Politechnika Gdańska, międzywydziałowy kierunek  INŻYNIERIA BIOMEDYCZNA
SKRYPT DO LABORATORIUM
Chemia
ĆWICZENIE 13: Chromatografia
autor:
dr inż. Radosław Pomećko
Gdańsk, 2010
Projekt  Przygotowanie i realizacja kierunku inżynieria biomedyczna  studia międzywydziałowe
współfinansowany ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.
Politechnika Gdańska, międzywydziałowy kierunek  INŻYNIERIA BIOMEDYCZNA
1. Wymagania wstępne
1.1.Ustawienia
Wymagania wstępne dotyczące uczestników/osób realizujących ćwiczenie:
Znajomość instrukcji. Znajomość innych sposobów rozdzielania substancji chemicznych.
Cele ćwiczenia:
Zapoznanie studentów z zasadą rozdzielania chromatograficznego oraz jego zastosowaniem jako
metody oczyszczania i analizy chemicznej.
Wykaz przyrządów, materiałów i aparatury niezbędnej do przeprowadzenia ćwiczenia
PÅ‚ytki do chromatografii cienkowarstwowej, komory chromatograficzne, rozpuszczalniki organiczne:
CHCl3, CH2Cl2, CH3OH, aceton, heksan
Spodziewane efekty kształcenia - umiejętności i kompetencje:
Poznanie zasady rozdzielania chromatograficznego oraz wpływu rodzaju fazy stałej i ruchomej na
przeprowadzane rozdzielanie. Znajomość praktycznych zastosowań chromatografii w analizie i
technologii chemicznej.
Metody dydaktyczne:
Praktyczna realizacja rozdzielania chromatograficznego mieszanin substancji chemicznych metodami
chromatografii cienkowarstwowej.
Zasady oceniania/warunek zaliczenia ćwiczenia
Poprawne wykonanie przewidzianych ćwiczeń, prawidłowa odpowiedz
na pytanie zwiÄ…zane z
tematem ćwiczenia.
Wykaz literatury podstawowej do ćwiczenia:
1. Praca zbiorowa (Red. E. Luboch, M. Bocheńska, J.F. Biernat).  Chemia ogólna. Ćwiczenia
laboratoryjne Gdańsk: Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej 2003
2. Rodel W., Wolm G.,  Chromatografia gazowa Warszawa PWN 1997
2. Przebieg ćwiczenia
L.p. Zadanie
1. Sprawdzian
2. Realizacja zadań zgodnie z instrukcją do ćwiczenia
3. Omówienie obserwacji
UWAGI! Zadania do opracowania
1. Wykonanie eksperymentów objętych instrukcją, wyznaczenie współczynników retencji dla
przeprowadzonych rozdziałów chromatograficznych
2. Sformułowanie wniosków.
2
CHEMIA, R.Pomećko
Politechnika Gdańska, międzywydziałowy kierunek  INŻYNIERIA BIOMEDYCZNA
3. Wprowadzenie do ćwiczenia
Chromatografia jest to metoda rozdzielania substancji stosowana zarówno w preparatyce, jak i
analityce chemicznej. Metoda ta została odkryta na przełomie XIX i XX wieku przez rosyjskiego botanika M.S.
Cwieta, który zajmował się rozdzielaniem barwników roślinnych. W 1903 r. ogłosił on pierwszą pracę dotyczącą
tego tematu, proponując dla swojej metody nazwę  chromatografia od greckich słów chroma - barwa i grapho
 malujÄ™. Jednak obecnie nazwa metody  chromatografia bynajmniej nie odnosi siÄ™ tylko do rozdzielania
mieszanin barwnych.
Wszystkie układy chromatograficzne zawierają trzy podstawowe elementy:
- fazę nieruchomą (ciało stałe, ciecz zaadsorbowana na ciele stałym)
- fazę ruchomą (inaczej eluent, który może być gazem lub cieczą)
- mieszaninÄ™ substancji rozdzielanych rozpuszczonÄ… w fazie ruchomej.
