Cezary Rojewski, Biotechnologia, gr. 4
Diagnostyka Molekularna
Temat: Diagnostyka molekularna zakażeń gronkowcowych  analiza wyników
Cel ćwiczenia: Analiza wyników badań wykonanych na poprzedzających ćwiczeniach
dotyczących diagnostyki molekularnej zakażeń gronkowcowych poprzez przeprowadzenie
elektroforez na żelach poliakrylamidowym i agarozowym.
RAPD to metoda losowej amplifikacji polimorficznych fragmentów DNA, którą wykorzystuje
się często do analizy podobieństw szczepów drobnoustrojów. Używamy tu jednego,
krótkiego, losowego startera. W naszym przypadku, przeprowadzaliśmy analizę pod kątem
genu agr  gen regulacji czynników wirulencji. Umożliwiło nam to różnicowanie szczepów
Staphylococcus aureus.
Metodyka: Pierwsza część zajęć polegała na przygotowaniu żelu 8% poliakrylamidowego do
przeprowadzenia elektroforezy TBE PAGE. Do produktów PCR dodaliśmy bufor obciążający,
przygotowaliśmy żel zgodnie z instrukcją z zajęć oraz złożyliśmy aparaturę. Żel barwiliśmy
Coomasie blue, który niespecyficznie wiąże białka i daje się łatwo odpłukać  barwi żel na
niebiesko. Drugi etap polegał na przeprowadzeniu elektroforez na 2% żelach agarozowych
aby przeanalizować produkty trawienia. Przeprowadziliśmy trawienie produktu PCR: w tym
celu do 2 probówek z 10ul produktu PCR każda dodaliśmy buforu Yellow/Tango i 2ul AluI do
pierwej oraz 2ul RsaI do drugiej probówki. Dopełniliśmy do 15ul jałową wodą. Po uprzednim
przygotowaniu żeli, do probówek dodaliśmy buforu obciążającego i przeprowadziliśmy
elektroforezÄ™.
Zdjęcie 1. Żele agarozowe: górny z enzymami AluI i RsaI oraz dolny, zwykły PCR
Enzymy restrykcyjne AluI i RsaI przeprowadzajÄ… ciÄ™cia najwydajniej w temp. 37°C w
obecności buforu Tango. AluI rozpoznaje miejsca AG^CT, pozostawiając tępe końce podczas
gdy RsaI rozpoznaje miejsca GT^AC. Uniwersalny bufor Yellow/Tango stosujemy aby
zapewnić optymalne warunki reakcji dla każdego enzymu restrykcyjnego.
Zdjęcie 2. Żel akrylamidowy. Obraz rozwiniętych produktów RAPD-PCR.
Wnioski: Na zdjęciu 1, (część górna) zauważalny jest brak widocznych fragmentów DNA.
Natomiast na drugim żelu (zdjęcie 1, część dolna) widzimy różnicę długości fragmentów dla
poszczególnych grup sekwencji. Dzięki technice multiplex PCR dowiedzieliśmy się, że
mieliśmy do czynienia z 3 grupami genu agr, a także, iż badane szczepy posiadają tylko
pojedynczy rodzaj genu agr.
Na zajęciach udało nam się rozróżnić szczepy gronkowców, jednak nie uzyskaliśmy
zadawalających wyników polimorfizmu genu agr. Amplifikując polimorficzny fragment genu,
który następnie trawimy, mamy możliwość różnicowania szczepów na podstawie analizy
długości uzyskanych produktów. Dzięki detekcji i analizie polimorfizmu genu agr możemy
określić grupę do jakiej należy dany gronkowiec. Wiedząc z jakim drobnoustrojem mamy do
czynienia możemy zwiększyć specyfikację naszych metod zwalczania przeciwnika.