IMMUNODIAGNOSTYKA
ANALITYKA MEDYCZNA, rok II
ĆWICZENIA LABORATORYJNE
dr Magdalena Frydrychowicz
dr Mariusz Kaczmarek
dr Husam Samara
POZNAC
2013
Ćwiczenie 1
Ocena jakościowa reakcji antygen - przeciwciało.
Zagadnienia:
antygeny, hapteny, antygenowość, immunogenność, epitop, powinowactwo, awidność,
przeciwciała, monoklonalność, poliklonalność, monowalentność, poliwalentność,
precypitacja, krzywa precypitacji, obszar ekwiwalentny, warunki reakcji precypitacji,
metody oparte o zjawisko precypitacji, immunoelektroforezy, immunofiksacja, złożone
techniki serologiczne, immunoblotting, doting, testy immunochromatograficzne,
immunoprecypitacja, aglutynacja, warunki reakcji aglutynacji, metody oparte o
zjawisko aglutynacji
1. Metody oparte o zjawisko precypitacji:
-ð podwójna dyfuzja w agarze (PDA) - metoda Ouchterlony ego, immunodyfuzja.
Do wyciętych w żelu agarozowym studzienek nanosi się badane surowice i roztwory
przeciwciał, które dyfundują w nośniku. W miejscu spotkania obu składników
badanego układu tworzą się łuki precypitacyjne.
W trakcie ćwiczeń studenci wykonują preparaty PDA i oceniają precypitaty powstałe
podczas reakcji kompleksów immunologicznych z odpowiednimi przeciwciałami.
-ð immunoelektroforeza prosta (IM-EL)  metoda umożliwia ocenÄ™ biaÅ‚ek zawartych
w surowicy, Å‚Ä…czy elektroforezÄ™ i immunodyfuzjÄ™.
W pierwszym etapie mieszaninę białek zawartą w surowicy, umieszczoną w żelu
agarozowym rozdziela się przy pomocy prądu elektrycznego. Następnie wycina się w
żelu równoległy do kierunku migracji białek rowek, który wypełnia się
odpowiednimi przeciwciałami. Dyfundujące w żelu składniki układu (badane białka i
przeciwciała) tworzą łuki precypitacyjne o charakterystycznym kształcie i wielkości.
W trakcie ćwiczeń studenci wykonują poszczególne etapy immunoelektroforezy oraz
oceniają powstałe precypitaty.
2. Złożone techniki serologiczne:
-ð immunoblotting
Poszukiwane przeciwciała zawarte w badanych surowicach wykrywane są przy
pomocy immobilizowanych w nitrocelulozie białek antygenu. W skład systemu
detekcyjnego wchodzi także antyglobulinowy koniugat wyznakowany enzymem
(np. peroksydaza chrzanowa lub alkaliczna fosfataza). Dodanie substratu dla
odpowiedniego enzymu powoduje powstanie nierozpuszczalnego w wodzie produktu
widocznego, jako barwny prążek na nitrocelulozie.
W trakcie ćwiczeń studenci wykonują test western-blott przy pomocy,
którego oznaczają przeciwciała przeciw antygenom jądrowym i cytoplazmatycznym
przy pomocy testu paskowego ANA profile 3 EUROLINE firmy EUROIMMUN.
2
Preparatyka:
I. Podwójna dyfuzja w agarze (PDA)
1. Sprzęt i odczynniki:
-ð wypoziomowany stolik
-ð odtÅ‚uszczone w alkoholu pÅ‚ytki szklane 6 ´ð 9 cm lub szkieÅ‚ka podstawowe
-ð metalowa sztanca do PDA
-ð pipeta szklana 10  25 ml
-ð mikropipeta regulowana 10  200 mðl
-ð 1 % agar lub agaroza w soli zbuforowanej pH 7,6 (PBS)
-ð Å‚az
nia wodna lub kuchenka mikrofalowa
-ð wilgotna komora
-ð próbki badanych antygenów i odpowiednie surowice odpornoÅ›ciowe (zwierzÄ™ce)
2. Materiał badany:
surowica pacjenta lub inny roztwór biaÅ‚ka do analizy (min. ilość 50 mðl, opt. ~ 1 ml)
3. Zasada metody:
Podczas 24 h inkubacji w komorze wilgotnej dochodzi do swobodnej dyfuzji białek
próbki badanej i zastosowanych do identyfikacji przeciwciał zwierzęcych. W miejscu
zetknięcia się obu składników układu dochodzi do powstania kompleksów
immunologicznych, a następnie (w strefie ekwiwalencji, tzn. równowagi stężeń
Ag-Ab) wytrącenia się precypitatu, który można analizować wizualnie
4. Wykonanie
-ð gorÄ…cy agar wylać przy pomocy ogrzanej pipety na pÅ‚ytkÄ™ szklanÄ… do uzyskania
warstwy grubości ok. 1 mm,
-ð po zastygniÄ™ciu wyciąć studzienki w żelu przy pomocy sztancy,
-ð napeÅ‚nić przeciwstawne studzienki roztworami antygenu i odpowiednio dobranych
surowic odpornościowych lub seryjnymi rozcieńczeniami tej samej surowicy
odpornościowej,
-ð umieÅ›cić pÅ‚ytkÄ™ w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej na 24 lub 48 h.
