8857685800

Analiza Zmian na Poziomie Chromati Cyklu Komórkowym

4.    Nałożyć pokrywy i przeprowadzić transfer przez ok.2 godziny przy stałym napięciu 25V i natężeniu 1,5-2 mA na cm² żelu- im krótszy transfer tym wyższe natężenie. UWAGA: w stosowanym na ćwiczeniach transbloterze nie wolno przekraczać napięcia 25 V !

5.    Po zakończeniu transferu żel wybarwić a membranę przenieść do roztworu blokującego (TBST + 5% mleko odtłuszczone) i zostawić na kołysce laboratoryj nej w temperaturze pokoj owej na co najmniej 30 min. Na tym etapie, membranę można przechowywać w 4°C przez kilka dni.

6.    Dodać przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone 0,5 pi w 10 ml TBST z 5% mlekiem i pozostawić przez noc na kołysce w 4°C.

7.    Odpłukać przeciwciała roztworem TBST: 2 razy 5 min., 2 razy 15 min.

8.    Dodać przeciwciała drugorzędowe (rozcieńczyć 1:1000 w TBST z mlekiem) i pozostawić na kołysce w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.

9.    Odpłukać jak wyżej.

UWAGA:

Nie pozwolić membranie wyschnąć. Obchodzić się z nią delikatnie. Używać pensety. W celu zmniejszenia zużycia przeciwciał należy używać jak najmniejszej objętości buforów, pamiętając jednak, że konieczne jest całkowite zanurzenie membrany.

Dzień 5. Detekcja

Metoda detekcji białek w technice western biot zależy od rodzaju znacznika, jaki dołączony jest do przeciwciał. Najczęściej stosowane są alkaliczna fosfataza lub peroksydaza chrzanowa. Wizualizacja obu tych enzymatycznych znaczników może być przeprowadzona kolorymetrycznie (kiedy w miejscu związania przeciwciał do białka na membranie powstaje barwny produkt) lub chemiluminescencyjnie (enzym przeprowadza reakcję z wytworzeniem światła, które naświetla kliszę fotograficzną). Sposób wizualizacji zależy od podanych substratów, przy czym należy pamiętać, że ta druga metoda jest znacznie czulsza.

W trakcie ćwiczeń wykorzystujemy kolorymetryczną detekcję alkalicznej fosfatazy.

Wykonanie:

1.    Membranę przepłukać 5 minut w PDS .

2.    Inkubować (najlepiej w ciemności) membranę w 15 ml PDS + 50 pl NBT + 50 pi BCIP.

3.    Delikatnie mieszać (można zostawić na kołysce laboratoryjnej) aż do uzyskania prążków na membranie.

4.    Zatrzymać reakcję przeprowadzaną przez alkaliczną fosfatazę przez płukanie wodą destylowaną od razu po pojawieniu się pierwszych prążków.

5.    Porównać wynik immunoblottingu z żelem białkowym. Przeprowadzić dyskusję.