Elektrofereza (3)

t

!

powodować błędny odczyt masy migrujących próbek. Dlatego też żele te barwi się po zakończonym rozdziale elektroforetycznym, wkładając je do kąpieli z bromkiem etydyny lub z azotanem srebra. Barwienie srebrem jest o wiele bardziej czułą metodą niż barwienie bromkiem etydyny, który nie może być wykorzystywany do barwienia jednoniciowego DNA. Metoda ta umożliwia detekcję 1-10 pg DNA na 1 mm². Azotan srebra dzięki swej płaskiej konformacji interkaluje między sąsiadujące ze sobą pary zasad nukleinowych w DNA i tworzy z nim trwałe kompleksy. Barwienie srebrem jest metodą złożoną. Po zakończonej elektroforezie następuje odwodnienie żelu poprzez kąpiel w alkoholu. Cząsteczki DNA zostają utrwalone w żelu, dzięki temu nie następuje ich wypłukanie w dalszych etapach barwienia, a także stają się one bardziej podatne na działanie roztworów używanych w kolejnych etapach barwienia. Następnie zachodzi utlenienie DNA kwasem azotowym, dzięki czemu cząsteczki DNA łatwiej wiążą srebro. Srebro w formie rozpuszczonych soli kwasu azotowego, dodane wraz z formaldehydem do kąpieli wodnej żelu, ulega redukcji do formy metalicznej, która wiąże się z DNA, tworząc nierozpuszczalne sole brązowego koloru. Proces redukcji zostaje zahamowany przez dodanie kwasu octowego, co powoduje obniżenie pH. Wybarwiony żel można przenieść na bibułę Whatmana i wysuszyć za pomocą suszarki próżniowej. Tak wysuszony żel należy chronić przed zawilgoceniem. Ogromną zaletą tej metody detekcji DNA jest trwałość uzyskanego wyniku, gdyż nawet po dłuższym przechowywaniu żelu w stanie niewysuszonym można wyekstrahować z niego DNA.

3.4. Procedury laboratoryjne

3.4.1.    Żel agarozowy jednoprocentowy (objętość końcowa 35 ml)

1.    Odważyć 0,35 g agarozy.

2.    Rozpuścić w jałowej kolbie, w 35 ml buforu 1 x TBE.

3.    Agarozę rozpuścić przez podgrzanie zawiesiny w kuchence mikrofalowej, unikając zbyt gwałtownego wrzenia. Roztwór powinien być całkowicie klarowny.

4.    Schłodzić roztwór, ciągle mieszając, do około 55°C. (Uwaga! Nie wolno chłodzić roztworu pod strumieniem zimnej wody, grozi to pęknięciem kolby.)

5.    Dodać 5 pi bromku etydyny (0,5 pg-ml^-1) i delikatnie ruchem okrężnym poruszać naczyniem tak, aby bromek etydyny był dobrze rozprowadzony w roztworze agarozy.

6.    Wylać żel do przygotowanych wcześniej saneczek, włożyć grzebyki. Prawidłowo wylany żel powinien być bez bąbelków powietrza i mieć grubość około 3-5 mm.

7.    Po całkowitym zastygnięciu w celu polepszenia jego rozdzielczości umieścić żel na około 10 minut w lodówce.

8.    Usunąć ostrożnie grzebyk.

10.    Saneczki wraz z żelem umieścić w aparacie do elektroforezy.

11.    Do aparatu do elektroforezy nalać taką ilość 1 x stężonego TBE, aby bufor przykrywał żel na wysokość około 5 mm.

3.4.2.    Żel poliakryloamidowy natywny

1.    Do jałowego naczynia szklanego odmierzyć i wlać kolejno: poliakryloamid (29 : 1), 1 x bufor TBE, TEMED.

2.    Przygotowując żel poliakryloamidowy, należy pamiętać o zasadzie, że na 1 ml końcowej objętości roztworu poliakryloamidu należy dodać 1 pl TEMED i 10 pl APS - 10% roztworu. (Uwaga! APS należy dodawać do roztworu bezpośrednio przed wylaniem żelu.)

3.    Całą mieszaninę nabrać do strzykawki, nakręcić filtr membranowy na koniec strzykawki i przesączyć do nowej jałowej zlewki szklanej.

— 23 —