DSC
94 (10)

124 S. Kwas askorbinowy - witamina C

ekstraktów, zawierających kwas askorbinowy, roztworem 2,6-dichi indofenolu o znanym stężeniu. Metoda ta została zaproponou, ^r°**»oi J. Tillmansa, a następnie była modyfikowana i ulepszona. Przebij Ptv kwasu askorbinowego z odczynnikiem Tillmansa (2,6-dichlorofenolo** lem) przedstawiono na rysunku 5.9.

c)    d)

Rys. 5.9. Reakcja kwasu L-askorbinowego z 2,6-dichlorofenoloindofenolem a) kwas L-askorbinowy; b) 2,6-dichlorofenoloindofenol; c) kwas dehydroaskorbin₀ d) fenoloimina    Jj

A zatem w metodzie Tillmansa kwas L-askorbinowy utlenia się do kwgg dehydroaskorbinowego, natomiast niebieski barwnik, jakim jest 2,6-dichJorof noloindofenol, redukuje się do bezbarwnego związku, tzw. leukoformy.

Metoda ta nie daje możliwości oznaczenia zawartości kwasu dehydroaskor binowego, a ponadto jej poważnym mankamentem jest fakt, że wszystkie czynniki redukujące obecne w badanej próbie redukują odczynnik Tillmansa i zawyżają wyniki oznaczeń witaminy C. Jednakże kwas dehydroaskorbinowy może być z łatwością zredukowany, np pod działaniem siarkowodoru, cysteiny lub homocysteiny, do kwasu askorbinowego, a to umożliwia oznaczenie zawartości obydwu tych form witaminy C.

Niektóre z fizykochemicznych metod oparte są na tworzeniu osazonó* j w reakcji kwasu dehydroaskorbinowego czy tez 2,3-dioksogulonowego z 2,4--dinitrofimylohydrazyną Metody te umożliwiają oznaczenie zawartości kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego, a także nieaktywnych biologicznie produktów hydrolizy lego ostatniego, tj przede wszystkim kwasu 2,3-dio-k sogulonowego

Na redukujących właściwościach kwasu askorbinowego bazuje kilka innych metod, w których w charakterze czynników utleniających stosowane są: jod, heksacyjanożelazian (III) potasu, błękit metylenowy, chloramina, jodan lub bromian potasu, N-bromosukcynoimid, molibdenian amonu i inne. Wszys-tlcie te metody nie są wystarczająco specyficzne, albowiem różne substancje redukujące obecne w produktach spożywczych i innych naturalnych obiektach przeszkadzają w oznaczeniu witaminy C, w istotnej mierze zniekształcając uzyskiwane wyniki.

Wpływ niektórych z tych towarzyszących związków redukujących, ą w szczególności zawierających grupy tiolowe, można wyeliminować przez zablokowanie ich grup tiolowych w reakcji z p-chlorortęciobenzo-esanem.

Podejmowane były liczne próby zmierzające do zwiększenia specyficzności omówionych wyżej metod. Wśród tych prób na szczególną uwagę zasługują modyfikacje zakładające włączenie do procedury analitycznej enzymu — oksydazy askorbinianowej i technik chromatograficznych. Ostatnio zarówno chromatografia gazowa, jak i wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) są coraz szerzej wykorzystywane do oznaczania zawartości kwasu askorbinowego w produktach roślinnych.

Ciekawa jest również metoda jodometryczno-fluorymetryczna, polegająca na jodometrycznym utlenianiu kwasu askorbinowego do dehydroaskorbinowego i kondensacji tego ostatniego z o-fenylenodiaminą. W rezultacie tej kondensacji tworzy się fluoryzująca pochodna chinoksaliny, której intensywność fluorescencji mierzy się za pomocą fluorymetru przy 423 nm. Jest to metoda bardzo czuła, pozwalająca oznaczyć witaminę C w ilości 0,05 /ig.

Liczne metody oznaczania kwasu askorbinowego oparte są na redukcji Fe (III) do Fe (II) i tworzeniu barwnych kompleksów zredukowanego żelaza (11) z takimi czynnikami kompleksującymi, jak 4,7-difenylo-l,10-fenantrolina czy też 2,2'-dipirydyl. Jest to o tyle dobre, że w obecności kwasu ortofosforowego przy pH 1 - 2 inne substancje redukujące, towarzyszące kwasowi askorbinowemu, nie przeszkadzają w oznaczaniu zawartości witaminy C.

Na szczególną uwagę zasługują też metody z wykorzystaniem enzymów, a zwłaszcza oksydazy askorbinianowej. W tym przypadku witamina C jest oznaczana przed i po dodaniu tego enzymu, a właściwa detekcja bazuje na redukcji żelaza i kompleksowaniu żelaza dwuwartościowego.

Do fotometrycznego oznaczania kwasu askorbinowego można oprócz 2,4-dinitrofenylohydrazyny wykorzystać diazowane nitroaminy, tworzące barwne związki z tą witaminą.

Ze względu na dużą dokładność i łatwość wykonania szerokie zastosowanie znajdują też metody polarograficzne.