Porównanie DNA roś i zwierz (2)

D.    ELEKTROFOREZA W POLU INWERSYJNYM (FIGĘ)

Elektroforeza w polu inwersyjnym jest stosowana do rozdzielania fragmentów DNA o długości 20-2000 p.z., przy czym rozdzielczość tej metody jest około 100-krotnie wyższa niż w przypadku zwykłej elektroforezy agarozowej. Zastosowano tu elektryczne pole inwersyjnym którego wektor natężenia pola zmienia zwrot na przeciwny w określonych momentach. Stosunek czasu trwania impulsu dodatniego do ujemnego wynosi 3:1, a wartości bezwzględne natężenia pola obydwu impulsów są równe. Podczas elektroforezy w polu inwersyjnym łańcuchy DNA ulegają cyklicznym, synchronicznym zmianom konformacyjnym, które trwają do chwili zmiany zwrotu wektora natężenia pola elektrycznego na przeciwny.

E.    ELEKTROFOREZA KAPILARNA (CE1

Elektroforeza kapilarna jest stosowana do analizy krótkich, jednoniciowych oligonukleotydów oraz sekwencjonowania DNA. W elektroforezie kapilarnej stosuje się kolumny (kapilary), których wewnętrzna średnica wynosi najczęściej 50-100 pm, natężenie prądu 10-20 pA, a natężenie pola elektrycznego w żelu około 300 V/cm przy zastosowaniu buforu o niskiej przewodności. W tej elektroforezie wykorzystano efekt elektrosomozy. Kapilary wykonane są ze stopionej krzemionki, która zawiera wolne grupy silanolowe ulegające jonizacji pod wpływem działania elektrolitu o pH<2, na skutek czego wewnętrzna powierzchnia kapilar zostaje naładowana ujemnie, a gęstość jej ładunku zależy od pH. Przylegająca warstwa jonów dodatnich z roztworu znajdującego się w kapilarze po przyłożeniu pola elektrycznego porusza się, powodując przepływ cieczy z zewnętrznego zbiornika przez kapilary. Detekcja odbywa się najczęściej przez monitorowanie absorbancji UV na kolumnie. Objętość próbki jest rzędu nanolitrów, co pozwala analizować składniki pojedynczych komórek.

F.    ELEKTROFOREZA W ŻELACH DENATURUJĄCYCH (CGGE)

Elektroforeza w żelach denaturujących jest głównie wykorzystywana do wykrywania i analizy mutacji.,; Wykorzystuje się tu fakt, że temperatura topnienia wiązań wodorowych między zasadami azotowymi DNA zależy od składu zasad komplementarnych nici. Stosuje się tu czynnik denaturujący, głównie mocznika lub formamidu. Elektroforeza prowadzona jest w temperaturze bliskiej temperaturze topnienia danego DNA, zazwyczaj w 55-60°C. Temperatura topnienia DNA zależy od składu ilościowo puryn i pirymidyn w DNA (temperatura topnienia dla G i C jest wyższa niż dla A i T).

3. SPEKTROSKOPIA ABSORPCYJNA

W pomiarach spektroskopowych zasadnicze znaczenie ma znajomość stężeń molowych kwasów nukleinowych. Stężenie można otrzymać z pomiaru absorpcji przy długości    fali

X = 260 nm (maksymalna absorpcja promieniowania nadfioletowego przez DNA), jeżeli znamy molowy współczynnik ekstynkcji s:

C = ——

E •/

gdzie 1 - to długość drogi optycznej w kuwecie. Przyjmuje się, ze wartości współczynnika ekstynkcji wynosi 6600 M^cmf¹.

Widmo absorpcji może być wykorzystane do określenia stężenia i czystości próbki DNA. Pomiar stężenia DNA w roztworze oznacza się poprze pomiar absorpcji przy długości fali X = 260 nm, określanej często jako OD - gęstość optyczna. Idealny roztwór do pomiarów spektrofotometrycznych DNA to bufor o niskim stężeniu jonów, np. bufor TE. Jeżeli A260 równa się 1 to stężenie dwuniciowego DNA (dsDNA) wynosi około 50 pg/ml, jednoniciowego DNA (ssDNA) 36 pg/ml, RNA - 40 pg/ml, a oligonukleotydów 30 pg/ml. Należy jednak pamiętać, że jest to wartość przybliżona, ponieważ wartość

4