UNIWERSYTET GDAC
SKI
WYDZIAA
CHEMII
Katedra Analizy Åšrodowiska
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z przedmiotu "Chromatografia"
ĆWICZENIE 2
Chromatografia gazowa  analiza ilościowa
związków aromatycznych metodą wzorca
wewnętrznego, dodatku wzorca oraz normalizacji
wewnętrznej
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 2
1. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest porównanie metod analizy ilościowej, stosowanych w chromatografii
gazowej. Próbka zawierająca trzy związki aromatyczne (toluen, etylobenzen i p-ksylen) o
nieznanym stÄ™\
eniu będzie analizowana metodą normalizacji wewnętrznej, dodatku wzorca oraz
wzorca wewnętrznego. Zadaniem studenta jest porównanie wyników poszczególnych analiz oraz
wskazanie przyczyn ewentualnych ró\
nic.
2. Wprowadzenie do chromatografii gazowej
Termin "chromatografia" opisuje wszystkie te metody rozdzielania mieszanin związków, w
których poszczególne składniki mieszaniny ulegają podziałowi między dwie fazy  stacjonarną i
ruchomą, ze względu na ró\
nice we właściwościach fizykochemicznych. Je\
eli mamy do czynienia
z układem, w którym fazą ruchomą (mobilną) jest gaz, to mówimy o chromatografii gazowej (gas
chromatography, GC). Mo\
liwa jest chromatografia w układzie gaz  ciało stałe (adsorpcyjna
chromatografia gazowa, GSC) lub częściej stosowana chromatografia w układzie gaz  ciecz
(podziałowa chromatografia gazowa, GLC). W drugim przypadku rozdzielanie mieszanin na
składniki jest uwarunkowane ró\
nicami w powinowactwie poszczególnych związków do fazy
stacjonarnej, co wyra\
a się ró\
nicami w wartościach współczynnika podziału Kc, wyra\
onego
wzorem:
cs
Kc = (1)
cm
gdzie: cs i cm oznaczajÄ… stÄ™\
enia substancji badanej odpowiednio w fazie stacjonarnej
i ruchomej.
Chromatografia gazowa słu\
y nie tylko do rozdzielania mieszanin, ale tak\
e do analizy ilościowej i
w mniejszym stopniu, analizy jakościowej szerokiej gamy związków chemicznych.
2.1. Podstawowe pojęcia i definicje w chromatografii
Ka\
da analiza metodÄ… chromatografii gazowej polega na selektywnym wymywaniu (elucji)
związków z próbki wprowadzonej na kolumnę chromatograficzną za pomocą gazu nośnego.
Poszczególne składniki są wykrywane przez detektor, którego sygnał jest rejestrowany za pomocą
komputera, integratora bÄ…dz
rejestratora. Uzyskany wykres zale\
ności wskazań detektora od czasu
nazywany jest chromatogramem. Poszczególne sygnały (piki) obecne na chromatogramie mo\
na
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 3
scharakteryzować za pomocą szeregu parametrów retencyjnych (retencja = zatrzymywanie):
" Całkowity czas retencji tR danego składnika to czas liczony od momentu
wprowadzenia próbki (iniekcji) do momentu pojawienia się na chromatogramie
maksimum sygnału związku, czyli do pojawienia się na wyjściu z kolumny jego
maksymalnego stÄ™\
enia. Stąd całkowita objętość retencji to:
VR = tR‡ Fc (2)
gdzie Fc to objętościowa prędkość wypływu fazy ruchomej z kolumny [ml/min]
Całkowitą objętość retencji, współczynnik podziału oraz objętości faz: mobilnej i
stacjonarnej (odpowiednio Vm i Vs) łączy równanie:
VR=Vm+KCVs (3)
Posługiwanie się objętościami faz i objętościami retencji jest w chromatografii gazowej
mało wygodne, jednak na podstawie równania (3) mo\
na ustalić, \
e wzrost wartości
współczynnika podziału Kc powoduje wzrost czasu retencji. Nale\
y równie\
pamiętać,
\
e czas retencji wydłu\
a się, gdy wzrasta długość kolumny, zaś skraca się, gdy
zwiększamy prędkość przepływu fazy ruchomej. Wyprowadzenie wzoru (3) mo\
na
znalez
ć w literaturze, której spis jest podany na końcu instrukcji.