5. Ocena i interpretacja wyników:
PDA jest techniką jakościową; powstanie łuku precypitacyjnego świadczy o obecności
poszukiwanego białka w próbce badanej; stosując podwójne rozcieńczenia
analizowanej surowicy odpornościowej można określić jej miano (tzn. największe
rozcieńczenie, przy którym powstaje widoczny w żelu precypitat).
3
II. Immunoelektroforeza prosta (IM-EL)
1. Sprzęt i odczynniki:
-ð wypoziomowany stolik
-ð odtÅ‚uszczone w alkoholu pÅ‚ytki szklane 6 ´ð 9 cm lub szkieÅ‚ka podstawowe
-ð metalowa sztanca do IM-EL
-ð pipeta szklana 10  25 ml
-ð mikropipeta regulowana 10  200 mðl
-ð 1 % agaroza w buforze weronalowym 0,01M pH 8,6
-ð Å‚az
nia wodna lub kuchenka mikrofalowa
-ð aparat do elektroforezy
-ð zasilacz
-ð wilgotna komora
-ð wzorcowa surowica ludzka
-ð królicze przeciwciaÅ‚a przeciw ludzkim Ig GAM
2. Materiał badany:
-ð surowica ludzka (min. ilość 50 mðl, opt. ~ 1 ml)
3. Zasada metody:
etap I  elektroforeza: rozdział białek badanej surowicy w polu elektrycznym,
etap II  24 h inkubacja: białka surowicy badanej i dodane po elektroforezie
przeciwciała zwierzęce tworzą w pierwszej fazie kompleksy Ag-Ab, a następnie w
strefie ekwiwalencji, prążki precypitatu.
4. Wykonanie:
przygotować bufor weronalowy: weronal (184 g) + weronal sodu (10,3 g)
rozpuścić w wodzie, doprowadzić pH do 8,6, uzupełnić do 1L objętości.
-ð gorÄ…cy agar wylać na pÅ‚ytkÄ™ szklanÄ… do uzyskania warstwy ~ 1 mm
-ð po zastygniÄ™ciu wyciąć studzienki w żelu i napeÅ‚nić je próbkami badanych surowic
(nierozcieńczonych); do jednej ze studzienek podać wzorcową surowicę ludzką;
-ð umieÅ›cić pÅ‚ytkÄ™ w aparacie do elektroforezy, poÅ‚Ä…czyć żel na pÅ‚ytce z buforem w
zbiornikach aparatu przy pomocy  kluczy z bibuły Whatman 3,
-ð przeprowadzić elektroforezÄ™ w warunkach: 120 V; 0,1 A; 80 min; przewidywana
wędrówka immunoglobulin w kierunku elektrody ( )
-ð po wyÅ‚Ä…czeniu z prÄ…du pÅ‚ytkÄ™ wyjąć z aparatu, wyciąć rowki równolegÅ‚e do
przewidywanego rozdziału białek, usunąć z nich żel,
-ð wypeÅ‚nić rowki odpowiednio dobranymi surowicami zwierzÄ™cymi (po 50 mðl),
-ð umieÅ›cić pÅ‚ytkÄ™ w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.
4
5. Ocena i interpretacja wyników:
-ð tworzÄ…ce siÄ™ w żelu Å‚uki precypitacyjne oceniamy wizualnie po 24 h inkubacji
odnosząc długość, grubość i kształt poszczególnych linii do linii uzyskanych z
ludzką surowicą wzorcową; ocena ma charakter jakościowy
-ð poziom danej immunoglobuliny uważa siÄ™ za prawidÅ‚owy ( norma ) jeÅ›li uzyskany
w trakcie testu łuk precypitacyjny nie różni się zasadniczo od uzyskanego w tym
samym teście łuku dla surowicy wzorcowej. W przeciwnym przypadku poziom
ocenianej immunoglobuliny podaje się jako obniżony lub podwyższony ( wzrost ,
 spadek ). Białko monoklonalne uważa się za obecne jeśli wyraz
nemu wzrostowi
poziomu jednego z łańcuchów lekkich immunoglobulin towarzyszy istotny spadek
poziomu drugiego łańcucha lekkiego (odpowiednio kappa lub lambda) i temu
obrazowi towarzyszy wyraz
na dysproporcja w poziomach łańcuchów ciężkich
immunoglobulin (istotny wzrost poziomu jednej klasy immunoglobuliny przy
jednoczesnym spadku poziomu pozostałych).