PodstawÄ… metod chromatograficznych jest wykorzystanie
różnic w powinowactwie składników mieszaniny rozpuszczonych w
eluencie do fazy stałej. Oddziaływania składników z fazą stałą
spowalniają ich ruch w wyniku tego składniki o małym powinowactwie
przemieszczają się szybciej od tych oddziałujących z fazą stałą. Zasada
rozdzielania chromatograficznego zostanie omówiona na przykładzie
chromatografii podziałowej (rozdzielczej) wykorzystującej ciecz
zarówno, jako fazę ruchomą jak i nieruchomą (ciecz immobilizowaną
na podłożu stałym) rys 1. W tym wypadku do rozdzielania mieszaniny
wykorzystuje się różnice we współczynnikach podziału składników
substancji. Przyjmijmy, że pewną ilość mieszaniny składników o
różnych współczynnikach podziału wprowadzono do fazy ruchomej,
oraz że proces podziału składnika między fazy jest dużo szybszy niż
ruch fazy ruchomej. Jest to sytuacja pokazana na rys 1. Wędrówka
substancji (plamy) polega na ciągłym jej budowaniu od czoła
(wychwytywanie substancji przez fazę stacjonarną) oraz na ciągłym jej
wymywaniu od tyłu przez świeżą fazę ruchomą (ekstrakcja). Należy
Rys. 1. Mechanizm rozdzielania
chromatograficznego
zauważyć, że ruch substancji w układzie chromatograficznym odbywa
się tylko wtedy, gdy znajduje się ona w fazie ruchomej, tak więc prędkość przemieszczania się substancji w
układzie zależy od współczynnika podziału między fazę ruchomą i nieruchomą. Jeżeli założymy, że obie fazy
układu mają te same objętości to słusznym jest bilans masy (I) oraz wyrażenie na równowagę podziału (II)
C0 CI CII (I)
CI
D (II)
CII
Gdzie:
C0  całkowite stężenie substancji,
CI  stężenie składnika w fazie ruchomej
CII  stężenie składnika w fazie nieruchomej
D  współczynnik podziału substancji między fazy
3
CHEMIA, R.Pomećko
Politechnika Gdańska, międzywydziałowy kierunek  INŻYNIERIA BIOMEDYCZNA
Ponieważ, jak wcześniej zaznaczono, ruch substancji w układzie chromatograficznym odbywa się tylko, gdy
znajduje się ona w fazie ruchomej, to średnia prędkość wędrówki substancji stanowi taki ułamek prędkości fazy
ruchomej, jaka część substancji zawarta jest w tej fazie:
CI D
(III)
0
C0 0 D 1
Gdzie:  prędkość fazy ruchomej,
0
 średnia prędkość substancji
Stosunek odległości przebytej przez substancję (x) w układzie chromatograficznym do drogi przebytej w tym
samym czasie przez fazę ruchomą (y) zdefiniowany jest, jako współczynnik Rf
x t D
Rf D 1 Rf (IV)
y t
0
Jak wynika z równania (IV) wartość współczynnika Rf jest ściśle związana z wartością współczynnika podziału
substancji D. Dlatego substancja o dużym współczynniku podziału D przemieszcza się w układzie
chromatograficznym szybko z prędkością niewiele mniejszą lub równą prędkości fazy ruchomej. Wartość
współczynnika Rf przyjmuje wartości w przedziale od zera, gdy powinowactwo substancji uniemożliwia jej ruch,
do jedności, gdy brak powinowactwa substancji do fazy nieruchomej. Choć obecnie znanych jest wiele
modyfikacji chromatografii wykorzystujących różne zjawiska fizyczne, podstawowa idea rozdzielania jest
zachowana we wszystkich typach chromatografii.
Klasyfikacja chromatografii, wykorzystywane zjawiska fizyczne
Chromatografia rozdzielcza (podziałowa). W chromatografii tego typu fazą stacjonarną jest cienka
warstwa cieczy immobilizowazna (zaadsorbowana) na powierzchni nośnika neutralnego chemicznie. Fazą
ruchomą może być w tym wypadku ciecz lub gaz. O rozdzieleniu decyduje różnica we współczynnikach podziału
substancji między fazę ruchomą a nieruchomą (prawo podziału Nernsta). Im większa rozpuszczalność substancji
w fazie stacjonarnej tym mniejszy współczynnik Rf .
