115698

umożliwiająca bakteriom wykonanie kilku podziałów. Efektem tego ograniczonego wzrostu jest powstanie murawy utworzonej przez ledwo widoczne gołym okiem kolonie. Z powodu wyczerpania his ty dyny, dalej rosnąć mogą tylko komórki, w których zaszła rewer sja (mutanty his+). One właśnie utworzą wyraźnie widoczne, możliwe do policzenia kolonie. Im silniej mutagennie będzie działać badany związek, tym więcej wyrośnie kolonii rewertantów.

Aby właściwie ocenić mutagenność testowanej próbki, należy wykonać kontr olę, w której bakterie będą rosnąć w^r takich samych warunkach, ale bez kontaktu ze związkiem badanym. Wówczas niewielka liczba komórek również zostanie zmutowana, gdyż w środowisku zawrze działają różne, często nieudiwytne czynniki mutagenne (np. promienie UV. składniki podłoża i inne). \Vyw'ołają one tzw. mutacje spontaniczne, które również mogą przywrócić bakteriom zdolność do syntezy histydyny i umożliwić wzrost na podłożu testowym. Liczba kolonii rewertantów powstałych spontanicznie stanowi punkt odniesienia (tło), uwzględniany przy odczycie wyników testu. Przyjęto, że aby uznać badaną próbę za mutagenną (kancerogenną) liczba rewertantów na płytkach badanych powinna być przynajmniej dwukrotnie wyższa, niż na płytkach kontrolnych bez testowanego związku.

Aby zwiększyć wrażliwość na działanie mutagenów szczepy testowe mają uszkodzoną ścianę komórkową, co czyni ją bardziej przepuszczalną dla dużych cząsteczek takich jak np. batzo(a)pircn (nic przechodzi przez nonnalną ścianę). Ponadto, szczepy mają ograniczoną zdolność do naprawy uszkodzeń w DNA. co znacznie zwiększa icli czułość na działanie mutagenne. Jak wspomniano we wstępie, bakter ie (i inne organizmy) posiadają szereg systemów naprawy, które różnią się zdolnością do wiernego odtwarzania pierwotnej struktury. Szczepy używane w teście Amesa pozbawione są tego systemu reperacji, który działa bezbłędnie (naprawa przez wycinanie uszkodzonych fragmentów, wstawianie prawidłowych), natomiast mają uwydatniony system popełniający błędy (SOS).

Aby sprawdzić czy stosowane szczepy posiadają właściwą czułość, poddaje się je tzw. kontroli pozytywnej. Polega ona na badaniu wielkości rewersji spowodowanej przez mutageny o znanej sile działania. Takim mutagenem wykorzystywanym w ćwiczeniu będzie daunomycyna - antybiotyk przećiwnowotworowy produkowany przez promieniowce. Jest to mulagcn bezpośredni.

Wiele związków ujawnia swoje właściwości mutagenne (kancerogenne) dopiero po przekształceniu w organizmie, głównie w wątrobie. Aby stworzyć w teście warunki zbliżone do panujących w ustroju człowieka poddaje się badaną próbę aktywacji za pomocą frakcji enzymatycznej uzyskanej z wątroby szczura.

Test Amesa nadaje się do badań szerokiego spektrum związków, w tym również do badania prób środowiskowych, jak w^roda. gleba, powietrze, masa roślinna, mocz i inne Materiały pobrane ze środowiska, przed zbadaniem poddaje się ekstrakcji w odpowiednich rozpuszczalnikach bądź absorbuje na specjalnych żywicach Ekstrakty' lub eluenty odparowuje się, zalewa odpowiednim rozpuszczalnikiem i wprowadza do testu. Test tar jest stosunkowo mało czuły w'obec pestycydów i związków metali (z wyjątkiem Cr*⁶)

burym często stosowanym testem bakteryjnym jest test "rec-assay" (z ang. rccombination -rekombinacja, assay - próba). Metoda ta polega na badaniu zwiększonego działania letalnego (śmiertelnego) związków mutagennych na komórki mutantów bakter ii BaciUus subiilis. Mutanty te nie posiadają zdobiości do reperowania uszkodzeń w DNA za pomocą rekombinacji (rec-). w przeciwieństwie do szczepu dzikiego (rec+). Reperacja rekomhinacyjna jest jeszcze drugim (obok poznanych już: foloreaktywacji. reperacji przez wycinanie i SOS) metodą naprawy Komórki pozbawione jej mają jednocześnie osłabione pozostałe systenry naprawcze, dlatego nawet stosunkowo niewielkie uszkodzenia DNA mogą powodować u nich zahamowanie wzrostu. A więc. w przeciwieństwie do testu Amesa. w teście rec-assay badana substancja o właściwościach mutagennych nie powoduje mutacji w komórkach testowyclr. lecz degr adację DNA. która hamuje dalszy' wzrost (komórka nic potrafii naprawić uszkodzenia). Szczep dziki natomiast jest w stanie rosnąć, dopóki siła działania mutagenu nie przekroczy możliwości naprawczych komórek. Porównując długość linii wzrostu obu szczepów ocenia się właściwości mutagenne próbki. Test rec-assay jest czułym testem, szczególnie przydatnym do badania związków metali, na któr e test Amesa jest mniej wrażliwy.