III. Immunoblotting
1. Sprzęt i odczynniki:
-ð pipety nastawne 1  1000 mðl
-ð probówki 1,5 ml
-ð zestaw ANA Profile 3 EUROLINE firmy EUROIMMUN
2. Materiał badany:
-ð surowica ludzka (min. ilość 50 mðl, opt. ~ 1 ml)
3. Zasada metody:
Opakowanie zawiera paski testowe z naniesionymi w postaci linii
scharakteryzowanymi biochemicznie antygenami. Każdy pasek pozwala na wykrycie
in vitro 14 różnych antygenów: nRNP, Sm, SS-A (SS-A natywne i Ro 52), SS-B, Scl-
70, Jo-1, CENP B, PCNA, dsDNA, nukleosomy, histony, rybosomalne białko P oraz
AMA-M2 w surowicy lub plazmie. W pierwszym etapie paski membrany inkubuje siÄ™
z rozcieńczonymi surowicami pacjentów. W pozytywnych przypadkach przeciwciała
klasy IgG (a także IgA i IgM) wiążą się podczas drugiego etapu inkubacji z
przeciwciałami przeciwko ludzkiej IgG znakowanymi enzymem (koniugat
enzymatyczny), który następnie katalizuje reakcję barwną.
4. Wykonanie:
1. Przeznaczone do badania próbki surowicy oraz kontrolę dodatnią należy
rozcieÅ„czać w stosunku 1:101 w buforze do próbek (np. 15 mðl surowicy + 1,5 ml
buforu do próbek);
2. Bufor do próbek jest gotowy do użycia;
3. Koniugat enzymatyczny należy rozcieńczyć w stosunku 1:10
(np. 150 mðl + 1,35 ml buforu do próbek);
4. Bufor do płukania należy rozcieńczyć wodą destylowaną w stosunku 1:10
(1 ml buforu do płukania + 9 ml wody/pasek).
5
-ð Preinkubacja: paski należy umieÅ›cić w rynienkach inkubacyjnych tak aby numer
paska był widoczny. Inkubować 5 min w 1,5 ml buforu do próbek, a następnie
usunąć bufor z rynienek.
-ð Inkubacja z surowicÄ…: do rynienek naÅ‚ożyć po 1,5 ml rozcieÅ„czonych surowic
pacjentów. Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej (+ 18 - 25°ðC)
z ostrożnym mieszaniem (kołyska laboratoryjna).
-ð PÅ‚ukanie: opróżnić rynienki reakcyjne i trzykrotnie pÅ‚ukać, za każdym razem
używajÄ…c 1,5 ml buforu pÅ‚uczÄ…cego (3 ´ð 5 min, koÅ‚yska laboratoryjna).
-ð Inkubacja z koniugatem: naÅ‚ożyć do każdej rynienki reakcyjnej po 1,5 ml roztworu
koniugatu enzymatycznego (znakowana alkalicznÄ… fosfatazÄ… kozia Ig anty-ludzka
IgG). Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
-ð PÅ‚ukanie: opróżnić rynienki inkubacyjne. PÅ‚ukać jak wyżej.
-ð Inkubacja z substratem: naÅ‚ożyć do każdej rynienki inkubacyjnej po 1,5 ml
roztworu substratu/chromogenu (NBT/BCIP). Inkubować 10 min w temperaturze
pokojowej na kołysce laboratoryjnej.
-ð Przerwanie reakcji: opróżnić rynienki i trzykrotnie pÅ‚ukać wodÄ… destylowanÄ…
(3 ´ð 1 min, koÅ‚yska laboratoryjna).
-ð Pomiar: Paski należy umieÅ›cić na arkuszu protokoÅ‚u oceny testu i wysuszyć.
Arkusz zeskanować i dokonać oceny półilościowej testu przy pomocy programu
EUROLineScan firmy EUROIMMUN.
5. Ocena i interpretacja wyników:
Zależnie od intensywności wybarwienia prążka wynik dla poszczególnych antygenów
podaje się jako negatywny, słabo dodatni, dodatni, silnie dodatni.
6
Ćwiczenie 2
Ocena ilościowa reakcji antygen-przeciwciało.
Zagadnienia:
elektroforeza rakietkowa, immunodyfuzja wg Mancini, turbidymetria, nefelometria,
metody wykorzystujące odczynniki znakowane, RIA, ELISA, wiarygodność
metody diagnostycznej, przykłady zastosowania testów diagnostycznych
Metody oceny ilościowej:
-ð odczyn immunoenzymatyczny ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)
W metodzie ELISA studzienki reakcyjne mikropłytek (faza stała) opłaszczone są
antygenem. W pierwszym etapie przeciwciała obecne w badanych surowicach łączą
się z zaadsorbowanym antygenem. W drugim etapie do układu dodaje się
wyznakowanego enzymem koniugatu antyglobulinowego. Następnie dodawany jest
substrat dla enzymu, który w reakcji z enzymem daje barwny produkt. Przy użyciu
odpowiedniego czytnika można mierzyć różnice w zabarwieniu reakcji w zależności
od stężenia poszukiwanej substancji.