" Zerowy czas retencji tM to czas przebywania na kolumnie substancji, która nie
oddziałuje z fazą stacjonarną (w przypadku chromatografii gazowej np. hel, metan). Stąd
zerowa objętość retencji wyra\
ana jest wzorem:
VM = tM‡ Fc (4)
" Zredukowany czas retencji t'R to ró\
nica pomiędzy całkowitym czasem retencji
danego składnika a zerowym czasem retencji:
'
tR = tR - tM (5)
Wielkość ta charakteryzuje zatrzymywanie się danego składnika na fazie stacjonarnej.
Pojęcia całkowitego, zerowego i zredukowanego czasu retencji ilustruje Rys. 1.
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 4
Rys. 1. Przykładowy chromatogram, wyjaśniający pojęcia: całkowity czas retencji (tRA, tRB), zerowy czas retencji
(tM) oraz zredukowany czas retencji (t`RA, t`RB).
" Zredukowana objętość retencji to:
'
VR = VR -VM (6)
" Względny czas retencji równy:
'
tRi
ri,w = (7)
'
tRw
gdzie: indeks "i" oznacza dowolnÄ… substancjÄ™, a indeks "w" oznacza wzorzec
" Współczynnik retencji k, zdefiniowany wzorem:
'
tR - tM tR
k = = (8)
tM tM
lub:
ns csVs Vs
k = = = KC (8a)
nm cmVm Vm
gdzie: n oznacza liczbÄ™ moli substancji, c jej stÄ™\
enie, V objętość fazy,
Kc to współczynnik podziału, zaś indeksy "s" i "m" dotyczą odpowiednio fazy
stacjonarnej i ruchomej.
Im większą wartość przyjmuje współczynnik k, tym silniej substancja jest
zatrzymywana przez fazÄ™ stacjonarnÄ….
" Indeks retencji Kovátsa IX  wielkość charakterystyczna dla danej substancji,
analizowanej na danej fazie stacjonarnej, słu\
ąca do analizy jakościowej; z definicji dla
n-alkanów indeksy retencji są równe 100-krotności liczby atomów węgla w cząsteczce
(np. indeks retencji dla n-heksanu wynosi 600, dla n-dekanu 1000). Indeksy retencji
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 5
wyznacza się wobec dwóch n-alkanów o z oraz z+m atomach węgla w cząsteczce, z
których pierwszy jest eluowany z kolumny przed badanym związkiem, a drugi  po tym
związku. Stosuje się wtedy wzór:
' '
logtRx - logtRz
I =100z +100m (9)
X
' '
logtR(z+m) - logtRz
gdzie: IX  indeks retencji nieznanego zwiÄ…zku, t´Rx  zredukowany czas retencji
nieznanego zwiÄ…zku, t´Rz  zredukowany czas retencji alkanu zawierajÄ…cego
z atomów wÄ™gla, t´R(z+m)  zredukowany czas retencji alkanu zawierajÄ…cego
z+m atomów węgla.
Wzór (9) mo\
na stosować w przypadku analizy w stałej temperaturze (w izotermie).
Dla analiz w programowanej temperaturze stosuje się wzór van den Doola i Kratza:
TRx -TRz
ITp =100z +100m (10)
TR( z+m) -TRz
gdzie: ITp  indeks retencji nieznanego zwiÄ…zku, TR  temperatura w Kelvinach,
przy której dany związek eluuje z kolumny (temperatura retencji)
lub całkowity czas retencji. Wyjaśnienie indeksów x, z, m, z+m jak we
wzorze (9).
