2906542757

[19] PARAMETRY KINETYCZNE REAKCJI 137

im równania szybkości reakcji bardzo często mają postać złożoną. Scałko-waną postać równań szybkości reakcji dla szeregu wielosubstratowych, przebiegających wedle mechanizmów uporządkowanych reakcji enzymatycznych wyprowadzili Darvey i Wiliams (28, 29). Przeprowadzona przez nich komputerowa analiza danych uzyskanych z pomiarów przyrostu stężeń produktów reakcji pozwoliła ustalić czy krzywa przedstawiająca przebieg badanej reakcji odpowiada określonemu, reprezentującemu konkretny mechanizm równaniu szybkości, jak również wyznaczyć parametry kinetyczne reakcji. Wyznaczenie parametrów kinetycznych reakcji przebiegającej wedle mechanizmu typu Ping-Pong (aminotrans-feraza asparaginianowa) na podstawie analizy krzywej przebiegu reakcji metodą regresji nieliniowej opisane zostało ostatnio przez Duggleby i Mor-risona (30).

III. Uwagi końcowe

Wspomniano wcześniej, że stosując przedstawione w tej pracy metody w przypadku jednosubstratowej reakcji enzymatycznej, przebiegającej wedle mechanizmu przedstawionego na schemacie 1, wyznaczyć można wartości stałej Michaelisa oraz szybkości maksymalnej na podstawie jednego tylko eksperymentu. Można by zatem uznać, że metody wykorzystujące scałkowane równanie szybkości reakcji są bardziej efektywne, niż metody oparte na oznaczaniu szybkości początkowej. Wniosek taki jest jednak tylko częściowo słuszny. W badaniach kinetycznych chodzi nam o to, aby parametry kinetyczne badanej reakcji wyznaczyć możliwie najdokładniej.

Poszukujemy zatem metody precyzyjnej, dającej wyniki dokładne i powtarzalne. Z komputerowych analiz porównawczych przeprowadzonych przez Nimmo i Atkinsa (16) oraz z prac innych autorów (17, 18) wynika, że metody wyznaczania parametrów kinetycznych reakcji bazujące na scałkowanym równaniu szybkości reakcji są porównywalne z metodami opierającymi się na wyznaczaniu szybkości początkowych reakcji zarówno jeśli idzie o dokładność jak i powtarzalność otrzymywanych oznaczeń. Metoda iteracyjna Fernleya (14) daje w tym względzie szczególne dobre wyniki (16). W pewnych okolicznościach metody te mogą być jednak zawodne. Wartości parametrów kinetycznych wyliczone na podstawie danych uzyskanych z jednego tylko eksperymentu mogą być obciążone istotnymi nieraz błędami wynikającymi z nieuwzględnienia:

a)    utraty aktywności enzymu w trakcie przeprowadzania pomiaru jako skutku pojawiającej się denaturacji enzymu oraz

b)    hamowania aktywności enzymu przez nagromadzający się produkt reakcji.

Możliwość popełnienia błędu wynikająca z pojawiającej się w trakcie