5783290850

przebieg liniowy, należy wskazać optymalny skład fazy ruchomej, do rozdzielania w warunkach elucji izokratycznej chlorofili, zawartych w materiale roślinnym;

• na podstawie otrzymanych chromatogramów należy wyznaczyć także podstawowe parametry opisujące układ chromatograficzny - selektywność (a), rozdzielczość rzeczywistą (Rs) i sprawność kolumny (H, N). Obliczenia wykonać dla substancji rozdzielonych do tego stopnia, że odpowiadające im piki są „nie-nałożone” powyżej ok. 25 % ich wysokości, (współczynnik rozdzielenia, retencję względną, rozdzielczość i sprawność kolumny wyznacza się z następujących zależności: a = k₂/k,

Rs2/1 = ( te - t_RI)/1.63 (Saa+S*,)

H= 2,54 Lc (S _w /1_R)²

(na podstawie szerokości „połówkowych” pików zmierzonych na podstawie chromatogramu);

H = (1/4 S) ² / L_r

(na podstawie pomiaru szerokości strefy barwnej substancji w warstwie wypełnienia kolumny;

N = Lc / H

gdzie: cyfry 1 i 2 odnoszą się do kolejnych pików chromatograficznych, odpowiednio: następnego i poprzedniego; S _w to szerokość piku w połowie wysokości, zmierzona na podstawie chromatogramu; 1 _R -to odległość maksimum piku od „startu” zmierzona na podstawie chromatogramu; S-to szerokość strefy barwnej substancji zmierzona w kolumnie; L_R - to odległość środka barwnej strefy od początku warstwy wypełnienia kolumny.

Rozdzielczość (Rs) uzależnia stopień rozdzielenia substancji w kolumnie w warunkach braku przekroczenia zakresu liniowości izoterm sorpcji, od sprawności i selektywności układu chromatograficznego oraz od retencji substancji, i jest wyrażona następującym równaniem otrzymanym na drodze rozumowania teoretycznego :

_ -Jn a-l k₂ ^s    a~ 1 + k₂

Sprawność układu chromatograficznego jest wyrażona liczbą półek teoretycznych (N), bądź tzw. wartością wysokości równoważnej półce teoretycznej (H). W praktyce, gdy rozkład stężenia w zakresie piku chromatograficznego jest opisany równaniem Gaussa, liczbę półek teoretycznych można łatwo obliczyć na podstawie chromatogramu, korzystając z podanych wyżej zależności.

Przykład 2 Rozdzielanie mieszaniny chlorofili i karotenoidów z zastosowaniem bezpompowego aparatu chromatograficznego.

Układ faz normalnych zostanie zastosowany do rozdzielania ekstraktu acetonowego z trawy (mieszanina chlorofili) z zastosowaniem nieorganicznej fazy stacjonarnej (faza stacjonarna: żel krzemionkowy, kolumna szklana; faz ruchoma - heksan: MTBE:THF=60:18:22 v/v). Kolumna zasilana jest za pośrednictwem ciśnienia sprężonego gazu obojętnego (N2). Rozdzielanie chlorofili prowadzić przy 3 różnych natężeniach przepływu eluentu. Sporządzić wykres zależności funkcyjnych: H = f(u), gdzie H - wysokość równoważna półce teoretycznej, u - liniowa prędkość przepływu fazy ruchomej [mm/sek.]

Przykład 3

Rozdzielanie, detekcja i identyfikacja wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych z zastosowaniem RP-HPLC/UV-VIS DAD

Układ faz odwróconych (RP), to taki układ, w którym faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma. W odwróconym układzie faz stosuje się najczęściej związane fazy stacjonarne typu, Cl8, C8, „Phenyl”, C4, CN, otrzymane na bazie żelu krzemionkowego, albo A1203, Ti02, Zr02, SDB (styren - di-vinylo-benzen). Bardzo rzadko, inne „nośniki”. Fazami ruchomymi są, natomiast, mieszaniny wody i rozpuszczalników organicznych (tzw. modyfikatorów) mieszających się dobrze z wodą. Najczęściej stosowane rozpuszczalniki organiczne (modyfikatory), to acetonitryl, metanol, izopropanol, etanol, tetrahydrofuran, albo dioksan. Wykorzystuje się też często dodatek kwasu (zwłaszcza kwasu trójfluorooctowego (TFA), albo zasady (zwłaszcza trietyloaminy (TEA) do eluentu na poziomie zawartości poniżej 0,1 % m/m, w celu „cofnięcia” dysocjacji elektrolitycznej substancji rozdzielanych i zwiększenia stopnia hydrofobowych oddziaływań. Uwaga! W przypadku sorbentów otrzymanych na bazie żelu krzemionkowego nie można przekraczać zakresu wartości pH eluentu od 2,0 do 8,0 ! Duże znaczenie ma też dodawanie do eluentu milimolowych zawartości substancji tworzących tzw. pary jonowe z jonami substancji rozdzielanych (chlorowodorki zasad tetraalkiloamoniowych, albo kwasy alkilosulfonowe, bądź ich sole sodowe, lub litowe).

7