8857685815

Analiza Zmian na Poziomie Chromat Cyklu Komórkowym

Wykonanie

1.    ok. 0,1 - lg materiału roślinnego zamrozić w ciekłym azocie i utrzeć w moździerzu porcelanowym na proszek (zarówno moździerz jak i tłuczek należy wcześniej schłodzić poprzez zalanie ciekłym azotem; ucieranie komórek z zawiesiny będzie łatwiejsze, jeżeli przed odwinięciem foli „obstukamy” ją zimnym tłuczkiem). Nie dopuścić do rozmrożenia.

2.    proszek przenieść schłodzoną szpatułką do falkonu na 50 ml zawierającego 10 ml schłodzonego buforu HI

3.    zawiesinę dodatkowo homogenizować ok. 20 s homogenizatorem IKA przy najwyższych obrotach(należypamiętać,żenóżhomogenizatora trzeba dobrze opłukać przed i po homogenizacji (najlepiej trzymając pracujący nóż w plastikowej butelce z wodą destylowaną) i wytrzeć do sucha papierowym ręcznikiem; pracujące noże należy trzymać w roztworze)

4.    próbki zrównoważyć i wirować przez 15 min. przy 12 OOOg (~10 500 rpm wirówka preparatywna Eppendorf)

5.    supematant przelać do falkonu na 50 ml przez warstwę miracloth lub wielokrotnie złożoną gazę

6.    dodać 100% TCA (kwas trój chlorooctowy) do końcowego stężenia 20-25%

7.    pozostawić w lodzie na co najmniej 30 minut kilkakrotnie mieszając lub umieścić na kołysce laboratoryjnej w chłodni

8.    po zrównoważeniu prób żwirować przez 30-40 minut przy 16 OOOg (~13 000 rpm wirówka preparatywna Eppendorf)

9.    przepłukać osad dwukrotnie porcjami po około 10 mlzimnego(-20°C)acetonu,poobupłukaniach żwirować w warunkach podanych wyżej przez 5 - 10 min. - pamiętać o zrównoważeniu próbek

10.    osad wysuszyć strumieniem zimnego powietrza trzymając probówkę w lodzie

11.    zawiesić w 300 pl lx SDS loadingbuffer (uwaga: przygotowany bufor jest 5x stężony), przenieść do 1,5 ml probówek typu eppendorf i dodać po 15 pl IM DTT (dithiothreitol)

12.    w celu usunięcia nierozpuszczalnego osadu żwirować w mikrowirówce w 4°C przez 15 minut i przenieść do świeżych probówek. Tak uzyskane preparaty białkowe przechowywać w -20°C.

Dzień 2, 3. Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS (ok. 3 h), barwienie (przez noc)

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest techniką powszechnie stosowaną w analizie białek. W zależności od zastosowanego układu można uzyskać rozdział polipeptydów stosownie do różnych właściwości fizykochemicznych. Przyjmuje się, że elektroforeza w obecności SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) frakcjonuje białka zależnie od ich masy (długości łańcucha polipeptydowego).

Ten typ elektroforezy jest obecnie najczęściej stosowany i może być użyty jako jedna metoda analityczna lub stanowić element szeregu bardziej skomplikowanych badań (np. elektroforeza dwuwymiarowa, preparatywna, Western blotting).

Złożem, w którym następuje rozdział białek jest żel poliakrylamidowy, w czasie polimeryzacji oraz w trakcie elektroforezy ustawiony w pozycji pionowej (ang. vertical slab system). Standardowo, metoda SDS-PAGE jest używana w wersji tzw. disc electrophoresis (ang. discontinuous pH), umożliwiającej maksymalne wykorzystanie zdolności rozdzielczych tej metody. W praktyce ta „nieciągłość” dotyczy żelu, który składa się z dwóch warstw. Próbki nakładane na żel w tym układzie mogą mieć stosunkowo dużą objętość, ponieważ w czasie przechodzenia przez górną warstwę żelu zostają zagęszczone do wąskiego pasma, które w dolnym żelu rozdziela się na pojedyncze, „ostre” prążki.

W rzeczywistości białka rozdzielane są w SDS PAGE na zasadzie filtracji, analogicznie do metody chromatograficznej sączenia molekularnego.

Ponieważ frakcjonowanie zachodzi w zależności od długości łańcucha polipeptydowego, można ustalić masę danego białka przez porównanie z odpowiednimi standardami. Jest to metoda pozwalającanaoznaczeniemasybiałkazdokładnością do 5-10%, ale niestety nie każdy polipeptyd można w ten sposób scharakteryzować (jednym z wyjątków są białka histonowe). W zależności od wielkości rozdzielanych białek należy dobrać odpowiednie stężenie akrylamidu. Przyjmuje się, że 15% żele stosuje się do białek mniejszych niż 20 kDa, 12% dla 20-30 kDa, 10% dla 30-40 kDa i 8% dla białek powyżej 50 kDa.

Dla sprawdzenia wydajności i oszacowania ilości wyizolowanych białek wystarczy żel 12%. Do analizy Western Biot lepszy będzie żel 15%.