Laboratorium mikrobiologiczne
Cel ćwiczenia
" Zapoznanie się z regulaminem ćwiczeń
" Poznanie podstawowego szkła i sprzętu
mikrobiologicznego i sposobów sterylizacji
" Zapoznanie siÄ™ rodzajami i sposobem
przygotowywania podłoży mikrobiologicznych oraz
metodami hodowli mikroorganizmów
" Mikroskopy stosowane w badaniach
mikrobiologicznych
Podstawowe szkło
" Probówki bakteriologiczne (probówki Falcone)
" PÅ‚ytki (szalki) Petriego
" Kolby Roux (inne butelki)
" Kolby Erlenmayera
Sprzęt do szczepienia
" Igła bakteriologiczna
" Eza bakteriologiczna
" GÅ‚aszczka Drygalskiego
" Palnik
Sprzęt do hodowli
" Termostat
" WytrzÄ…sarka
Sprzęt do sterylizacji
" Suszarka do sterylizacji szkła
" Autoklaw do sterylizacji podłoży
Metody sterylizacji
" Fizyczne
" Chemiczne
Metody fizyczne
" Wysoka temperaturą (sucha  wyżarzanie,
opalanie, gorÄ…ce powietrze i parÄ… wodnÄ… 
dekoktacja, pasteryzacja, tyndalizacja, para wodna
pod zwiększonym ciśnieniem - sterylizacja)
" Promienie elektromagnetyczne: UV, radiacyjne
(jonizujÄ…ce)
" SÄ…czenie
Metoda chemiczna
" Sterylizacja gazowa (tlenek etylenu w mieszaninie
CO2, beta-propiolakton, ozon i chlor, fluor  woda)
Kontrola sterylizacji
" Sporotesty (sporal A do autoklawów, sporal S do
suszarek np. stericon plus Bioindicator do
autoklawu zawiera przetrwalniki Geobacillus
stearothermophilus w fiolce 2 ml). Po
autoklawowaniu ampułki inkubuje się 48 godz. w
temp. 60Ä… 2oC. Nie wysterylizowane jako kontrola.
Jeśli kolor pozostanie czerwono-fioletowy to
sterylizacja poprawna.
Dezynfekcja
" Środki chemiczne (kwasy, zasady, środki
utleniajÄ…ce, alkohole, aldehydy, zwiÄ…zki fenoli i ich
pochodne, zwiÄ…zki powierzchniowo czynne,
jodofory, chloroheksydyna, sole metali ciężkich)
" Kontrola skażenia powierzchni i powietrza
drobnoustrojami
Zastosowanie podłoży mikrobiologicznych
" Izolacja
" Różnicowanie
" Identyfikacja
" Namnażanie
" Określenie właściwości fizjologicznych,
biochemicznych i hodowlanych
Rodzaje podłoży ze względu na zawartość
składników odżywczych
" Minimalne
" Pełne
" Wzbogacone
Rodzaje podłoży ze względu na skład
chemiczny
" Naturalne
" Półsyntetyczne
" Syntetyczne
Rodzaje podłoży ze względu na konsystencję
" Stałe (zaw. 1,5-2,0% agaru)
" Półpłynne (0,1-0,7 agaru)
" PÅ‚ynne
" Agar - uniwersalny środek zestalający pożywki
mikrobiologiczne (z morskich krasnorostów
Selidum amansi)
" Żelatyna (produkt hydrolizy kolagenu)
Rodzaje podłoży ze względu na przeznaczenie
i zastosowanie
" Namnażające
" Wybiórcze
" Namnażająco-wybiórcze
" Izolacyjne
" Różnicujące (identyfikacyjne, diagnostyczne)
" Podłoża  transportowe
Metody hodowli
" Ze względu na rodzaj podłoża:
- hodowle płynne
- hodowle na podłożu stałym
Hodowle płynne
" W probówkach
" W kolbach
" W butlach
" W fermentorach
Fermentory
Hodowle na podłożach stałych
" Na płytkach Petriego
" SÅ‚upkach
" Skosach
" W butlach
Ze względu na czas hodowli oraz dostęp
składników pokarmowych
" Hodowle okresowe (zamknięte)  czynniki
ograniczające to wyczerpanie składników
pokarmowych, nagromadzenie metabolitów i zmiana
równowagi jonowej (głównie pH)
" Hodowle otwarte (ciągłe)  ciągła kontrola zużycie
substancji odżywczych, przyrost liczby i masy
drobnoustrojów oraz stężenie metabolitów
" Hodowle zsynchronizowane  wszystkie osobniki
dzielą się jednocześnie (w tym samym czasie)
Ze względu na stosunek bakterii do tlenu
" Hodowle tlenowców
" Hodowle beztlenowców
Hodowle tlenowców
" Hodowle powierzchniowe
" Hodowle wgłębne (wytrząsarki, fermentory)
Hodowle beztlenowców
" Metody fizyczne (warstwa oleju parafinowego, słój
próżniowy, hodowla w atmosferze gazu obojętnego,
przy użyciu zestawu np.  Gas-Pak )
" Metody chemiczne (podłoża zawierające
substancje chemiczne absorbujÄ…ce tlen np.
