Obraz0

Rys. 4 Otrzymywanie pułapkowanych komórek drożdży (łub enzymów) w żelu aiginianu wapnia

A) w postaci perełek B) w postaci włókien

♦    Pozostawić otrzymane perełki aiginianu wapnia z immobilizowanymi komórkami na około 30 min celem całkowitego żelowania (’utwardzania”). Perełki odsączyć na plastikowym sitku, przemyć kilkakrotnie 10 mM roztworem chlorku wannia w 40 mM buforze octanowm o pH 6,0; przechowywać je w tym roztworze w temp. 4^ C.

*    Zbadać przebieg hydrolizy sacharozy oraz tworzenie etanolu przez immobilizowane komórki drożdży, jak opisano niżej.

wykonujących

temp.37° C. W

Do 100 ml 0,1M roztworu sacharozy w 0,05M buforze octanowym, pH 5,0 ogrzanego do temp. 37°C dodać od 2 do 8 przemytych perełek (różną ilość dla poszczególny cli par ćwiczenie) i inkubować mieszaninę w łaźni wodnej z wytrząsaniem w określonych odstępach czasu (0, 5, 10, 20, 30, 40, 50 i 60 min) pobierać próbki roztworu (po 1 ml) i dodawać je do przygotowanych wcześniej probówek zawierających po 2 mł odczynnika odczynnika DNS. Po zakończeniu doświadczenia oznaczyć zawartość cukrów redukujących w pobranych próbach metodą DNS. Próbki ogrzać 10 min łaźni wodnej o temperaturze 95°C i ochłodzić. Dokonać pomiaru przy X = 540 nm względem próby pobranej w czasie „zerowym”.

UWAGA ! jeśli natężenie barwy jest zbyt wysokie, wszystkie próby włącznie z próbą zerową odpowiednio rozcieńczyć woda destylowaną.

Opcja !

Równolegle w takich samych odstępach czasu jak wyżej pobierać po 0,5 ml roztworu inkubacyjnego do oznaczania etanolu poznaną wcześniej metodą enzymatyczną opartą na tworzeniu zredukowanego NADH i pomiarze przy X = 340 nm. Po zakończeniu doświadczenia napipetować do kuwet szklanych (lub kwarcowych) po 1,5 ml mieszaniny enzymatycznej do oznaczeń etanolu (Calbiochem, Alkohoł-Stat-Pack) ustawić zero aparatu i następnie dodać 50 pil próbki i włączyć stoper. Dokonywać pomiaru absorbancji przy X = 340 nm co 1 min.; po ustaleniu się stanu równowagi (po około 10 min.) obliczyć stężenie etanolu w próbie, wiedząc że molowy współczynnik absorbancji dla NADH wynosi E = 6220.

4