Ćwiczenia 13 9.01.2013
T : Testy lekowrażliwości drobnoustrojów.
ANTYBIOGRAM :
badanie laboratoryjne, mające na celu określenie wrażliwości obecnych w próbce bakterii na
antybiotyki. Bakterie z pobranych wydzielin, np. z plwociny, hoduje się na specjalnych pożywkach
i bada się ich wzrost w obecności różnych antybiotyków. Antybiogramy wykonuje się przy ciężkich
lub nawracających infekcjach. Coraz więcej szczepów bakterii jest odpornych na niektóre
antybiotyki, wskutek często niepotrzebnego ich stosowania.
Antybiogram ---> opis wrażliwości określonego gatunku drobnoustroju na działanie określonych
antybiogramów i/lub chemioterapeutyków.
METODY OKREŚLANIA WRAŻLIWOŚCI :
a) metoda dyfuzyjno-krążkowa
b) metoda rozcieńczeniowa
c) E-test
ad.a) metoda dyfuzyjno-krążkowa
tzw. metoda Kirby-Bauera. Najczęściej używana metoda testowania lekooporności. Oparta jest na
dyfuzji zawartego w krążku do podłoża. Antybiotyk dyfunduje promieniście, tworząc gradient
stężeń. Największa jego koncentracja występuje przy brzegach krążka i spada wraz z odległością od
krążka. Większość strefy zahamowania wzrostu bakterii jest wprost proporcjonalna do stopnia
wrażliwości bakterii na antybiotyk - im większa jest strefa zahamowania, tym bakteria jest bardziej
wrażliwa. W zależności od wielkości strefy, bakterie określa się jako: wrażliwe lub oporne na
podstawie przyjętych standardów (rekomendacji). Jest to metoda dobrze wystandaryzowana,
powtarzalna, relatywnie tania.
Wrażliwy "S"---> wrażliwość drobnoustroju na standardowe dawki leku, wysokie prawdopodobień-
-stwo sukcesu klinicznego.
Średnio wrażliwy "I" ---> szczepy w zakresie MIC pomiędzy wrażliwym a opornym, sukces
terapeutyczny niepewny, może być osiągnięty, gdy lek jest zagęszczany
(np. drogi moczowe) lub może być stosowany w większej dawce
(np. przy niskiej toksyczności).
Oporny "R" ---> wysokie prawdopodobieństwo niepowodzenia terapeutycznego, niezależnie od
dawki leku i lokalizacji infekcji.
Oznaczenie lekooporności metodą krążkowo-dyfuzyjną:
* Materiały :
- podłoże agar Mueler-Hinton (MHA)
- 1 ml jałowej 0,85% soli fizjologicznej (NaCl)
- krążki bibułowe z antybiotykiem
- zawiesina bakteryjna
- wzorzec skali - jałowe wymazówki
* Wykonanie :
1. Przygotować inoculum - kilka tych samych kolonii bakterii ze świeżej, 18-godz. hodowli
bakterii zawiesić w jałowym fizjologicznym roztworze NaCl (0,85%) celem uzyskania zawiesiny o
gęstości 0,5 w skali McFarlanda, co w przybliżeniu odpowiada liczbie od 1-2 108 c.f.u./ml. Gęstość
zawiesiny oznaczyć nefelometrycznie przy użyciu kolorymetru
2. W ciągu 15 min. zanurzyć w inoculum jałową wymazówkę. Usunąć nadmiar zawiesiny,
obracając i przyciskając wymazówkę mocno do ściany probówki powyżej poziomu płynu.
Zawiesinę trzykrotnie rozprowadzić na całej powierzchni podłoża, przekręcając płytkę za każdym
razem o 60°C
3. Po wyschnięciu (do 15 min.) na posiane podłoże nałożyć krążki z antybiotykami (za pomocą
sterylnej pęsety lub z zastosowaniem szablonu, co ułatwia równomierne rozmieszczenie krążków).
Każdy krążek należy delikatnie przycisnąć, zapewniając równomierny kontakt z podłożem.
4. W ciągu 15 min. płytki wstawić do cieplarki, inkubować w warunkach tlenowych 16-18 godzin,
w temp. 35C.
5. Zmierzyć średnicę każdej strefy zahamowania wzrostu drobnoustroju (wliczając średnicę krążka)
i zanotować odczyt w mm. Pomiaru stref można dokonać za pomocą linijki lub suwmiarki.
6. Interpretacja wyniku - wg rekomendacji.
Czynniki wpływające na wielkość strefy zahamowania wzrostu w metodzie krążkowo-dyfuzyjnej :
Gęstość inoculum
w przypadku zbyt małej gęstości inoculum strefa zahamowania, niezależnie od wrażliwości
mikroorganizmu będzie mniejsza - oporne szczepy mogą zostać opisane jako wrażliwe. Przy zbyt
dużej gęstości inoculum, wielkość uzyskanej strefy będzie mniejsza - szczepy wrażliwe mogą
zostać opisane jako oporne.
Czas nałożenia krążków
na posianych płytkach pozostawionych w temperaturze pokojowej dłużej niż podano, przed
nałożeniem krążków dochodzi do namnażania szczepów  w efekcie strefy zahamowania wzrostu
mogą być mniejsze i szczepy mogą zostać opisane jako oporne.
Temperatura inkubacji
w celu otrzymania optymalnego wzrostu, podÅ‚oża z antybiogramem należy inkubować w 35°C.