Chromatografia adsorpcyjna. FazÄ… ruchomÄ… w przypadku tej
metody jest zazwyczaj ciecz, choć może być również gaz. Rolę fazy stałej
spełnia stały adsorbent o bardzo rozwiniętej powierzchni. Często
używanymi adsorbentami jest żel krzemionkowy (uwodniony SiO2) i tlenek
glinu Al2O3. Powierzchnia tych nośników może być specjalnie
modyfikowana. O rozdzieleniu decyduje współczynnik adsorpcji substancji
do powierzchni fazy stacjonarnej. W wypadku SiO2 czy Al2O3 można przyjąć,
Rys. 2. Zasada rozdzielania substancji
że im większa polarność substancji rozdzielanej tym mniejszy ma ona Rf.. W
w chromatografii podziałowej i
adsorpcyjnej
wypadku tzw. fazy odwróconej (SiO2 modyfikowane łańcuchami
węglowodorowymi) substancje o wysokiej polarności mają najwyższy Rf..
W Chromatografii żelowej fazą ruchomą może być ciecz lub gaz natomiast fazą stacjonarną jest
materiał o dużej i znanej porowatości. Rozdzielenie substancji następuje dzięki tzw. efektowi sita
molekularnego, tj. wykorzystywane są różnice w wielkości cząsteczek rozdzielanych substancji.
4
CHEMIA, R.Pomećko
Politechnika Gdańska, międzywydziałowy kierunek  INŻYNIERIA BIOMEDYCZNA
Przechodząc przez układ chromatograficzny najmniejsze cząsteczki mieszaniny
mogą penetrować w głąb porów złoża fazy nieruchomej, co powoduje
spowolnienie ich migracji, natomiast cząsteczki związków większe od porów
złoża nie mogą się w nich zatrzymać i wędrują przez złoże z tą samą szybkością,
co faza ruchoma. Słuszne jest, więc uogólnienie: im większa cząsteczka tym
większy ma Rf..
Rozdzielanie substancji wykorzystujÄ…ce
Rys. 3. Zasada rozdzielania substancji
proces wymiany jonowej stosowane jest w
w chromatografii żelowej
Chromatografii jonowymiennej. Jako faza
stacjonarna wykorzystywane są żywice jonowymienne posiadające grupy
funkcyjne np.  SO3H,  N+(CH3)3OH- zdolne do odłączania (dysocjowania)
anionów lub kationów. Jako faza ruchoma stosowane są roztwory buforowe
o odpowiednim pH. O rozdzieleniu substancji decyduje wartość stałej
równowagi wymiany jonowej. Ogólnie stwierdzić można, że im większy
Rys. 4. Zasada rozdzielania substancji
w chromatografii jonowymiennej
ładunek cząsteczki tym mniejszy jej współczynnik Rf..
Chromatografia powinowactwa jest szczególnym rodzajem chromatografii adsorpcyjnej znajdującej
zastosowanie szczególnie w biotechnologii. Wykorzystuje się w niej specyficzne oddziaływania pomiędzy
dwoma substancjami, a w szczególności:
- hormonami a ich receptorami
- enzymem a substratem lub inhibitorem
- kwasami nukleinowymi a białkami
- przeciwciałami a antygenami
Jedna z tych substancji jest immobilizowana na podłożu, stanowiąc fazę
nieruchomą. Pozwala ona na oddzielenie komplementarnego składnika z
badanej mieszaniny. Rozdzielanie mieszaniny przeprowadza siÄ™ zazwyczaj w
Rys. 4. Zasada rozdzielania substancji
dwóch etapach. W etapie pierwszym na układ chromatograficzny kieruje się
w chromatografii powinowactwa
mieszaninę zawierającą komplementarny składnik, który zostaje
skompleksowany na złożu. Po odmyciu niekompleksowanych składników, układ chromatograficzny przemywa
się eluentem powodującym dysocjację kompleksów i wymycie komplementarnego składnika. Jako eluent w
drugim etapie używa się roztworów buforowych o odpowiednim pH, lub roztworu związków zdolnych do
współzawodniczenia o miejsca wiążące.
