Wybrane metody
biochemiczne
i serologiczne identyfikacji
bakterii chorobotwórczych
Podział drobnoustrojów ze względu na rodzaj ich interakcji
z organizmem ludzkim:
Øðdrobnoustroje komensalne
- kolonizują powierzchnię ciała nie wyrządzając szkody;
prawidłowa flora organizmu, np. E. coli
Øðdrobnoustroje patogenne
- działają szkodliwie na organizm gospodarza
> bezpośrednia inwazja i uszkodzenie tkanek, np. Shigella sp.
> produkty toksyczne, np. Clostridium
Øðdrobnoustroje oportunistyczne
- występują w środowisku i są składnikami flory organizmu
- nieszkodliwe dla osób zdrowych
- ciężkie schorzenia u chorych z obniżoną odpornością (zabiegi)
Øðdrobnoustroje wywoÅ‚ujÄ…ce choroby odzwierzÄ™ce
- choroby u kręgowców innych niż ludzie, ale można się nimi
zakazić na skutek kontaktu z zakażonymi zwierzętami lub
produktami pochodzenia zwierzęcego
Postulaty Kocha
stanowiÄ… do dziÅ›
kryterium uznania
danej bakterii
za czynnik
etiologiczny
(przyczynÄ™)
określonej choroby.
Serotyp - odmiana mikroorganizmu, którą można
określić za pomocą reakcji serologicznych, czyli
reakcji z użyciem przeciwciał lub dopełniacza.
Różnice pomiędzy serotypami zależą od
antygenów znajdujących się na powierzchni
komórek drobnoustroju. Często są to białka
o kluczowym znaczeniu dla patogenezy lub też
substancje odpowiedzialne za mniejszÄ… lub
większą wrażliwość mikroorganizmu na czynniki
odpornościowe. Dlatego określenie serotypu jest
często ważne w przypadku badań laboratoryjnych
służących wykryciu i identyfikacji patogenu.
Metody identyfikacji
mikroorganizmów
Podział metod identyfikacji mikroorganizmów:
a) biochemiczne
b) biofizyczne
c) biologii molekularnej
d) immunochemiczne
Metody biochemiczne
Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów
do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych
związków chemicznych
Øð cechy biochemiczne okreÅ›la siÄ™ na podstawie reakcji
chemicznych zachodzÄ…cych w odpowiednio skomponowanych
pożywkach wzrostowych
Øð wyniki testów biochemicznych odczytuje siÄ™ makroskopowo
- wzrost lub jego brak
- zmiana zabarwienia pożywki
- reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagujÄ…cego
.......z wytwarzanym metabolitem
- wytworzenie gazu
Test API 20 NE
" Przeznaczony jest do oznaczania jednego szczepu bakterii
" Składa się z 20 mikroprobówek zawierających bezwodne
podłoże
" Służą one do wykonania 8 testów konwencjonalnych i 12
asymilacyjmych
" Testami konwencjonalnymi oznacza się zdolność do:
- wytwarzania oksydazy cytochromowej
- fermentacji glukozy
- rozkładu cukrów złożonych na podstawie stwierdzenia
zdolności
do zdolności do wytwarzania enzymu beta-galaktozydazy i
beta-glukozydazy
- rozkładu białek i aminokwasów na podstawie oznaczania
wytwarzanego indolu oraz enzymów: hydrolazy argininy,
proteazy i ureazy
- redukcja azotanów do azotynów oraz do azotu
czÄ…steczkowego
(denitryfikacja)
" Testami asymilacyjnymi oznaczana jest zdolność bakterii do
wykorzystywania jako z
ródła węgla: arabinozy, glukozy,
Interpretacja
wyników badań
właściwości
biochemicznych
bakterii za
pomocÄ… testu API
20 NE
Test API STAPH
" Przeznaczony jest do identyfikacji jednego szczepu bakterii
" Składa się z 20 mikroprobówek zawierających bezwodne podłoża
" Służą do wykonania 19 testów biochemicznych, za pomocą których
określana jest zdolność do:
- wykorzystania węglowodanów (cukrów prostych,
wielocukrów) i alkoholi
- redukcji azotanów do azotynów
- wytwarzania fosfatazy alkalicznej
- wytwarzania acetylometylokarbinolu (acetoina) z glukozy
- hydrolizy argininy i mocznika
Interpretacja
wyników
badań
właściwości
biochemicznyc
h bakterii za
pomocÄ… testu
API STAPH
Testy biochemiczne
Naniesienie
Zawieszenie
INKUBACJA
(18  48 h)
Interpretacja wyników w teście API (bioMerieux)
Test Colilert
" Do wykrywania bakterii z grupy coli w wodzie słodkiej i morskiej
(przy analizie sanitarnej wody)
" Oparty jest na technologii wskaz
nikowych substratów odżywczych
(DST)
" E. coli wykorzystujÄ… produkowany przez siebie enzym
Beta-glukuronidazÄ™ do przemian 4-metyl-umbeliferyl-beta-D-
glukuronidu, który jest wskaz
nikowym substratem odżywczym testu
" Badana próbka wykazuje fluorescencję, gdy obecne są bakterie E.
coli, w przypadku obecności innych bakterii z grupy coli utrzymuje
się barwa żółta, ale brak fluorescencji.
" Dwa rodzaje testu: jakościowy (obecne/nieobecne) i ilościowy
" Test jakościowy przeprowadza się w pojemnikach zawierających
100 ml badanej próbki wody, a test ilościowy na specjalnych
płytkach.