Jeśli temperatura jest niższa, wydłuża się czas inkubacji, a uzyskane strefy są większe.
Czas inkubacji
większość metod uwzględnia 16-18 godzinny okres inkubacji. W wyjątkowych sytuacjach wstępny
wynik może być odczytany po 6 godzinach, nie mniej wynik należy potwierdzić po odpowiednim
czasie inkubacji.
Rozmiar płytek, grubość warstwy podłoża agarowego i rozmieszczenie krążków z antybiogramem
na płytkach o średnicy 9-10 cm umieszcza się nie więcej niż 5 krążków. Na bardzo cienkich
podłożach może wytwarzać się większa strefa zahamowania, odwrotnie przy zbyt grubym podłożu.
Właściwe rozmieszczenie krążków zapobiega nakładaniu się stref zahamowania lub powstawaniu
zniekształceń przy brzegach płytki.
Stężenie antybiotyków w krążkach
średnica strefy zahamowania zależy od zawartości antybiotyku w krążku. Krążki wymagają
odpowiedniego przechowywania, zgodnie z instrukcjÄ….
Skład podłoża
jest ściśle ustalony; podłoże wpływa na wielkość strefy, decydując o stopniu wzrostu,
współczynniku dyfuzji i aktywności leku.
KONTROLA JAKOÅšCI
Precyzja i dokładność metody powinny być monitorowane za pomocą programu kontroli jakości.
Okresowo (raz w miesiącu, przy nowej serii krążków) przeprowadza się kontrole wrażliwości dla
szczepów kontrolnych o znanej lekowrażliwości. Uzyskiwanie wyników, które nie mieszczą się w
określonym zakresie, jest przypuszczalnie efektem błędu technicznego lub użycia niewłaściwych
odczynników. Należy sprawdzić każdy odczynnik i etap testu, odnalez
ć i wyeliminować błąd.
ad.b) metody rozcieńczeniowe
pozwalają na określenie minimalnego stężenia antybiotyku (MIC  minimum inhibitory
concetration) hamującego wzrost bakterii. Seryjne rozcieńczenia antybiotyku przygotowuje się w
podłożu płynnym lub podłożu agarowym, do których następnie dodaje się odpowiednie inoculum i
inkubuje. Metody pracochłonne, wykorzystywane głównie w badaniach naukowych.
W niektórych gotowych systemach (ręczne, automatyczne) stosowane są metody półilościowe.
Określa się w nich hamowanie wzrostu bakterii na 2 lub 3 stężenia krytyczne (ang. breakpoint 
wartość graniczna - określona wartość MIC lub wartość strefy zahamowania wzrostu wokół
antybiotykiem kwalifikująca szczep jako: S, I, R) dla stopni wrażliwości S, I, R.
Metodę dodawania leku do pożywki (można przygotować jedno lub dwa stężenia) wykorzystuje się
do określenia wrażliwości na antybiotyki i chemioterapeutyki drobnoustrojów wolno rosnących na
podłożach sztucznych np. prątki gruz
licy.
ad.c) E-test
łączy dyfuzję antybiotyku w agarze i ilościowe określenie stężenia hamującego  MIC.
Wykorzystuje się paski nasycone antybiotykiem w gradiencie stężeń.
----------------------------------------------------------------------------------------------
PRZYGOTOWAĆ PROJEKT :
1) czy to sÄ… antybiotyki czy chemoterapeutyki
2) jakie spectrum jest jego działania
3) czy dany lek może być zastosowany
---------------------------------------------------------------------------------------
Wybrałam sobie Staphylococcus aureus
Antybiogram i strefa zahamowania antybiotyków lub chemioproteotyków
* P10 ---> Penicylina,
I gen.,
Strefa zahamowania wzrostu (mm) :
R I S Bakterie
poniżej lub równe równe lub powyżej
28 29 Staphylococcus spp.
14 15 enterokoki
19 20-27 28 Streptococcus spp. z wyjÄ…tkiem
Streptococcus pneumoniae
U mnie strefa zahamowania wynosi 28 mm, więc należy do Oporny "R"
* CN10 ---> Gentamycyna,
aminoglikozyd
R I S
poniżej lub równe równe lub powyżej
12 13-14 15
U mnie strefa zahamowania równa 15 mm, więc należy do Wrażliwy "S"
* KZ30 ---> Cefazolina
cefalosporyny
I gen.
R I S
poniżej lub równe równe lub powyżej
14 15-17 18
U mnie strefa zahamowania wynosi 18 mm, więc należy do Wrażliwy "S"
* AMC30 ---> Amoksycyklina/kwas klawulonowy
R I S Bakterie
poniżej lub równe równe lub powyżej
19 20 Staphylococcus spp.
13 14-17 18 inne bakterie
U mnie strefa zahamowania wynosi 19 mm, więc należy do Oporny "R"
* TOB10 ---> Tobramycyna
R I S
poniżej lub równy równy lub powyżej
12 13-14 15
U mnie strefa zahamowania równa się 19 mm, więc zaliczamy do Wrażliwy "S"
* FOX30 ---> Cefoksytyna
cefalosporyny
II gen.
R I S Bakterie
poniżej lub równy równy lub poniżej
21 22 Staphylococcus aureus i
Staphylococcus lugdunensis
24 25 koagulazo-ujemne
14 15-17 18 gronkowce, rodzina Enterobacteriaceae
U mnie strefa zahamowania wynosi 22 mm, więc zaliczamy do Wrażliwy "S"