W trakcie ćwiczeń studenci oznaczają metodą ELISA poziom autoprzeciwciał
w klasie IgG przeciw antygenowi dsDNA.
Preparatyka:
Odczyn immunoenzymatyczny ELISA
1. Sprzęt i odczynniki:
-ð pipety nastawne 1  1000 mðl
-ð probówki 1,5 ml
-ð statyw do probówek
-ð zestaw ELISA Anty-dsDNA (IgG) firmy EUROIMMUN
2. Materiał badany:
-ð surowica ludzka (min. ilość 50 mðl, opt. ~ 1 ml)
3. Zasada metody:
Opakowanie zawiera mikropłytkę ze studzienkami reakcyjnymi opłaszczonymi
antygenem. W pierwszym etapie studzienki reakcyjne inkubuje się z rozcieńczonymi
surowicami pacjentów. W pozytywnych przypadkach przeciwciała klasy IgG wiążą się
z obecnymi na powierzchni studzienki antygenami. Związane przeciwciała wykrywa
się podczas drugiego etapu inkubacji z przeciwciałami skierowanymi przeciwko
ludzkiej IgG znakowanymi enzymem (koniugat enzymatyczny), który następnie
katalizuje reakcjÄ™ barwnÄ….
7
4. Wykonanie
-ð Przeznaczone do badania próbki surowicy należy rozcieÅ„czyć w stosunku 1:101
w buforze do próbek (np. 10 mðl surowicy + 1 ml buforu do próbek). Bufor do
próbek, koniugat enzymatyczny, kalibratory i kontrole gotowe są do użycia. Bufor
do płukania należy rozcieńczyć destylowaną wodą w stosunku 1:10 (np. 5 ml
buforu do płukania + 45 ml wody).
-ð Inkubacja próbek surowicy: zgodnie ze schematem naÅ‚ożyć do studzienek
reakcyjnych po 100 mðl surowicy kalibracyjnej, pozytywnej i negatywnej surowicy
kontrolnej oraz rozcieńczone surowice pacjentów. Inkubować 30 min w
temperaturze pokojowej (+ 18  25°ðC).
-ð PÅ‚ukanie: opróżnić studzienki reakcyjne i trzykrotnie pÅ‚ukać (30  60 s),
za każdym razem używajÄ…c 300 mðl rozcieÅ„czonego buforu pÅ‚uczÄ…cego. Po każdym
płukaniu płytkę mikrotitracyjną należy odwrócić studzienkami w dół i silnie
wytrząsnąć nad papierem filtracyjnym, aby całkowicie usunąć resztki buforu
płuczącego.
-ð Inkubacja koniugatu: naÅ‚ożyć do każdej studzienki reakcyjnej po 100 mðl roztworu
koniugatu enzymatycznego (znakowana peroksydazą królicza Ig anty- ludzka IgG).
Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej.
-ð PÅ‚ukanie: opróżnić studzienki reakcyjne. PÅ‚ukać jak wyżej.
-ð Inkubacja substratu: naÅ‚ożyć do każdej studzienki reakcyjnej po 100 mðl roztworu
substratu/chromogenu. Inkubować 15 min w temperaturze pokojowej; chronić
przed światłem.
-ð Przerwanie reakcji: naÅ‚ożyć do każdej studzienki reakcyjnej, w tej samej kolejnoÅ›ci
i z tÄ… samÄ… szybkoÅ›ciÄ…, co przy pipetowaniu substratu, po 100 mðl roztworu
przerywajÄ…cego reakcjÄ™.
-ð Pomiar: fotometryczna ocena intensywnoÅ›ci barwy powinna być przeprowadzona
w ciÄ…gu 30 min. Od zastopowania reakcji, przy dÅ‚ugoÅ›ci fali lð = 450 nm i
referencyjnej długości fali > 620 nm.
5. Ocena i interpretacja wyników:
-ð OdwzorowujÄ…c w linearnym ukÅ‚adzie współrzÄ™dnych wartoÅ›ci ekstynkcji 3 surowic
kalibracyjnych i odpowiadające im względne jednostki (RU/ml), a następnie łącząc
naniesione punkty, wykreśla się krzywą wzorcową, z której można odczytać
stężenie przeciwciał w surowicy. Krzywą można wykreślić także za pomocą
programu komputerowego.
-ð Do akceptowania i dokumentowania wyników wykorzystuje siÄ™ program
komputerowy dostarczony przez firmÄ™ EUROIMMUN.
