37

W celu zlokalizowania i zidentyfikowania rozdzielonych związków chromatogram wywołuje się spryskując go po wysuszeniu roztworem odpowiedniego odczynnika dającego z tymi związkami reakcję barwną. Jeżeli rozdzielone związki fluoryzująlub pochłaniają światło ultrafioletowe, to można je łatwo zlokalizować oglądając chromatogram w świetle ultrafioletowym o odpowiedniej długości fali.

Ze względu na znaczne uzależnienie wartości Rf od warunków rozdziału przy identyfikacji rozdzielonych związków należy raczej posługiwać się wzorcami, tj. roztworami znanych związków o bardzo wysokiej czystości, których występowanie w rozdzielanej mieszaninie jest spodziewane. Związki takie nakrapla się na tym samym chroma togramie obok mieszaniny związków nieznanych, rozwija w tych samych warunkach, a następnie po wywołaniu chro-'matogramu porównuje ich barwę i współczynniki Rf.

"W chromatografii cienkowarstwowej warstwę nośnika sporządza się na płytce szklanej lub plastikowej. Jako nośnik stosuje się najczęściej celulozę, żel krzemionkowy, tlenek glinowy. Warunki i zasady rozdziału oraz metody identyfikacji w technice cienkowarstwowej są takie same jak w technice bibułowej, przy’ czym szybkość rozdziału jest tu znacznie większa i w pewnych wypadkach może wynosić zaledwie kilkanaście minut Stąd technika ta ma w pracach laboratoryjnych coraz wieksze zastosowanie.

o/

SfcKozdział i identyfikacja aminokwasów metodą chromatografii podziałowej

Wprowadzenie

Zastosowanie metody chromatografii podziałowej po raz pierwszy opisano właśnie dla rozdziału mieszaniny aminokwasów. W omawianym ćwiczeniu do rozdziału i identyfikacji aminokwasów wykorzystywana jest technika krążkowa.W technice tej układ rozpuszczalników przesuwa się promieniście od środka arkusza bibuły, do którego doprowadzany jest za pomocą knota utworzonego ze zwiniętego paska bibuły."

Sposób umieszczenia chromatogramów w kamerze chromatograficznej oraz oznakowanie punktów nanoszenia próbek przedstawiono na rysunku T.^Aminokwasy, nakroplone indywidualnie lub w mieszaninie w punktach wyznaczonych na okręgu (rys. 7) w miarę podsiąkania rozpuszczalników przesuwają się wraz z fazą rozwijającą wzdłuż promieni koła. Po rozwinięciu chromatogramu umiejscowione są one.na bibule w formie koncentrycznych łuków, w różnej odległości od środka arkusza. Prędkość przesuwania się poszczególnych aminokwasów, czyli odległość, na jaką przesunęły się one od miejsca startu w określonym czasie, zależy od ich współczynnika podziału (a) między fazą stacjonarną i ruchomy Na jakość rozdziału mieszaniny na chroma togramie duży wpływ wywierają takie czynniki, jak temperatura, wielkość kamery chromatograficznej, stopień nasycenia kamery parami rozpuszczalników, a także stopień ich czystości. W określonych warunkach rozdziału każdy aminokwas charakteryzuje się stałą wielkością współczynnika przesunięcia (Rf).

^rDo uwidocznienia na bibule plam aminokwasów, czyli wywołania chromatogramu, wykorzystuje się zdolność tych związków do tworzenia barwnych produktów reakcji. Najczęściej stosuje się w tym celu ninhydrynę, lecz bywa stosowana również izatynaj Reakqa aminokwasów z ninhydryną charakteryzuje się dużą czułością, pozwala wykryć na bibule 0,1 do 1,5 (ig aminokwasu. Reakcja z izatyną jest mniej czuła (można wykryć 0,2- 5,0 (rg aminokwasu), ale ma tę zaletę, że tworzy z poszczególnymi aminokwasami plamy o różnym