2.2. Aparatura do chromatografii gazowej
W chromatografii gazowej gaz nośny jest oczyszczany i dostarczany do kolumny
chromatograficznej, umieszczonej w piecu chromatografu. Poprzez dozownik wprowadzamy
próbkę do strumienia gazu nośnego i dalej na kolumnę. Próbka jest rozdzielana i poszczególne
składniki trafiają do detektora. Kolumna, dozownik i detektor są utrzymywane w zaprogramowanej
temperaturze. Sygnał elektryczny z detektora jest wzmacniany i przekazywany do urządzenia
rejestrującego, którym mo\
e być rejestrator, integrator (pozwala na automatyczne określanie
między innymi czasów retencji i powierzchni sygnałów poszczególnych związków) lub, we
współczesnych zestawach, komputer. Współczesne chromatografy gazowe składają się z kilku
podstawowych części, które zostały pokazane na schemacie blokowym (Rys. 2).
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 6
Rys. 2. Schemat blokowy chromatografu gazowego: 1  zbiornik gazu nośnego, 2  regulacja przepływu, 3 
filtry, 4  dozownik, 5  kolumna chromatograficzna, 6  detektor, 7  piec chromatografu, 8  wzmacniacz
sygnału, 9  urządzenie rejestrujące.
2.2.1. Zbiorniki gazu nośnego
Podstawowe cechy dobrego gazu nośnego to obojętność wobec fazy stacjonarnej,
elementów przyrządu oraz składników badanych mieszanin. Warunki te spełniają: hel, argon, azot
oraz wodór i te właśnie gazy stosowane są najczęściej. Gaz nośny jest zwykle dostarczany z butli
ciśnieniowych, wyjątkiem jest wodór, który mo\
na tak\
e dostarczać do chromatografu przy u\
yciu
generatorów elektrolitycznych. Wa\
ny jest równie\
stopień czystości gazu nośnego, gdy\

zanieczyszczenia mogą powodować zakłócenia pracy detektora i dezaktywację faz stacjonarnych.
Przed kolumną zwykle znajdują się zatem filtry (ró\
nego rodzaju adsorbenty), słu\
Ä…c do usuwania
tlenu, wody i zanieczyszczeń organicznych. Przed wlotem na kolumnę znajdują się równie\

regulatory przepływu, pozwalające na utrzymanie stałego ciśnienia gazu na po\
Ä…danym poziomie.
Gaz nośny dobiera się często pod kątem przydatności do pracy w zestawie z konkretnym
detektorem (patrz punkt 2.2.4).
2.2.2. Dozowniki
Chromatografia gazowa słu\
y do rozdzielania substancji, które w warunkach analizy mają
postać par lub gazów. Są to zatem te substancje, których temperatura wrzenia lub sublimacji nie
przekracza okoÅ‚o 300-400°C (w zale\
ności od mo\
liwości konkretnego modelu chromatografu).