-ð Górna granica normy (cut-off) rekomendowana przez EUROIMMUN wynosi
20 jednostek relatywnych (R/ml). Rekomenduje się następującą interpretację
wyników:
< 16 RU/ml negatywny
16  22 RU/ml graniczny
> 22 RU/ml pozytywny
8
Ćwiczenie 3
Ocena immunofenotypu leukocytów krwi obwodowej.
Zagadnienia:
pojęcie immunofenotypu, cytofluorymetria przepływowa, cytometr przepływowy,
względna wielkość komórki, względna ziarnistość komórki, średnia intensywność
fluorescencji, zjawisko fluorescencji, markery różnicowania, immunofenotyp krwi
obwodowej
Ocena immunofenotypu:
-ð immunofluorescencja bezpoÅ›rednia  oznaczanie z peÅ‚nej krwi obwodowej
Określenie antygenów tzw. markerów różnicowania (ang. cluster of differentiation;
CD) przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, celem zróżnicowania komórek
immunologicznie kompetentnych.
W trakcie ćwiczeń studenci oznaczają metodą immunofluorescencji bezpośredniej
obecność antygenów różnicowania leukocytów krwi obwodowej i przeprowadzają
analizę immunofenotypową badanych próbek.
Preparatyka:
Immunofluorescencja bezpośrednia
1. Sprzęt i odczynniki:
-ð cytometr przepÅ‚ywowy
-ð zestaw regulowanych mikropipet 10  1000 mðl
-ð probówki cytometryczne
-ð statyw do probówek
-ð tryskawka do PBS
-ð zlewka
-ð 10 ´ð stężony bufor lizujÄ…cy
-ð roztwór PBS pH 7,4
-ð przeciwciaÅ‚a monoklonalne znakowane fluorochromem
-ð pÅ‚yn lizujÄ…cy
-ð woda destylowana
2. Materiał badany:
1. krew obwodowa pobrana do probówki z antykoagulantem EDTA (min. ilość
500 mðl)
9
3. Zasada metody:
Określenie przy pomocy cytofluorymetru przepływowego zespołu charakterystycznych
cech antygenowych komórki, które pozwalają zidentyfikować populacje komórek o
istotnym znaczeniu diagnostycznym.
4. Wykonanie
-ð Do probówek wprowadzić po 2 mðl odpowiednich przeciwciaÅ‚.
-ð NastÄ™pnie do każdej probówki dodać po 50 mðl dokÅ‚adnie wymieszanej krwi.
-ð Inkubować 15  20 min w temperaturze pokojowej chroniÄ…c przed Å›wiatÅ‚em.
-ð Do każdej probówki dodać po 500 mðl roztworu buforu lizujÄ…cego, rozcieÅ„czonego
wodą destylowaną 1 : 10 i dokładnie wymieszać.
-ð Inkubować 10 min w temperaturze pokojowej chroniÄ…c przed Å›wiatÅ‚em.
-ð Przerwać lizÄ™ dodajÄ…c do probówki ~2 ml PBS z tryskawki.
-ð Wirować probówki 5 min z prÄ™dkoÅ›ciÄ… 1500 obr./min.
-ð Usunąć supernatant.
-ð Ponownie do probówki dodać PBS i wirować jak wyżej.
-ð Usunąć supernatant i zawiesić osad w 150 mðl PBS, próbki gotowe do akwizycji.
5. Ocena i interpretacja wyników:
Ocenę wykonanych próbek przeprowadza się przy użyciu cytometru przepływowego
stosujÄ…c odpowiedni program komputerowy. W trakcie oceny immunofenotypowej
określa się odsetek komórek wykazujących fluorescencję danego fluorochromu.
10
Ćwiczenie 4
Ocena czynnościowa komórek układu odpornościowego.
Zagadnienia:
komórki immunologicznie czynne, komórki pomocnicze, metody izolacji komórek,
testy czynnościowe, reakcje nadwrażliwości, testy skórne, metody oceny funkcji
limfocytów, test transformacji blastycznej, metody oceny aktywacji komórek,
mitogeny, testy cytotoksyczne, metody oceny wydzielania cytokin, metody oceny
funkcji komórek żernych, ocena adhezji, ocena zdolności do chemotaksji, zaburzenia
chemotaksji, ocena zdolności do fagocytozy, indeks fagocytarny, zaburzenia
fagocytozy, ocena zdolności do zabijania wewnątrzkomórkowego, wybuch tlenowy,
zaburzenia wybuchu tlenowego, zaburzenia zabijania wewnątrzkomórkowego
1. Izolacja komórek na gradiencie i oznaczanie żywotności komórek.
-ð metoda izolacji w gradientach gÄ™stoÅ›ci
Wykorzystuje różnice w wielkości i ciężarze właściwym poszczególnych komórek.
