co może potwierdzać istnienie miejsc receptorowych. Przypuszcza się, że liczba miejsc receptorowych wpływa na wydajność transformacji.

Transformacja indukowana

Istnieją bakterie, które nic mogą ulegać naturalnej transformacji, na przykład u /:. coli próby transformowania komórek prow adzono przez długi czas, lecz bez rezultatu. Mandel i I liga (1970) dla uzyskania kompetentnych komórek li. coli zastosowali CaCl,, jony Ca² bowiem zw iększają przepuszczalność ściany ko mórkowej. Potraktow ane Ca² komórki stają się kompetentne i można je transformować, inkubując najpierw z DNA w 4°C, a następnie stosując metodę szokli cieplnego (temp. ok. 42°C przez ok. 2 min).

Innym sposobem transformacji jest elektroporacja. Polega ona na zadziałaniu prądem o wysokim napięciu, który powoduje czasowe tworzenie się porów' w błonie komórkowej co ułatwia wnikanie DNA.

W warunkach laboratoryjnych transformację można prowadzić wprowadzonym do pożywki:

liniowym, wysokocząsteczkowym, dwuniciowym DNA,

- plazmidowym DNA.

Kolisty plazmidowy DNA transformuje ze znacznie wyższą wydajnością w porównaniu do fragmentów liniowego DNA.

5.3. Alternatywne sposoby wprowadzania DNA do komórek

5.3.1. Transdukcja komórek prokariotycznych

Transdukcja to wymiana DNA między bakteriami za pośrednictwem wirusów bakteryjnych, tj. bakteriofagów.

Transdukcja ogólna jest wywoływana przez faga P22 u Salmonella typhimu-rium i faga PI u E. coli. Podczas namnażania tych fagów dochodzi do fragmenta-cji chromosomu bakteryjnego, który może być „zapakowany” do otoczki białkowej. W tym procesie za pomocą faga można przenieść z komórki dawcy do biorcy dowolny fragment chromosomu bakteryjnego.