Klasyfikacja chromatografii, użyta faza ruchoma
W zależności od użytej fazy ruchomej chromatografię dzielimy na: gazową (GC, ang. gas chromatography),
cieczową (LC, liquid chromatography). W zależności od zastosowanej fazy stacjonarnej rozróżniamy
następujące układy chromatograficzne:
gaz  ciało stałe (GSC, ang. gas-solid chromatography)
ciecz  ciało stałe (LSC, ang. liquid-solid chromatography)
gaz  ciecz (GLC, ang. gas-liquid chromatography)
ciecz  ciecz (LLC, ang. liquid-liquid chromatography)
5
CHEMIA, R.Pomećko
Politechnika Gdańska, międzywydziałowy kierunek  INŻYNIERIA BIOMEDYCZNA
Chromatografia kolumnowa
Metoda ta nadaje się do oczyszczania preparatów uzyskanych w syntezach chemicznych, jak i do analizowania
małych próbek substancji w zastosowaniach analizy chemicznej. Złoże (nośnik lub adsorbent) umieszczony jest
w tym przypadku w kolumnie, na wyjściu której w zastosowaniach analitycznych umieszcza się detektor.
Pojęcie  kolumny jest bardzo szerokie i obejmuje zarówno kolumny szklane stosowane w chromatografii
preparatywnej, jak i długie kapilary stalowe wykorzystywane w chromatografii gazowej. Szczególnie w
technikach wymagających stosowania kolumn o małej średnicy i dużej długości stosuje się tłoczenie fazy
ruchomej pod zwiększonym ciśnieniem, co daje dobre efekty rozdzielania w stosunkowo krótkim czasie (np.
wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC od ang. High-Performance-Liquid-Chromatography). W
zastosowaniach chromatografii preparatywnej z użyciem kolumn szklanych najczęściej faza ruchoma porusza
się dzięki sile grawitacji lub pod małym ciśnieniem. Znane są jednak obecnie instalacje przemysłowe do
preperatywnego oczyszczania chromatograficznego, w szczególności w przemyśle farmaceutycznym tj. do
oczyszczania leków. Ze względu na stosowaną fazę ruchomą metody chromatograficzne można podzielić na:
chromatografię cieczową i chromatografię gazową. W szczególnych przypadkach wymagających analizy
związków nielotnych, jako eluent stosuje się gaz sprężony powyżej punktu krytycznego (SFC, supercritical fluid
chromatography).
Rys. 6. Schemat blokowy aparatury do wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Oznaczenia: A,A'- zbiorniki eluentu, B - zawór
mieszający, C - pompa, D- kolumna chromatograficzna, E - dozowanie próbki, F - detektor, G - opcjonalny autosampler, H  integrator i
sterowanie
Ze względu na dobrą zdolność rozdzielczą, często stosowaną techniką jest obecnie chromatografia
gazowa z użyciem kolumn kapilarnych. Kolumna taka to rurka ze stopionego SiO2 długości kilku metrów o
średnicy wewnętrznej rzędu 0,5 mm. Na wewnętrznych ścianach, rurki osadza się fazę nieruchomą. Użycie
chromatografii w takiej konfiguracji pozwala w czasie ok 30 minut oznaczać stężenia kilkudziesięciu związków
naraz, co znajduje zastosowanie np. w analizie składu produktów destylacji ropy naftowej. Drugą ważną zaletą
tej techniki jest wielkość próbki, jaką można poddać analizie.