Stosuje siÄ™ mieszaniny rozdzielajÄ…ce: Ficoll (Percoll)  Isopaque (Uropolina) 
[metoda Boyum a], Gradisol (mieszanina Uropoliny i dekstranu) o różnej gęstości.
Krew pobranÄ… na antykoagulant i wymieszanÄ… z PBS nawarstwia siÄ™ na odpowiedni
gradient i wiruje. Po wirowaniu komórki zbiera się powstałej interfazy.
-ð ocena żywotnoÅ›ci izolowanych komórek
W celu oceny żywotności komórek wykorzystuje się np. roztwór błękitu trypanu.
Dodanie tego barwnika pozwala ocenić przepuszczalność błony komórkowej.
W teście martwe komórki barwią się na niebiesko. Oceniane komórki liczy się na
kamerze pod mikroskopem świetlnym.
W trakcie ćwiczeń studenci przeprowadzają separację PBMC z krwi obwodowej oraz
oceniają ich żywotność.
2. Ocena cyklu komórkowego komórek ustalonej linii hodowlanej.
Do badanych komórek dodaje siÄ™ 100 mðl roztworu 0,1 % saponiny w celu ich
permabilizacji. Po inkubacji i wirowaniu do permabilizowanych komórek dodaje się
roztwór jodku propidyny. Wyznakowane jodkiem propidyny preparaty poddaje się
akwizycji przy pomocy cytometru przepływowego. W trakcie analizy ocenia się
poszczególne fazy cyklu komórkowego.
W trakcie ćwiczeń studenci przeprowadzają barwienie jodkiem propidyny komórek
ustalonej linii hodowlanej, a następnie obliczają odsetki komórek w poszczególnych
fazach cyklu komórkowego.
11
Preparatyka:
I. Izolacja jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) w gradiencie
gęstości
1. Sprzęt i odczynniki:
-ð probówki plastikowe 15 ml i 50 ml
-ð zestaw regulowanych mikropipet 10  1000 mðl
-ð Gradisol L (FICOLL o d = 1,077 g/cm3)
-ð Bufor PBS
2. Materiał badany:
2. krew obwodowa pobrana do probówki z antykoagulantem heparyną (min. ilość
500 mðl)
3. Zasada metody:
Na określoną objętość gradientu gęstości nawarstwia się rozcieńczoną PBS krew
obwodową. Po odwirowaniu zbiera się interfazę bogatą w komórki limfoidalne. Na
dnie probówki zbierają się erytrocyty i granulocyty, które przedostały się przez
warstwÄ™ Ficollu.
4. Wykonanie
-ð PobranÄ… na heparynÄ™ krew rozcieÅ„czyć w probówce 50 ml roztworem PBS
w stosunku 1 : 3.
-ð Do probówki 15 ml wprowadzić Gradisol L i krew zawieszonÄ… w PBS w stosunku
1 : 1 (3 : 1) tak aby zachować granicę faz.
-ð Wirować probówki w ciÄ…gu 20 min, w temperaturze 20°ðC, przy 2000 obr./min.
-ð Zebrać z interfazy pierÅ›cieÅ„ komórek jednojÄ…drzastych.
-ð PÅ‚ukać dwa razy w PBS. Wirować w temperaturze 4°ðC przy 200 g.
-ð Komórki zawiesić w PBS.
5. Ocena i interpretacja wyników:
Ocenę izolacji PBMC przeprowadza się pod mikroskopem świetlnym.
12
II. Liczenie komórek na hemacytometrze oraz określenie żywotności komórek
przy pomocy błękitu trypanu.
1. Sprzęt i odczynniki:
-ð hemacytometr (kamera do liczenia komórek, np. Burkera)
-ð zestaw regulowanych mikropipet 10  1000 mðl
-ð probówki plastikowe
-ð mikroskop Å›wietlny
-ð bÅ‚Ä™kit trypanu 0,05 %
2. Materiał badany:
-ð jednojÄ…drzaste komórki krwi obwodowej izolowane w gradiencie gÄ™stoÅ›ci
3. Zasada metody:
W wyniku barwienia błękitem trypanu komórki martwe wybarwiają się na niebiesko,
do wnętrza komórek żywych barwnik nie wnika.
4. Wykonanie
-ð Zmieszać 10 mðl zawiesiny komórek z 10 mðl 0,05 % bÅ‚Ä™kitu trypanu (stosunek 1 : 1).
-ð NaÅ‚ożyć 10 mðl mieszaniny komórek i bÅ‚Ä™kitu trypanu na hemacytometr pod
szkiełko nakrywkowe.
-ð UmieÅ›cić kamerÄ™ do liczenia komórek pod mikroskopem Å›wietlnym.
-ð Obliczyć ilość żywych (niewybarwionych) i martwych (niebieskich) komórek
zawartych na powierzchni 1 mm2. Powtórzyć liczenie dla 3  4 różnych pól i
obliczyć średnią liczbę komórek na 1 mm2.
