3725451934

Wartości poniżej 40% mogą wskazywać na defekt metaboliczny lub obecność zakażenia przebiegającego z uszkodzeniem granulocytów.

Studenci oglądają preparaty i szukają formazano-dodatnich komórek.

* chemiluminescencia - zjawisko chemiluminescencji (Cl) polega na emisji fotonów przez nietrwałe wzbudzone cząsteczki, np. wolne rodniki tlenowe. Liczbę emitowanych fotonów można mierzyć przy użyciu chemiluminometru lub licznika scyntylacyjnego i wyraża się jako liczbę zliczeń przypadających na jednostkę czasu lub w postaci krzywych. Ponieważ naturalna Cl jest mało wydajna, celem jej wzmocnienia stosuje się tzw. luminofory (luminol, lucygenina, estry forbolu, opsonizowane bakterie...). Luminol odzwierciedla reakcje zależne od mieloperoksydazy, lucygenina - poziom aniomu ponadtlenkowego. Studenci oglądają wykresy chemiluminiscencji makrofagów otrzewnowych. Wykresy są zależne od odpowiednich proporcji komórek fagocytujących, luminolu,substancji aktywujących.

Krzywe CL układają się indywidualnie u poszczególnych chorych i nie zawsze korelują z innymi testami., np. NBT, fagocytarnymi czy killing. Poszczególne testy badają nieco odmienne mechanizmy. Dla pełnej oceny wydolności układu fagocytarnego powinno się wykonać kilka testów równolegle a interpretacja powinna być ściśle powiązana z danymi klinicznymi pacjenta.

Uwaga!!! Brak jest ścisłych norm dla większości testów. Laboratoria winny dysponować własnymi normami opracowanymi dla poszczególnych grup wiekowych.

3. Swoista odpowiedź immunologiczna - komórkowa

Komórki biorące udział w odpowiedzi immunologicznej tzw. komórki immunologicznie kompetentne najczęściej uzyskuje się z krwi obwodowej, rzadziej z płynów ustrojowych i tkanek litych (migdałki, węzły). Krew wciąż zasilana jest komórkami pochodzącymi ze szpiku i stanowi drogę stałej migracji komórek pomiędzy narządami limfatycznymi. Należy jednak pamiętać, że układ odpornościowy reaguje kompleksowo, posiada szereg mechanizmów regulujących i miarodajna ocena komórek wymaga zarówno badania składu ilościowego jak i poszczególnych funkcji.

Wstępnym badaniem komórek układu immunologicznego jest określenie liczby krwinek białych w 1 mm³ (leukocytoza) i ocena wzoru Schillinga - odsetkowy skład krwinek białych (limfocyty, monocyty, neutrofile, eozynofile, bazofile, ewentualnie inne)

Metody izolacji komórek

Najczęściej pobiera się krew z żyły łokciowej na antykoagulanty: heparyna (20-50 IU/ml krwi), 3,8% cytrynian sodu, 4mM wersenian sodu (EDTA), rzadziej na perełki szklane (krew odwłókniona).

*    metoda spontanicznej sedymentacji - najprostsza, wykorzystuje zróżnicowaną szybkość opadania różnych krwinek, 1 - 2 godz. 37°C. Opadanie można przyspieszyć dodając roztwór dekstranu czy 3% żelatyny lub poprzez wirowanie na niewielkich obrotach. Uzyskujemy: w osadzie krwinki czerwone, w supernatancie (nadsączu) krwinki białe, które można dalej izolować celem uzyskania czystych populacji, np. limfocytów, granulocytów, eozynofili. ..

*    metoda izolacji w gradientach gęstości - wykorzystuje różnice w wielkości i ciężarze właściwym poszczególnych komórek. Stosuje się mieszaniny rozdzielające: Ficoll (Percoll) - Isopaąue (Uropolina) -[metoda Boyum,a], Limfoprep, Gradisol (mieszanina Uropoliny i dekstranu) o różnej gęstości.

Krew z antykoagulantem nawarstwia się na warstwę gradientu w probówce plastikowej. Probówkę wiruje w temp. pokojowej, 400xg, 20 min. i zbiera w interfazie komórki. W wielostopniowym, odpowiednio przyrządzonym gradiencie można izolować różne populacje komórek, np. limfocyty T i B, granulocyty, eozynofile, monocyty, NK.

Studenci nawarstwiają bardzo delikatnie po 2 ml krwi pobranej na EDTA na Gradisol G (2 probówki), oglądają sedymentacją spontaniczną a z drugiej po odwirowaniu i próbują zebrać krwinki białe z interfazy. *metoda adherencii - służy do izolacji komórek adherujących do szkła: monocyty, granulocyty.

Niezależnie od metody izolacji zawsze należy sprawdzić żywotność komórek w mikroskopie (wykorzystuje się przepuszczalność błony komórkowej po dodaniu np. 0,1% błękitu trypanu - martwe komórki są niebieskie), czystość frakcji (np. metoda Giemsy) oraz wielkość odzysku komórek (liczy się komórki w komorze - w stosunku do zawiesiny wyjściowej).

Oznaczanie markerów powierzchniowych

Celem zróżnicowania komórek immunologicznie kompetetnych (rodzaj, odsetek) izolowanych z krwi obwodowej (najczęściej dotyczy to limfocytów) określa się za pomocą przeciwciał monoklonalnych obecne na komórkach antygeny różnicowania - CD (cluster of differentiation). Należy jednak pamiętać, że ekspresja na błonie komórkowej markera nie zawsze odpowiada funkcji komórki. Dodatkowe markery mogą się ujawniać w czasie aktywacji komórki, dlatego ostrożnie należy interpretować uzyskane wyniki.