Oddzielnym problemem w chromatografii jest detekcja składników opuszczających kolumnę. Istnieje
bardzo wiele rodzajów detektorów używanych w metodach chromatograficznych ponieważ wiele różnorodnych
substancji jest za pomocą tych technik rozdzielanych. Zasada ich działania może się opierać na pomiarze
przewodnictwa elektrycznego, lub cieplnego, absorpcji światła, współczynnika załamania światła, masy
molowej, fluorescencji itp. Jako detektor w chromatografii może być zastosowany również spektrometr
masowy, co znacząco ułatwia identyfikację substancji odpowiadających poszczególnym pikom. Zestawy typu:
chromatograf gazowy  spektrometr masowy (GC MS) są bardzo użyteczne, zwłaszcza w skomplikowanych
analizach zanieczyszczeń środowiska czy badaniach biochemicznych. Innymi detektorami często łączonymi z
chromatografią gazową są: detektor płomieniowo-jonizacyjny FID (ang. flame ionization detector ) oraz
6
CHEMIA, R.Pomećko
Politechnika Gdańska, międzywydziałowy kierunek  INŻYNIERIA BIOMEDYCZNA
detektor wychwytu elektronów ECD ( ang. Electron capture detector) szczególnie przydatny w detekcji
pestycydów, związków wielo-chlorowcowych i organometalicznych. Cechy jakie powinny charakteryzować
dobry detektor to: duża czułość oraz niska granica wykrywalności (najniższe stężenie składnika jakie detektor
jest w stanie wykryć).
Zdolność rozdzielcza chromatografii kolumnowej
Chromatografia, używana jako metoda w analizie
chemicznej, jest techniką porównawczą tzn. efekt
rozdzielania musi zostać porównany ze wzorcem i
dopiero takie porównanie dostarcza informacji na
temat rodzaju substancji tworzÄ…cej pik oraz jej
stężenia. Efekt rozdzielenia chromatograficznego
wykreślony jest w postaci chromatogramu (rys. 7) i
przedstawia zależność sygnału od czasu lub objętości
retencji. Czas retencji (czas zatrzymania) określa, po
jakim czasie dana substancja opuszcza kolumnÄ™
chromatograficzną. Dla porównania możliwości
Rys. 7. Schematyczne przedstawienie chromatogramu
rozdzielczych danego układu chromatograficznego
(kolumna, skład fazy stacjonarnej i ruchomej itp.) wprowadzono pojęcie zdolności rozdzielczej RS, która
definiowana jest dla rozdzielenia dwóch składników:
tR1- tR2
Rs (V)
W1- W2
2
Gdzie: tRi  czas retencji itego składnika
Wi  szerokość piku i-tego składnika  wyznaczona jako przecięcie z linią bazową stycznych do ramion
piku.
Chromatografia cienkowarstwowa TLC (ang. Thin-Layer-Chromatography)
W chromatografii cienkowarstwowej fazę nieruchomą stanowi cienka warstwa (rzędu 200 źm)
adsorbentu (np. żel krzemionkowy, Al2O3) naniesiona na płytkę szklaną lub aluminiową. Możemy mieć do
czynienia z warstwą zaadsorbowanej fazy wodnej na powierzchni adsorbentu, wówczas o rozdzieleniu
substancji będzie decydować zjawisko podziału (ekstrakcji) między wodę a fazę ruchomą (chromatografia
rozdzielcza). Jeżeli jednak adsorbent będzie odpowiednio wysuszony, to o rozdzieleniu będzie decydować
adsorpcja na jego powierzchni. W zależności od potrzeb stosuje się też płytki z naniesionym żelem
krzemionkowym o powierzchni zmodyfikowanej węglowodorami o długich łańcuchach np. C8, C18. Jako fazę
ruchomą w tak zmodyfikowanym układzie używa się polarne rozpuszczalniki jak np. wodę czy mieszaninę
woda/metanol. Ten rodzaj chromatografii (nie tylko TLC) nazywa się chromatografią w fazach odwróconych.
Prekursorem techniki TLC była chromatografia bibułowa. Jak sama nazwa wskazuje rolę fazy
nieruchomej spełniała bibuła na której zawsze zaadsorbowana jest warstewka wody. Tak więc była ona
przykładem chromatografii rozdzielczej. Zarówno chromatografia TLC jak i bibułowa jest stosowana do
rozdzielania małych ilości substancji, a ich zaletami są krótki czas rozwijania chromatogramu oraz dobre
rozgraniczenie konturów plam.
