Obserwacje mikroskopowe
organizmów wyizolowanych
w preparatach przyżyciowych.
Cel ćwiczenia
" Nauka przygotowywania preparatów
przyżyciowych;
" nauka metody posiewu redukcyjnego.
Przygotowane preparaty można oglądać bezpośrednio
pod mikroskopem lub dodatkowo je wybarwić. Celem
barwienia jest ułatwienie:
" obserwacji cech morfologicznych i diagnostycznych
(m.in. kształt, wielkość, wzajemny układ komórek w hodowli,
tzn. występowanie komórek pojedynczo lub w różnych
układach, obecność otoczek, zdolność ruchu, ilość
i rozmieszczenie rzęsek/wici, sposób rozmnażania się 
przez podział, tworzenie pączków, zarodników i form
przetrwalnych),
" liczenia drobnoustrojów (żywych, martwych).
Barwienie drobnoustrojów jest procesem
fizykochemicznym, który polega na wniknięciu barwnika
do wnętrza komórki i utworzeniu barwnego kompleksu
z cytoplazmą.
W zależności od sposobu barwienia wyróżniamy
barwienia przyżyciowe i barwienie preparatów
utrwalonych.
Przygotowanie preparatów
przyżyciowych
Preparaty przyżyciowe służą do obserwacji ruchliwości,
żywotności, sposobu rozmnażania, a czasami do
wykrywania substancji zapasowych. Najczęściej prowadzi
się obserwacje drożdży i pleśni ze względu na ich budowę
i rozmiar. Obserwacja bakterii, ze względu na małe
rozmiary, ogranicza się jedynie do oceny ich ruchliwości.
Preparaty przyżyciowe wykonuje się na szkiełku
podstawowym (w kropli spłaszczonej), a w przypadku
badania ruchliwości bakterii lub prowadzenia obserwacji
nad sposobem rozmnażania drożdży preparaty
wykonujemy na szkiełku z wgłębieniem zwanym komorą
Lindnera (w kropli wiszącej).
Wykonywanie preparatu w kropli
spłaszczonej
" Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym (wyjęte
z alkoholu, dokładnie wytarte i trzykrotnie przeciągnięte
nad płomieniem palnika) umieszcza się kroplę płynnej
hodowli drobnoustrojów i nakrywa szkiełkiem
nakrywkowym, opuszczając je ukośnie w celu
wyeliminowania pęcherzyków powietrza. Nadmiar płynu
osusza się bibułą filtracyjną. Przy sporządzaniu
preparatu z hodowli na podłożu stałym lub z produktów
o konsystencji mazistej należy nanieść na szkiełko
najpierw kroplę jałowej wody destylowanej, a następnie
pobrany za pomocą ezy materiał rozprowadzić w tej
kropli. Całość nakryć szkiełkiem nakrywkowym.
" Preparaty przyżyciowe należy oglądać bezpośrednio po
przygotowaniu, żeby nie dopuścić do przeschnięcia
materiału. Najlepszą jakość uzyskuje się przy
preparatach cienkich, blisko brzegu kropli.
Barwienie preparatów
przyżyciowych
Preparat przyżyciowy może być barwiony lub nie barwiony. Chcąc
wykonać barwienie obok kropli z materiałem badanym umieszcza
się kroplę barwnika, miesza ezą i przykrywa szkiełkiem
nakrywkowym. Stosowane barwniki nie mogą być toksyczne
i muszą się charakteryzować wysoką kontrastowością. Mimo że
używa się ich w bardzo dużym rozcieńczeniu i tak wywołują
zahamowanie rozmnażania.
" barwienie błękitem metylenowym pozwala ocenić żywotność
mikroorganizmów; barwnik przenika do wnętrza martwej
komórki, która barwi się na ciemnoniebiesko,
" barwienie płynem Lugola umożliwia wykrycie w komórce drożdży
substancji zapasowych  glikogenu, który barwi się na brunatno,
a cytoplazma komórki jasnożółto,
" barwienie bakterii płynem Lugola pozwala u gatunków
beztlenowych wykryć granulozę - cukier stanowiący substancję
zapasową tych bakterii.
Metoda posiewu redukcyjnego
kształt kolonii
kolisty nieregularny soczewkowaty nitkowaty rozgałęziony
brzeg kolonii
gładki falisty płatowaty nitkowaty z obwódką