-ð Po zakoÅ„czeniu liczenia wyczyÅ›cić kamerÄ™ i szkieÅ‚ko nakrywkowe wodÄ… oraz 70%
alkoholem, a następnie osuszyć.
5. Ocena i interpretacja wyników:
-ð Przeliczyć caÅ‚kowitÄ… liczbÄ™ żywych komórek wg wzoru:
# żywych komórek = Å›rednia # żywych komórek ´ð rozcieÅ„czenie ´ð 2 ´ð 1×ð105
(np. # komórek ´ð 10 ml ´ð 2 ´ð 10 000)
-ð Obliczyć % żywych komórek wg wzoru:
# policzonych żywych komórek
´ð 100 = % żywych komórek
# policzonych wszystkich komórek
13
III. Ocena cyklu komórkowego komórek ustalonej linii hodowlanej.
1. Sprzęt i odczynniki:
-ð cytometr przepÅ‚ywowy
-ð zestaw regulowanych mikropipet 10  1000 mðl
-ð probówki cytometryczne
-ð statyw do probówek
-ð tryskawka do PBS
-ð zlewka
-ð roztwór PBS pH 7,4
-ð 1 % roztwór saponiny w RPMI + 10 % surowicy FBS
-ð roztwór jodku propidyny 100 mðg/ml w PBS
2. Materiał badany:
-ð komórki ustalonej linii hodowlanej.
3. Zasada metody:
Jodek propidyny jest barwnikiem fluorescencyjnym, który barwi jądra komórkowe
badanych komórek interkalując z helisą DNA. Barwnik ten emituje czerwone światło
fluorescencji w zakresie możliwym do oceny przy pomocy cytometru przepływowego.
4. Wykonanie
-ð Do badanych komórek dodać 200 mðl 1 % roztworu saponiny.
-ð PróbkÄ™ inkubować 30 min w lodówce.
-ð Po tym czasie wirować próbkÄ™ 10 min przy prÄ™dkoÅ›ci 1500 obr./min
w temperaturze 4°ðC.
-ð Supernatant odrzucić, a uzyskany osad zawiesić w 150 mðl schÅ‚odzonego buforu
PBS zawierajÄ…cego 100 mðg/ml jodku propidyny.
-ð PróbÄ™ inkubować 30 min w temperaturze 4°ðC chroniÄ…c przed Å›wiatÅ‚em
(w lodówce).
-ð Po tym czasie próbÄ™ poddać akwizycji przy użyciu cytometru przepÅ‚ywowego.
5. Ocena i interpretacja wyników:
W trakcie przeprowadzanej analizy ocenia się średnią intensywność fluorescencji
(MFI) emitowaną przez jodek propidyny interkalujący z DNA badanych komórek.
Ocenę intensywności fluorescencji przeprowadza się przy pomocy histogramu.
14
Ćwiczenie 5
Metody immunomorfologiczne.
Zagadnienia:
sposoby detekcji reakcji antygen-przeciwciało, reakcje immunoenzymatyczne,
reakcja APAAP, reakcja ABC, reakcja LAB, reakcje z użyciem barwnika
fluorescencyjnego, immunofluorescencja wielokolorowa, mikroskopia konfokalna,
mikroskopia wielofotonowa, reakcje z użyciem metali ciężkich, mikroskopia
elektronowa, technologia ImageStream
Reakcje z użyciem barwnika fluorescencyjnego:
-ð zamrażanie materiaÅ‚u tkankowego
Szybkie zamrażanie zapobiega powstawaniu niszczących strukturę tkanki dużych
kryształów lodu.
-ð reakcja poÅ›redniej immunofluorescencji IMF
Wykrywanie autoprzeciwciał w surowicy w chorobach autoimmunologicznych.
W trakcie ćwiczeń studenci wykonują preparaty mikroskopowe na skrawkach
tkankowych z wÄ…troby szczura i oceniajÄ… je pod mikroskopem fluorescencyjnym.
I. Zamrażanie materiału tkankowego.
1. Sprzęt i odczynniki:
-ð termos z cienkoÅ›ciennym naczyÅ„kiem metalowym
-ð pÄ™seta
-ð worek foliowy
-ð mieszanina zamrażajÄ…ca (suchy lód + aceton)
-ð pÅ‚yn oziÄ™biajÄ…cy (eter naftowy)
-ð pÅ‚yn o dużej gÄ™stoÅ›ci zamrażany razem z tkankÄ… (tzw. Tissue-tek)
2. Materiał badany:
-ð blok tkankowy
3. Zasada metody:
Materiał tkankowy w trakcie rekcji immunomorfologicznych należy odpowiednio
zamrozić. Zamrażanie powinno odbywać się jak najkrótszym czasie, aby zapobiec
tworzeniu się w tkance kryształów lodu, które mogą uszkodzić fizycznie tkankę.
