3582326755

Wykład 4 09.03

Pierwszy problem rozwiązano za pomocą znajomości genomu faga X - geny są pogrupowane i szczęśliwie okazało się. że w środkowej części znajdują się geny, które są zbędne dla faga o funkcji wektora

3 a

I

<

z

o

-i -S

pEMBL8: wektor hybrydowy (fagenud)

—¹► Posiada zalety M13, ale jednocześnie pozwala na wklonowanie dłuższych fragmentów.

•    wektor jest hybrydą faga i plazmidu (w tym przypadku faga M13 i typowego plazmidu, np z serii PUC)

•    posiada oporność na ampicylinę (amp), miejsce oii. lacZ' (jak w każdym plazmidzie)

•    fragment DNAM13 -zawiera wszystkie sekwencje potizebne do tego, aby mogła powstać pojedyncza nić

Kiedy potrzebrijemy otrzymać DNA w postaci pojedynczej mci (w formie kolistej), wtedy komórki, które posiadają dany plazmid muszą być zakażone fagiem pomocniczym. Fag pomocniczy dostarcza wszystkich białek potrzebnych do tego, aby na matrycy fagemi-dowej mogła rozpocząć sę synteza pojedynczej nici DNA. Fag pomocniczy jest tak skonstruowany, że jego DNA nie podlega replikacji i mapowaniu w białkach osłonkowycli, które również dostarcza.

•    możliwość usunięcia do 15 kb, a zatem insert może mieć do 18 kb

•    zostaje wycięty fragment odpowiedzialny za możliwość istnienia faga w formie litycznej

Drugi problem rozwiązano posługując się selekcją naturalną. Infekowano E. Coli szczepem dzikim faga X. Zauważono, że po pewnym czasie liczba miejsc restrykcyjnych się zmniejsza - lag się uodpornia, następują naturalne mutacje. Następnie infekowano komórki fagiem X o zmniejszonej ilości miejsc restrykcyjnych aż do uzyskania faga X, którego DNA nie ulega przecięciu.

Rodzaje wektorów faga X:

•    wektoiy inserycjne

•    wektory zastępcze

Wektor insercyjny

Konwersja pEMBL8 dojednonlciowego DNA

Białko M13 replikuje pEMBL8 do Jednoniclowego DNA

Dwuniciowe

pEMBLS

Jednoniciowe cząsteczki pEMBLS

'fagowe' cząstki pEMBL8

wektor insercyjny \ (3S-40 kb)

♦ i—.—i

O Białko

replikujące M13

Klonowanie wektorów bazujących na fagu A

Przed skonstuowaniem tych wektorów trzeba było rozwiązać dwa problemy:

•    wielkość - istnieją pewne granice wielkości cząsteczek, jakie mogą być pakowane w^;e wnętrzu główki laga (3 kb - 52 kb)

•    miejsca restrykcyjne - enzymy restrykcyjne tną cząsteczkę w wielu miejscach i staje się ona bezużyteczna chociaż enzymy restrykcyjne są uznawane za unikatowe.

•    krótszy fragment

•    jedno miejsce restrykcyjne }

Konstrukcja wektora insercyjnego \

Normalne \ DNA

i    ^ kb) j Cięcie, ligacja

¹-'

Region mało istotny

AgtlO

•    zostało wygenerowane miejsce EcoRł do klonowania

•    dokładnie znana długość wektora (40 kb)

•    selekcja rekombinantów polega na zmianie fenotypu łysinek (miejsce klonowania jest zlokalizowane w obrębie genu kodującego X represor)

AgtlO

Eco Rl

I    rjl    I 40 kb

Delecja    cl

A2APII

•    podobna długość wektora

•    selekcj a polega na selkcji biało-niebieskiej (lacZ ’)

AZAPII

P

I_^d_j_j41kb

lacZ' Delecja