Dozowanie próbki musi przebiegać mo\
liwie powtarzalnie i powinno wprowadzać na kolumnę
mo\
liwie małe ilości próbki. Dozowniki pozwalają na wprowadzenie do strumienia gazu nośnego
analizowanych substancji. Często dozownik jest ogrzewany do takiej temperatury, by ju\
w jego
obrębie wprowadzone substancje przeszły w stan gazu. W przypadku kolumn kapilarnych stosuje
się zwykle dwa typy dozowników:
" dozowniki z dzieleniem strumienia (ze spliterem, split injection)  w tym przypadku do
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 7
gorącego dozownika wprowadza się próbkę za pomocą strzykawki przez membranę;
większość odparowanej próbki jest usuwana na zewnątrz przyrządu ze strumieniem gazu
nośnego, tylko niewielka jej część trafia wraz z gazem do kolumny; pozwala to na
dozowanie próbki w ilości optymalnej dla kolumn kapilarnych o małej średnicy,
natomiast problemem jest zapewnienie stałego stopnia podziału strumienia gazu tak, by
dozowano zawsze taką samą część próbki; obecne rozwiązania pozwalają na zmianę
stopnia podziału strumienia a\
do takiego stanu, \
e dozowana jest cała próbka
(dozownik split  splitless)
" dozowniki typu on-column  w tym przypadku ciekła próbka jest dozowana poprzez
nieogrzewany dozownik bezpoÅ›rednio na kolumnÄ™ o temperaturze 20-60°C, po czym
kolumna jest ogrzewana, odparowuje rozpuszczalnik, a następnie składniki próbki;
metoda ta zmniejsza prawdopodobieństwo termicznego rozkładu związków o małej
stabilności w wy\
szych temperaturach, jednak powoduje powstanie ryzyka
zanieczyszczenia początkowego odcinka kolumny substancjami nielotnymi lub słabo
lotnymi, wprowadzanymi razem z próbką
W rutynowych analizach często stosuje się obecnie dozowniki automatyczne, które w
zaprogramowany sposób dozują poszczególne próbki. Cały proces obejmuje programowanie
kolejności i ilości nastrzyków ka\
dej próbki, płukania strzykawki i innych czynności.
2.2.3. Kolumny chromatograficzne
Współczesna chromatografia gazowa opiera się głównie na zastosowaniu tzw. kolumn
kapilarnych (o przekroju otwartym, open tubular, OT). Mo\
na wyró\
nić trzy podstawowe typy tych
kolumn:
" kolumny do chromatografii w układzie gaz  ciało stałe z porowatą warstwą adsorbentu
na ściankach (porous layer open tubular, PLOT)
" kolumny z naniesionym na ścianki nośnikiem nasyconym ciekłą fazą stacjonarną
(support coated open tubular, SCOT)
" kolumny ze ściankami pokrytymi ciekłą fazą stacjonarną (wall-coated open tubular,
WCOT)
W dalszej części instrukcji omawiane będą tylko kolumny z ciekłą fazą stacjonarną.
Kolumny kapilarne wykonane sÄ… zwykle ze stopionego kwarcu, co zapewnia im wymaganÄ…
elastyczność i trwałość. Ich długość wynosi od 10 do nawet 300 metrów, ale najpowszechniejsze są
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 8
kolumny o długości 15-60 metrów. Średnica wewnętrzna takich kolumn to zwykle 0,2-0,3 mm, zaś
warstwa filmu ciekłej fazy stacjonarnej, pokrywającej ściankę wewnętrzną, ma zwykle grubość
rzędu ułamka mikrometra. Kolumny kapilarne wyparły tzw. kolumny pakunkowe (z wypełnieniem
fazy stacjonarnej), które są krótsze i mają większą średnicę. Stało się tak ze względu na znacznie
większą sprawność kolumn kapilarnych, która pozwoliła na osiąganie znacznie lepszych
rozdziałów.
Poni\
ej zostaną omówione ciekłe fazy stacjonarne, stosowane zarówno w kolumnach typu
SCOT, jak i WCOT. Nale\
y pamiętać, \
e wybór odpowiedniej fazy stacjonarnej, dopasowanej do
właściwości próbki, ma kluczowe znaczenie dla jakości wyników analizy.
Ciekła faza stacjonarna powinna:
" rozpuszczać składniki rozdzielanej próbki,
" wykazywać chemiczną obojętność wobec składników próbki oraz nośnika,
" charakteryzować się małą lotnością oraz wysoką stabilnością termiczną w warunkach
analizy,
" małą lepkością,
" du\
ą selektywnością wobec rozdzielanych składników.