15
4. Wykonanie
-ð Zamrażany blok tkankowy zanurza siÄ™ w mieszaninie zamrażajÄ…cej przygotowanej
wcześniej w termosie
-ð Po kilku-kilkunastu sekundach nastÄ™puje wyraz
ne i trwałe zblednięcie tkanki,
świadczące o zamrożeniu materiału.
-ð Zamrożony blok tkankowy, przy pomocy pÄ™sety wyjmuje siÄ™ z mieszaniny
zamrażającej, umieszcza w opisanym woreczku foliowym i przechowuje w
zamrażarce (opt. -ð 70°ðC).
II. Oznaczanie autoprzeciwciał metodą immunofluorescencji pośredniej.
1. Sprzęt i odczynniki:
-ð szkieÅ‚ka z preparatami wÄ…troby szczura (substrat antygenowy dla wykrywanych
autoprzeciwciał)
-ð kriostat
-ð odtÅ‚uszczone w alkoholu szkieÅ‚ka nakrywkowe
-ð pipety jednorazowe i regulowane
-ð probówki plastikowe
-ð statyw do probówek
-ð pÅ‚uczka szklana
-ð komora wilgotna
-ð bufor PBS o pH 7,6
-ð przeciwciaÅ‚a królicze anty ludzkie IgG, A, M znakowane FITC
-ð surowica kontrolna
-ð 90 % buforowana gliceryna
-ð bÅ‚Ä™kit Evansa
2. Materiał badany:
-ð surowica badana w iloÅ›ci ~ 2 ml.
3. Zasada metody:
Autoprzeciwciała obecne w badanych surowicach przyłączają się w pierwszym etapie
do substratu antygenowego (antygenów w skrawkach wątroby szczurzej) na szkiełkach
podstawowych. W drugim etapie następuje detekcja autoprzeciwciał przy pomocy
wyznakowanej fluoresceina antyglobuliny.
4. Wykonanie
-ð wyjąć szkieÅ‚ka z antygenami z lodówki i doprowadzić je do temperatury pokojowej
pod wentylatorem;
-ð przygotować rozcieÅ„czenia badanych surowic w roztworze PBS (rozc. od 1 : 80);
16
-ð naÅ‚ożyć po 25 mðl surowic (kontrolnych i badanych) a szkieÅ‚ko ze skrawkami;
-ð inkubować 30 min, przepÅ‚ukać w PBS-Tween, pÅ‚ukać w pÅ‚uczce 3 ´ð 5 min;
-ð naÅ‚ożyć 20 mðl anty-ludzkiej IgG, A, M/FITC na szkieÅ‚ko;
-ð inkubować 30 min, przepÅ‚ukać w PBS-Tween, pÅ‚ukać w pÅ‚uczce 3 ´ð 5 min;
-ð zamknąć w glicerolu/PBS pod szkieÅ‚kiem nakrywkowym;
-ð do ostatniego pÅ‚ukania można dodać bÅ‚Ä™kit Evansa (10 kropli na 150 ml
PBS - Tween).
5. Ocena i interpretacja wyników:
Ocenę preparatów przeprowadza się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Za reakcję
dodatnią uznaje się obecność żółtozielonej fluorescencji (w odpowiednim substracie
komórkowym w zależności od rodzaju autoprzeciwciał).
17
LITERATURA:
1. Żeromski J. Immunologia dla studentów wydziału lekarskiego. Wyd. AM, Poznań
2008;
2. Żeromski J. Metody immunologiczne. Przewodnik do ćwiczeń z immunologii dla
studentów Wydziału Lekarskiego. Wyd. AM, Poznań 1997;
3. KÄ…tnik-Prastowska I. Immunochemia w biologii medycznej. Metody Laboratoryjne.
PWN, Warszawa 2009;
4. Dembińska-Kieć A., Naskalski J.W. Diagnostyka laboratoryjna z elementami
biochemii klinicznej. Podręcznik dla studentów medycyny. Elsevier Urban&Partner,
Wrocław 2009
5. Luft S. Metody diagnostyki serologicznej w reumatologii. PWN, Warszawa 1996;
6. Roitt I., Brostoff J., Male D. Immunologia. Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2008;
7. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W. Stokłosa T. Immunologia. PWN, Warszawa 2008;
8. Ptak W., Ptak M., Szczepanik M. Podstawy immunologii. PZWL, Warszawa 2009;
9. Zeman K. Zaburzenia odporności u dzieci. PZWL, Warszawa 2002;
10. Zabel M. Immunocytochemia. PWN, Warszawa 1999;
11. Zuba-Surma E.K., Kucia M., Ratajczak M.Z. Post. Biol. Kom. 2007; 34(2): 361- 376;
12. Porcedury ANA Profile 3 EUROLINE i Anty- Borrelia plus VlsE (IgG) ELISA firmy
EUROIMMUN
18