7
CHEMIA, R.Pomećko
Politechnika Gdańska, międzywydziałowy kierunek  INŻYNIERIA BIOMEDYCZNA
Jeżeli substancje rozdzielane techniką TLC są barwne, rozróżnienie plam na rozwiniętym
chromatogramie nie nastręcza problemów. Czasem jednak rozdzielana substancje są bezbarwne i do
zaobserwowania efektu rozdzielenia konieczne jest wywołanie chromatogramu. Polega to na spryskaniu płytki
roztworem odpowiednio dobranej substancji tworzącej barwne związki z analizowanymi składnikami. W
przypadku aminokwasów stosuje się roztwór ninhydryny i ogrzewa płytkę dla przyśpieszenia przebiegu reakcji.
Często stosowanym i bardzo uniwersalnym odczynnikiem do wywołania chromatogramów są pary jodu.
Obecnie wiele żeli zawiera fluoryzujące dodatki. Na takim chromatogramie oglądanym w świetle
ultrafioletowym badane substancje uwidaczniajÄ… siÄ™ w postaci ciemnych plam.
Wspólczynnik Rf pozwala określić różnice w szybkościach migracji poszczególnych
substancji w chromatografii cienkowarstwowej. Określa on stosunek drogi x
przebytej przez środek pasma substancji od linii startu, do drogi y przebytej przez
czoło fazy ruchomej (Rys. 8). W praktyce należy tak dobierać warunki by Rf zawierał
się w granicach 0,1  0,9. Każdej substancji odpowiada charakterystyczna wartość
współczynnika Rf dla pewnego układu rozpuszczalników, typu chromatografii i
temperatury. Stosowane w chromatografii rozpuszczalniki można uszeregować
zgodnie ze wzrostem zdolności do wymywania zaadsorbowanych substancji
polarnych. Dla polarnych faz stacjonarnych szereg przedstawia się następująco:
heksan, tetrachlorek węgla, benzen, chlorek metylenu, chloroform, eter dietylowy,
octan etylu, aceton, etanol, metanol, woda. Rozpuszczalniki zestawione w tej
kolejności tworzą tzw. szereg eluotropowy.
Rys. 8. Wyznaczanie
współczynnika Rf
Część doświadczalna
Ćwiczenie 1. Rozdzielanie barwników tuszu.
Z foli aluminiowej pokrytej żelem krzemionkowym wyciąć pasek o wymiarach ok.7,5x4,5 cm. Około 7 mm od
dołu zaznaczyć linię startu ołówkiem i nanieść na nią w jednakowych odstępach cztery małe plamki tuszów o
różnych kolorach. Spożądzić 5 ml roztworu o składzie chloroform/metanol 4/1 (objętościowo). Roztwór ten
stanowiący fazę ruchomą, wlać na dno komory chromatograficznej tak, aby poziom cieczy wynosił około 2  3
mm. Płytkę umieścić w komorze zanurzając ją od strony linii startowej w układzie i obserwować zmiany. Proces
przerwać, gdy czoło fazy ruchomej osiągnie wysokość ok. 5 mm poniżej górnej krawędzi płytki. Opisać
obserwacje i przedstawić wnioski na temat składu tuszu flamastrów.
Ćwiczenie 2. Rozdzielanie aminokwasów metodą TLC.
Na płytkę o szerokości około 4,5 cm za pomocą kapilary nanieść na linię startu próbki roztworów trzech
aminokwasów oraz ich mieszaninę. Sporządzić fazę ruchomą mieszając n-butanol, kwas octowy i wodę w
proporcjach 4:1:1. (objętościowo) i wlać na dno komory chromatograficznej. Płytkę umieścić w komorze i
przeprowadzić rozwijanie chromatogramu. Proces przerwać, gdy czoło fazy ruchomej osiągnie wysokość ok. 5
mm poniżej górnej krawędzi płytki. Zaraz po wyjęciu płytki zaznaczyć ołówkiem poziom fazy ruchomej. Po
delikatnym wysuszeniu spryskać płytkę roztworem ninhydryny i wygrzać w strumieniu gorącego powietrza.
