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cependant un inconvenicnt, c est de ne pouvoir servir de vecteur qu'& des fragmcnts d'ADN de faible taille car seuls des vecteurs rclativement pctiis peuvent penetrer dans unc bactćrie par transformation. Par contro, en combinant certaines parties du genomc du pliage l_t indispensables k son encapsidation, avcc de TADN plasmi-dique portant les caractćres interessants de ces dcrniers, on peut construire des « cosmides » qui pourront s'encapsider dans la coque du pliage et par cet artifice etre injectćs dans une bactćrie rćceptrice. Ces cosmides peuvent transporter des segments d'ADN relativemcnt importants.

Unc deuxieme decouvcrte de la biologie molćculaire, chcz les bactćries, allait permettre dc couper 1'ADN en des points bien precis et de les ligaturer ulterieu-rement. Mesilson et Yuan avaient rcmarąuć en 1968 le comportement ćtrange des baeteriophages selon qu’ils infectaient des bactćries sensibles, de meme espece, mais de types dilTćrcnts. Par cxemple un virion phagique, s'ćtant developpe dans un £. coli de type B, mis au conlact de ce meme type de bactćries, va Pinfectcr ot 1/ADN viral s'exprimera k 100 % ; si ces memes virions sont mis en presence d’E. coli K (type diffćrent de B), ces virions vonl injecter leur ADN dans la bactćrie, mais celui-ci va etre detruit k un taux considerable puisque s’cxprimera seulement 1 ADN de phage pour 10³ k 10’¹ virions infectants. II a etć demontre qu’un type de bactćrie reconnait un ADN rćpliąue par lui, mais detruit systćmaiiquemcnt tout ADN repliquć dans un autre type ; cette destruction est le fait des endonucleases de restriction : ces enzymes reconnaisscnt certaines sequcnces nuclćotidiques tres precises, pour les enzymes du type II qui presentent le plus d^łinteret en manipu-lation gćnetique. L’exemple classiąue est Pcnzyme de restriction Eco R1 ; celui-ci reconnait la sequencc hexanucleotidique :

5' — GAATTC,—-3’

3’ — C T T A A G — 5'

t

et coupe cette sćquencc au niveau des fleches. Si un plasmide coniient cette sequence, il pourra etre linćarisć et posseder des extremites complćmentaires, ayant tendance a s'hybrider.

Si par un arlifice quelconque, on minimise la rccircularisation et que Ton ajoute au plasmide ouvert un ADN etranger coupe par la meme endonuclease, on obtient des ligatures au hasard cl parmi les segments ligatures, on pourra trouver des hybrides. Si Pon fail agir la ligase, on ferme les 4 liaisons phosphodiester. On aura eonstruit alors un nouvcau plasmide.

Actuellement, unc centainc d enzymes de restriction ayant des spćcificiles dilfe-rent es sont utilisees et permettent de faire des coupures et de ligaturer, au niveau de sites tres varies; beaucoup sont moins commodes k uliliser que Eco Rl, qui reconnait des structurcs palindromiqucs, donc fournit naturellcment des extrćmites cohesives, mais des techniques enzymatiqucs simples permettent de crćer de telles extrćmitćs.

La manipulation gćnćtique chez les bactćries va consister essentiellement k introduire in vilro un ADN etranger dans un vecteur (plasmide, phage, cosmide) puis le transferer dans une cellulc bactćricnnc. Son cxpression phenolypique, ou la simple prćsence des genes, va permettre de selcctionner les cellules ayant rcęu le fragment d’ADN recherchć, c’est le elonage des genes. Ensuite, on pourra recu-perer le vecteur portant TADN clone pour y travailler dc nouveau in vitro, puis le reintroduire dans une cellulc, etc...