skanuj0002

Do powierzchni warstwy enzymatycznej dyfunduje tlen rozpuszczony w wodzie oraz substrat. W nieobecności substratu ustala się pewien początkowy stan stacjonarny, któremu odpowiada początkowy, ustalony sygnał elektrody tlenowej. Po dodaniu do roztworu pewnej ilości substratu, w warstwie unieruchomionego enzymu część tlenu jest zużywana w reakcjach (1) i (2) w zależności od tego, jaki jest substrat, a strumień tlenu dyfundującego do powierzchni elektrody ulega zmniejszeniu. W efekcie zmniejsza się natężenie prądu będącego wynikiem redukcji tlenu na katodzie i sygnał elektrody maleje, aż ustali się nowy stan stacjonarny (Rysunek 2).

dodanie porcji substratu

Rysunek 2. Zmiany sygnału elektrody enzymatycznej po dodaniu substratu i sposób analizy tych zmian

W metodzie stacjonarnej mierzy się zmniejszenie sygnału AS powstałe w wyniku dodania substratu czyli różnicę sygnału w stanie stacjonarnym w nieobecności substratu i po jego dodaniu. W metodzie kinetycznej można mierzyć początkową szybkość zmniejszania się sygnału v₀ (Rysunek2). W obu wypadkach mierzona wielkość (AS lub v₀) jest wprost proporcjonalna do stężenia substratu w badanym roztworze. W efekcie, dokonując pomiarów dla kilku różnych stężeń substratu, możemy otrzymać krzywą kalibracyjną elektrody enzymatycznej czyli zależność AS = f(c_SUbstratu) lub v₀ = f(Cs_Ubstratu), która powinna być linią prostą. Jednak istnieje wiele czynników powodujących, że rzeczywiste krzywe kalibracyjne są nieliniowe, szczególnie dla wyższych stężeń substratu. Pierwszym z nich jest wyczerpywanie się tlenu w pobliżu powierzchni elektrody w obecności wysokiego stężenia substratu. Drugim - mała aktywność unieruchomionego enzymu, co powoduje, że odpowiedź elektrody jest kontrolowana przez kinetykę reakcji enzymatycznej, a nie przez dyfuzję reagentów do powierzchni elektrody. Można temu zapobiec stosując dużą ilość unieruchomionego enzymu. Trzecim - istotnym tylko w przypadku niektórych enzymów - autoinhibicja enzymu przez wysokie stężenie substratu. Czynnik ten jest szczególnie ważny w przypadku oksydazy polifenoli, gdyż należy ona do grupy enzymów podlegających „samobójczej” inaktywacji przez substrat.

Ponieważ czyste enzymy są często bardzo drogie i trudno dostępne, toteż często wygodnie jest posłużyć się enzymem w postaci surowego wyciągu z odpowiednich tkanek czy mikroorganizmów. W przypadku tyrozynazy bogatym źródłem tego enzymu są różne tkanki

2