Wyznaczyć współczynniki Rf dla każdego z badanych aminokwasów. Opisać obserwacje i przedstawić wnioski na
temat związku pomiędzy budową badanych aminokwasów, ich polarnością a współczynnikiem Rf.
8
CHEMIA, R.Pomećko
Politechnika Gdańska, międzywydziałowy kierunek  INŻYNIERIA BIOMEDYCZNA
Ćwiczenie 3. Rozdzielanie witamin z grupy B metodą TLC.
Rozdzielaniu chromatograficznemu poddajemy preparat witamin B complex. Na dwie płytki chromatograficzne
należy nanieść roztwór badany i roztwory wzorcowe zawierające poszczególne witaminy. Roztwory
przygotować wg. podpunktów:
- 2 drażetki witaminy B complex opłukać z warstwy barwnika, rozdrobnić i wytrząsnąć z 4 cm3 mieszaniny 0,1 M
KOH/metanol 1/1, a następnie przesączyć. Nakładać kapilarą, po trzy krople.
- 2 drażetki witaminy B1 rozetrzeć i wytrząsnąć z 4 cm3 mieszaniny woda/metanol 1/1 a następnie przesączyć,
- jak w powyższym punkcie postąpić z 2 tabletkami witaminy B6,
- jak w powyższym punkcie postąpić z 1 tabletką preparatu Calcium pantothenicum,
- jak w punkcie pierwszym postąpić z 2 tabletkami witaminy B2,
- 2 tabletki witaminy PP rozetrzeć i wytrząsnąć z 10 cm3 metanolu i przesączyć.
Sporządzić fazę ruchomą mieszając n-butanol, kwas octowy i wodę w proporcjach 4:1:1. (objętościowo) i wlać
na dno komory chromatograficznej. Płytki umieścić w komorze i przeprowadzić rozwijanie chromatogramów.
Po wysuszeniu jednÄ… z pÅ‚ytek spryskać roztworem ninhydryny i wygrzać w 80°C. Witamina B1 ujawnia siÄ™ jako
jasno żółta plama, witamina B2  intensywnie żółta, pantotenian wapnia  plama fioletowo-niebieska. Witaminy
B6 i PP wywołują się trudno. Drugą płytkę chromatograficzną umieścić w parach jodu. Witaminy B6 i PP dają
wyraz
ne brunatne plamy. Wyznaczyć współczynniki Rf dla każdej z badanych witamin. Opisać obserwacje i
przedstawić wnioski na temat związku pomiędzy budową witamin, ich polarnością a współczynnikiem Rf.
Ćwiczenie 4. Dobór fazy ruchomej do rozdzielania mieszanin.
Na każdą z 4 płytek chromatograficznych nanieść po trzy plamy roztworów: o-nitroaniliny, p-nitroaniliny oraz
ich mieszaniny i umieścić w komorach chromatograficznych zawierających mieszaniny acetonu z heksanem w
proporcjach objętościowych 1:10, 2:8, 3:7, 5:5. Przeprowadzić rozwijanie chromatograficzne.
Określić optymalny skład fazy ruchomej dla rozdzielania izomerów nitroaniliny.
Porównać polarność obu związków i wyznaczyć współczynniki Rf w badanych układach.
Literatura:
1. Praca zbiorowa (Red. E. Luboch, M. Bocheńska J.F. Biernat)  Chemia ogólna. Ćwiczenia laboratoryjne
Gdańsk: Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej 2003
2. R. Staszewski,  Kontrola chemicznych zanieczyszczeń środowiska Gdańsk: Wydawnictwo Politechniki
Gdańskiej 1990
3. Rodel W., Wolm G.,  Chromatografia gazowa Warszawa PWN 1997
4. Wróbel J.T.,  Preparatyka i elementy syntezy organicznej Warszawa PWN 1983
5. Kirkland J.J.,  Współczesna chromatografia cieczowa Warszawa PWN 1976
9
CHEMIA, R.Pomećko