Wybór fazy stacjonarnej zale\
y od temperatury wrzenia poszczególnych związków w
próbce (faza musi wytrzymać warunki termiczne, w jakich prowadzimy analizę) oraz od ich
polarności. Stosuje się regułę mówiącą, \
e związki o danej polarności najlepiej rozpuszczają się w
substancjach o podobnej polarności. Stąd wniosek, \
e zwiÄ…zki niepolarne na niepolarnych fazach
stacjonarnych są wymywane póz
niej, ni\
zwiÄ…zki polarne o zbli\
onych temperaturach wrzenia
(związek niepolarny lepiej rozpuszcza się w fazie stacjonarnej, a zatem jego współczynnik podziału
jest większy). Analogicznie, na fazach polarnych związki polarne mają większe wartości czasów
retencji, ni\
zwiÄ…zki niepolarne o zbli\
onych temperaturach wrzenia.
Ogólny podział faz stacjonarnych ze względu na ich polarność obejmuje trzy grupy:
" fazy niepolarne  węglowodory, które dobrze rozpuszczają substancje niepolarne;
alkany majÄ… na tych fazach du\
e czasy (objętości) retencji, zaś związki polarne są
szybko eluowane; przykłady takich faz to skwalan lub Apolan-87 (Rys. 3); fazy
niepolarne charakteryzują się zwykle wysokim limitem temperatury, w której mogą
pracować
" fazy średnio polarne  głównie silikony modyfikowane ró\
nymi podstawnikami (grupy
metylowe, fenylowe, cyjanoalkilowe; Rys. 4); w zale\
ności od rodzaju podstawników i
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 9
ich ilości polarność mo\
e zmieniać się w dość szerokim zakresie; przykłady faz to OV-
1, SE-30 (dimetylosilikony), OV-3, OV-7, OV-17 (fenylosilikony o rosnÄ…cym udziale
grup fenylowych), OV-225 (25% grup cyjanopropylowych)
Rys. 3. Popularne niepolarne ciekłe fazy stacjonarne w chromatografii gazowej.
" fazy polarne  poliglikole (na przykład poliglikol etylenowy; fazy PEG oraz Carbowax),
ró\
nego rodzaju estry
Struktury faz stacjonarnych i zawartości grup modyfikujących mo\
na znalez
ć w licznych
katalogach producentów kolumn kapilarnych.
Rys. 4. Średnio polarne ciekłe fazy stacjonarne w chromatografii gazowej  silikony.
2.2.4. Detektory
Zadaniem detektora jest wykrywanie substancji, które opuszczają kolumnę
chromatograficzną. Obecność w gazie nośnym innej substancji powoduje powstanie sygnału
elektrycznego, rejestrowanego przez komputer, integrator bÄ…dz
rejestrator. Po\
Ä…dane cechy
detektora to: du\
a czułość i wykrywalność, mo\
liwie szeroki zakres liniowości wskazań (to jest,
proporcjonalności powstającego sygnału do stę\
enia związku), niski poziom szumów linii zerowej,
a tak\
e, jak w przypadku ka\
dego sprzętu, mo\
liwie niska cena i łatwość obsługi.
Detektory w chromatografii gazowej mo\
na podzielić na dwie zasadnicze grupy: detektory
uniwersalne (reagujące na związki z wielu ró\
nych grup) oraz selektywne (wykrywajÄ…ce tylko
wybrane anality).
Spośród detektorów uniwersalnych, w powszechnym u\
yciu znajduje siÄ™ detektor
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 10
płomieniowo jonizacyjny (flame ionization detector, FID). Wykrywa on związki organiczne,
natomiast nie reaguje sygnałem na substancje nieorganiczne i takie związki węgla, jak CO, CO2,
CS2, HCOOH i COCl2. Sygnał detektora FID jest proporcjonalny do liczby atomów węgla, które
nie są związane z tlenem, a więc do masy substancji. Nale\
y przy tym pamiętać, \
e wielkość
sygnału zale\
y tak\
e od charakteru substancji (zagadnienie to zostanie omówione w rozdziale
poświęconym analizie ilościowej). Detektor FID jest czuły, pozwala wykryć ju\
10-12 g substancji
badanej. Zasada działania polega na pomiarze zmian przewodności elektrycznej atmosfery
płomienia w detektorze. Jeśli w płomieniu pojawi się związek organiczny, w wyniku jego spalania
powstają karbojony. Powstający prąd jonizacyjny jest wzmacniany i rejestrowany. Płomień
uzyskuje się, stosując mieszaninę wodoru i powietrza, doprowadzanych z butli ciśnieniowych.