pirogallol, chlorek miedziowy lub zwiÄ…zki chemiczne
obniżające potencjał oksydo-redukcyjny np. kwas
askorbinowy, siarczyn sodowy)
" Metody biologiczne  hodowla na tym samym
podłożu tlenowca i beztlenowca
Mikroskopy do obserwacji mikrobiologicznych
" Åšwietlny
" Z ciemnym polem widzenia
" Kontrastowo-fazowy
" Ultrafioletowy
" Fluorescencyjny
" Polaryzacyjno-interferencyjny
" Elektronowy transmisyjny
" Skaningowy
Mikroskop świetlny
" Najważniejsze pojęcia dla mikrobiologa to powiększenie
mikroskopu i zdolność rozdzielcza
" Powiększeniem mikroskopu to stosunek obrazu pozornego A ,
który widzimy w mikroskopie do wielkości przedmiotu
(iloczyn powiększenia okularu i powiększenia obiektywu)
" Zdolność rozdzielcza (najmniejsza odległość pomiędzy
dwoma punktami, przy której widzimy je w mikroskopie
oddzielnie)
" Olejek immersyjny pozwala zwiększyć zdolność rozdzielczą
mikroskopu do 0,19 mikrometra zwiększając aperturę
liczbowÄ… obiektywu (suchy  0,3 mikrometra,  wodny  0,24
mikrometra)
" Zastosowanie odpowiednich filtrów lub światła UV może
zwiększyć zdolność rozdzielczą do 0,17 mikrometra
Mikroskop z ciemny polem widzenia
" Pole widzenia ciemne, a obserwowane obiekty 
jasne (kondensor ciemnego pola)
" Stosowany olejek immersyjny (górna soczewka
kondensora a dolna pow. preparatu)
" Zdolność rozdzielcza podobna jak w mikroskopie
świetlnym
" Obserwacje żywych bakterii
krętki
Mikroskop kontrastowo-fazowy
" Bezbarwne obiekty fazowe (przezroczyste)
przekształcane są w obiekty amplitudowe
powodujące zmiany natężenia światła widoczne dla
oka przy zastosowaniu płytki fazowej
" Umożliwia obserwacje żywych bakterii a w
szczególności ich ruchu (bez wybarwiania)
komórki
drożdży
Mikroskop ultrafioletowy
" Stosowane są lampy rtęciowo-kwarcowe
" Poprzez zastosowanie światła UV ( o krótszej fali)
zwiększona została zdolność rozdzielcza do 0,1
mikrometra
dwie kolonie
Streptomyces sp.
Mikroskop fluorescencyjny (luminescencyjny)
" Wykorzystywane zjawisko pobudzania świecenia
preparatów oświetlanych promieniami
ultrafioletowymi po wybarwieniu fluorochromami
(barwniki wysyłające światło o długiej fali po
wzbudzeniu promieniami UV) np. erytrozynÄ…,
oranżem akrydynowym, rodaminą
bakterie
z fluoryzujÄ…cym
na zielono
białkiem
Mikroskop polaryzacyjno-interferencyjny
" Służy do obserwacji przezroczystych i
pochłaniających światło obiektów
" Zastosowany pryzmat, polaryzator i analizator
" Oglądany przedmiot robi wrażenie przestrzennego
Inne mikroskopy
" Mikroskop elektronowy  transmisyjny (wykorzystywane sÄ…
trzy elektromagnesy i wiązka elektronów a obraz
przekazywany jest na ekran lub kliszÄ™ fotograficznÄ…),
zdolność rozdzielcza 4-10 Å, siatki platynowe zamiast
szkiełka podstawowego, preparaty bardzo cienkie do 0,5
mikrometra, obraz trójwymiarowy
" Mikroskop skaningowy (elektrony przechodzą przez cały
preparat a powstały obraz może być fotografowany lub
obserwowany na monitorze) obraz trójwymiarowy, zdolność
rozdzielcza 0,02 mikrometra, obserwacja bakterii i ich
penetracji w komórkach gospodarza
Obrazy z mikroskopu transmisyjnego
pączkujące drożdże(przekrój)
Salmonella sp.
Obrazy z mikroskopu skaningowego
Enterococcus faecalis
Bacillus anthrax
Typ mikroskopu Oświetlenie Obraz Zdolność Powiększenia
preparatu rozdzielcza
świetlny światło światło widzialne 0.2 źm 5 1 500 x
widzialne (okular)
fluorescencyjny ultrafiolet światło widzialne 0.2 źm 5 1 500 x
(okular)
elektronowy strumień światło widzialne 0.2- 1 nm 1000-500 000
transmisyjny elektronów
(ekran fluoresc.)
elektronowy strumień elektroniczny 3-10 nm 100-50 000 x
skaningowy elektronów (monitor)
tunelowy prÄ…d elektroniczny 001-0.1 nm 10 000 000 x
elektryczny (monitor)