img112 2

(/ aromatycznych pierścieni grup arylowych). Warto zwrócić uwagę na fakt, że jeśli gęstość powierzchniowa ligandu jest stała, to pojemność złoża do wiązania białek wzrasta wraz /. długością łańcuchów alkilowych, jednakże siła, z jaką ulegną związaniu duże cząsteczki białkowe z długimi łańcuchami alkilowymi, może być na tyle duża, że problemem stanie się odmycie tych substancji ze złoża. Nie ma jednoznacznych reguł wyboru rodzaju ligandu. Wybór miedzy ligandem alkilowym a arylowym dokonuje się zwykle empirycznie, osobno dla każdego rodzaju roz dzielanych białek oraz warunków, w jakich wyodrębnianie to ma się odbywać Dostępne są zestawy złóż z różnymi rodzajami związanych ligandów (kolumny IliTrap), pozwalające w bardzo prosty sposób, z zastosowaniem strzykawki, dokonać wyboru odpowiedniego złoża oraz ligandu.

Gęstość powierzchniowa ligandu również w zdecydowany sposób wpływa zarówno na pojemność wiązania białka, jak i na siłę tego wiązania. Wraz ze wzrostem gęstości ligandu wzrasta pojemność wiązania, aż do osiągnięcia wysycenia ok JO pmol ligandu na 1 ml żelu. Wzrasta wtedy również siła wiązania molekuł białkowych z Ugandami, dzięki możliwości wielopunktowego oddziaływania, /byt silnie związane cząsteczki białkowe trudno później odmyć z żelu. Również w tym przypadku należy dokonać odpowiedniego wyboru ligandu i jego gęstości powierzchniowej.

Rodzaj zastosowanego nośnika ma duże znaczenie w wyborze warunków wiązania i elucji zaadsorbowanych białek. Zasadniczo stosuje się trzy rodzaje nośnika usieciowaną agarozę (Sepharose), syntetyczne polimery silikonowe i akrylamidowe Wszystkie typy stosowanego nośnika wykazują właściwości hydrofilowe, ale o różnym natężeniu. Jest to powodem różnic w oddziaływaniu cząsteczek białkowych z hydrofobowym ligandem unieruchomionym na odmiennie hydrofilowej powierzchni. Z tego też powodu trudno jest przenosić doświadczenie uzyskane na jednym typie nośnika na inny jego typ. Zmiana rodzaju nośnika wymaga często zmiany warunków adsorpcji i elucji.

Rodzaj i stężenie soli bardzo silnie wpływa na oddziaływanie białko-ligand w chromatografii hydrofobowej. Ze wzrostem stężenia soli wzrasta również ilość białka wiązanego z hydrofobowymi Ugandami. Początkowo wzrost ten jest liniowy, ale powyżej pewnego stężenia ilość białka wiązanego przez Ugandy wzrasta wykład niczo. Wykładniczy wzrost tej ilości obserwuje się, gdy stężenie soli, powoduje wysalanie danego białka. Białko wytrąca się wówczas na kolumnie chromatografie/ nej. Efekt ten, pomimo obserwowanego wzrostu ilości związanego białka, ma ujemny wpływ na selektywność rozdziału chromatograficznego i należy go unikać w praktyce. Poza stężeniem soli również jej rodzaj ma duże znaczenie dla wydajności i selektywności wiązania oraz elucji białek. Wszystkie typy soli rozpuszczalne w wodzie zostały uszeregowane ze względu na zdolność wysalania białek (seria llofmeistera). Nie wszystkie sole mają jednak podobne znaczenie w praktyce chromatograficznej. Tu podano najważniejsze z nich, uszeregowane według intensywności efektu wysalania (Mclandcr i Horwath, 1977):

Na₂S0₄ > K₂SQ₄ > (NH₄)₂S0₄ > Na₂HP0₄ > NaCI > KCł > LiCI > NaBr > KBr

Jak widać siarczany sodu, potasu i amonu mają najsilniejszy efekt wysalania białek i one też powodują największe ilościowo wiązanie białek z hydrofobowymi Ugandami. Nieco słabsze są fosforan i chlorek sodu. które jednak pozwalają uzyskać zdecydowanie lepszą selektywność wiązania i elucji cząsteczek białkowych. Większość białek związanych z hydrofobowym ligandem daje się stosunkowo łatwo odmyć, z zastosowaniem jako eluentu roztworu tej samej soli, ale o mniejszym stężeniu. Obniżając stopniowo stężenie soli można uzyskać dobrą separację białek.

Wartość pH jest kolejnym czynnikiem, który należy uwzględnić w celu optymalizacji rozdziału w technice chromatografii hydrofobowej. Zaobserwowano, że siła oddziaływań hydrofobowych białka z hydrofobowym ligandem jest tym większa, im mniejsza jest wartość pH. Wynika to stąd, że białka charakteryzujące się słabymi oddziaływaniami hydrofobowymi w środowisku obojętnym — mogą dobrze oddziaływać z hydrofobowymi Ugandami w środowisku o niskim pH. Z drugiej strony, podwyższenie wartości pH czasami umożliwia rozbicie silnych wielopunk-towych oddziaływań hydrofobowych między długimi łańcuchami alifatycznymi, gęsto unieruchomionymi na powierzchni nośnika, a dużymi molekułami białkowymi. Jednakże zbyt duża wartość pH, powyżej 8,5, również sprzyja silnym oddziaływaniom hydrofobowym.

Temperatura odgrywa istotną rolę we właściwym przeprowadzeniu rozdziału HIC. Ogólnie obserwuje się znaczne różnice w stopniu rozdzielenia białek zależnie od tego, w jakiej temperaturze zachodzi separacja. Oddziaływania hydrofobowe cząsteczek białkowych z hydrofobowym ligandem mają bowiem charakter sił van der Waalsa, które zależne są od temperatury. Im wyższa temperatura, tym oddziaływania hydrofobowe są silniejsze.

Skład sołwentów może decydować zarówno o sile oddziaływań hydrofobowych cząsteczek białka z hydrofobowym ligandem, jak i o selektywności tych oddziaływań. Wpływ różnych rodzajów i stężeń soli już omówiono. Zastosowane inne czynniki, takie jak alkohole i detergenty, zdecydowanie zmniejszają siłę wiązania białka z Ugandami, konkurując o miejsca wiążące na Ugandzie. Efekt ten można wykorzystać do poprawienia selektywności wiązania i elucji białek. Należy jednak zawsze rozważyć zarówno możliwość denaturacji białek przez alkohole, jak i dokonania trwałych zmian konformacyjnych w strukturze białka przez detergenty. Niezależnie od tego, alkohole i detergenty mogą być bardzo przydatne w regeneracji kolumn i utrzymywaniu ich w warunkach jałowych.

4.8.2. Złoża stosowane w chromatografii oddziaływań hydrofobowych

Istnieje wiele odmian złóż przeznaczonych do chromatografii wykorzystującej oddziaływania hydrofobowe. Złoża te różnią się rodzajem nośnika oraz rodzajem i długością hydrofobowych ligandów. W tabeli 4.13 zestawiono niektóre właściwości najczęściej stosowanych złóż do chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Należy zwrócić uwagę, że złoża te przewidziane dla technik chromatografii niskociśnieniowej — nie spełniają warunków wymaganych w systemach FPLC (fast

169