Testy serologiczne
" Polegają na łączeniu przeciwciał z antygenem
i wytrąceniu osadu lub blokowaniu aktywności
antygenu
" Główne rodzaje odczynów serologicznych:
 precypitacji (antygeny rozpuszczalne)
 aglutynacji (wykrywanie przeciwciał i antygenów)
 wiązania dopełniacza (blokowanie antygenów lub
liza komórek z udziałem dopełniacza)
 neutralizacja (zobojętnianie określonych właściwości
antygenu)
Odczyn precypitacji:
" reakcja przeciwciało/antygen - pod wpływem swoistego
przeciwciała łączącego się z cząsteczką antygenu powstają
kompleksy antygen-przeciwciało, które łącząc się
w większe agregaty wytrącają się z roztworu w postaci
precypitatu.
" Reakcja ta jest wysoce swoista, ale czułość jest mniejsza
niż np. reakcji aglutynacji.
" NajprostszÄ… metodÄ… precypitacji jest zmieszanie surowicy
i antygenu w probówce. W obecności swoistych
przeciwciał na dnie probówki obserwuje się
charakterystyczny osad.
Odczyn aglutynacji:
" reakcja przeciwciało/zawiesina antygenów - powstające
kompleksy antygen-przeciwciało łącząc się (zlepiając)
w większe agregaty powodują mętnienie pierwotnie
jednorodnej zawiesiny.
" Uzyskany wynik wyraża się w postaci miana, tzn.
największego rozcieńczenia przeciwciał powodującego
aglutynacjÄ™.
" Ma zastosowanie w diagnostyce m.in. salmonellozy,
listeriozy i mononukleozy oraz wykrywania rotawirusów
oraz czynnika reumatoidalnego.
Odczyn wiązania dopełniacza:
" Stosuje się najczęściej do wykrywania swoistych
przeciwciał.
" Dopełniacz ma zdolność wiązania immunokompleksów.
Wolny dopełniacz powoduje lizę krwinek czerwonych,
które jako antygen związały na swojej powierzchni
przeciwciała. Jeśli dopełniacz zostanie związany przez
immunokompleksy nie wystÄ…pi hemoliza.
" Stosowany jest w diagnostyce toksoplazmozy, cytomegalii,
odry, różyczki, brucelozy, zakażeń wirusem typu herpes,
duru brzusznego, durów rzekomych oraz zakażeń o
etiologii Mycoplasma.
Metody serologiczne
" Odczyn immunofluorescencji  przeciwciała znakowane
barwnikiem fluoryzującym, metoda pośrednia lub bezpośrednia 
wysoka czułość
" Metody radioimmunologiczne  przeciwciała znakowane izotopami
" ELISA  znakowanie przeciwciał enzymami, które następnie
reagujÄ… z substancjÄ… chemicznÄ… wytwarzajÄ…c barwnik, liczne
odmiany metody
" Immunobloting  elektroforeza białek i przeniesienie ich na błonę,
inkubacja w roztworze przeciwciał połączonych z peroksydazą,
która rozkłada barwnik  identyfikacja antygenów białkowych
i przeciwciał
TESTY LATEKSOWE
" Zasada działania testów oparta jest o reakcję aglutynacji
zachodzącej w układzie antygen-przeciwciało. Antygen
znajduje siÄ™ w badanym materiale klinicznym, zaÅ› drugim
elementem tego układu są monoklonalne przeciwciała
przeciwko określonemu antygenowi (np. otoczce)
opłaszczone na nośniku (cząsteczki lateksu).
" Dostępne na rynku testy lateksowe pozwalają nie tylko na
stwierdzenie obecności drobnoustrojów, ale także na ich
identyfikacjÄ™.
" Mimo iż testy lateksowe przyśpieszają i ukierunkowują
badanie mikrobiologiczne, nie zwalniajÄ… z wykonania
klasycznej diagnostyki metodÄ… hodowli.
TEST ELISA
" pozwala na jakościowe i ilościowe oznaczanie przeciwciał
(we wszystkich klasach) i antygenów w materiale
biologicznym
" oparty jest na zasadzie chromatografii powinowactwa -
znany czynnik (antygen lub immunoglobulinÄ™) absorbuje
się na stałym podłożu. Do powstałej w ten sposób fazy
stałej przyłącza się swoisty antygen lub przeciwciała (jeśli
są obecne w badanej próbce). Nie związany materiał
usuwa się przez płukanie. Po wypłukaniu zbędnego
materiału i dodaniu odpowiedniego dla enzymu substratu
oznacza się spektrofotometrycznie intensywność reakcji
barwnej, która jest odzwierciedleniem rozkładu substratu
przez enzym. Na tej podstawie wnioskuje się o zawartości
poszukiwanych czynników w badanym materiale
(antygenów lub przeciwciał).
Olbrzymia rola, wysoka czułość i swoistość testów
ELISA doprowadziła do wykonania testów
fabrycznych, wysoko zautomatyzowanych, a nawet
skomputeryzowanych.
Testy ELISA wykorzystuje siÄ™ w diagnostyce np.
toksoplazmozy, cytomegalii, różyczki, żółtaczki
zakaz
nej, Chlamydia, wirusów RSV, Rotawirusów
i Helicobacter pylori.
IMMUNOBLOTTING
" może być zastosowany do analizy antygenów białkowych,
a także do charakteryzowania przeciwciał
" wykorzystywany często do wykrywania swoistych
przeciwciał w surowicy chorych
" jest rozszerzeniem badań serologicznych, które wykazują
obecność swoistych antygenów różnych patogenów,
a także swoiste przeciwciała reagujące
z charakterystycznymi antygenami białkowymi tych
patogenów
" z dużym powodzeniem jest stosowany w diagnostyce
zakażeń wirusowych, bakteryjnych i zakażeń
pierwotniakami (np. wirusem cytomegalii, Helicobacter
pylori, Campylobacter, Clostridium, Escherichia coli,
Staphylococcus oraz Toxoplasma gondii)