97217

Wyznaczenie optymalnego stężenia preparatu enzymatycznego

Przygotowano dwa rozcieńczenia 50 i 100-krotne otrzymanego na poprzednich ćwiczeniach preparatu inwertazy. Do probówki z 3ml roztworu enzymu dodano 3 ml 0.2 M roztworu sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7. Natychmiast po wymieszaniu (próba odczynnikowa), a następnie po 5, 10,15 i 30min.pobierano po lml mieszaniny inkubacyjnej do probówek zawierających po 4 ml buforu glicynowego o pH 10 (w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej). Po wymieszaniu, z każdej z tych probówek przeniesiono do odpowiednio oznakowanych probówek zawierających lml świeżo przygotowanej mieszaniny odczynników Somogyi I i II. Probówki szczelnie zatkano i ogrzewano przez 15min. we wrzącej łaźni wodnej. Po ostudzeniu dodano po lml odczynnika Nelsona, wymieszano na mico-shakerze do ustania wydzielania się pęcherzyków gazu, dodano 2 ml wody destylowanej spłukując ścianki probówek.

Po dokładnym wymieszaniu odczytano absorbancję przy dł.fali 520nm wobec próby odczynnikowej. Rozcieńczenie:

1. 50-krotne		2.100-krotne
czas [min]	A$20	czas [min]	As20
5	0,343	5	0,328
10	1,04	10	0,608
15	1,218	15	0,756
30	1,56	30	1,080

Rozcieńczenia przygotowano, aby określić, które wcześniej przygotowane rozcieńczenie preparatu inwertazy będziemy stosować w następnych ćwiczeniach.

Odpowiednim rozcieńczeniem będzie 60-krotne rozcieńczenie inwertazy, ponieważ uzyskiwane wyniki wartości absorbancji powinny mieścić się w wiarygodnym zakresie krzywej kalibracyjnej.