Odpowiedni gaz nośny dla detektora FID to azot, hel lub argon.
Innym detektorem uniwersalnym jest katarometr, czyli detektor termokondukto-
metryczny (cieplno-przewodnościowy, thermal conductivity detector, TCD). Jego działanie polega
na pomiarze ró\
nic w przewodności cieplnej czystego gazu nośnego oraz gazu opuszczającego
kolumnę. Jest to zatem detektor ró\
nicowy. Wykrywa wszystkie związki, których przewodność
cieplna ró\
ni się od przewodności gazu nośnego. Jest detektorem stę\
eniowym (sygnał jest
proporcjonalny do stÄ™\
enia substancji). Stosowane gazy nośne to wodór i hel. Wadami tego
urzÄ…dzenia sÄ…: mniejsza ni\
w przypadku detektora FID czułość (pozwala wykryć 10-7  10-8 g
substancji w cm3 fazy ruchomej), mniejszy zakres liniowości wskazań oraz konieczność
zachowania stałej temperatury detektora przez cały czas analizy (z dokładnością do dziesiątych
części stopnia Celsjusza), aby uzyskać wiarygodne wyniki.
Spośród detektorów selektywnych, na uwagę zasługują: detektor płomieniowo-
fotometryczny (flame photometric detector, FPD), słu\
ący do wykrywania związków siarki i
fosforu, detektor termojonowy (thermionic detector, TID), przydatny w analizie związków azotu i
fosforu, oraz detektor wychwytu elektronów (electron capture detector, ECD), który znalazł
zastosowanie w analizie substancji o znacznym powinowactwie elektronowym, głównie związków
halogenoorganicznych. Bli\
ej zostanie omówiony tylko ten ostatni.
Detektor ECD jest detektorem radiojonizacyjnym, a zatem zachodzi w nim proces jonizacji
analizowanych substancji za pomocÄ… promieniowania jonizujÄ…cego. y
ródÅ‚em promieniowania ² jest
63
folia z Ni. W komorze detektora znajduje się równie\
katoda oraz anoda. Gaz nośny (azot lub
argon) jest jonizowany przez czÄ…stki ²:
+
² + N2 N2 + e
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 11
Wskutek powstania elektronów otrzymujemy prąd tła, który odpowiada linii podstawowej na
chromatogramie. Jeśli do detektora trafia substancja o du\
ym powinowactwie elektronowym,
wychwytuje ona elektrony, tworzÄ…c jony ujemne:
-
X + e X
Te z kolei rekombinują z dodatnimi jonami gazu nośnego, tworząc cząsteczki obojętne:
- +
X + N2 X + N2
Powy\
sze reakcje powodujÄ… spadek natÄ™\
enia prądu tła, co w efekcie prowadzi do zarejestrowania
sygnału. Detektor ECD jest powszechnie u\
ywany w analizie chlorowcopestycydów. Wykrywa
nawet 10-14 g Cl/cm3 gazu nośnego.
Nale\
y jeszcze wspomnieć o połączeniu chromatografii gazowej z technikami
spektroskopowymi. W takim układzie mo\
na mówić albo o wykorzystaniu spektroskopów lub
spektrometrów jako detektorów w GC, bądz
te\
o wykorzystaniu chromatografu gazowego jako
układu wprowadzania próbki do przyrządu mierzącego widmo. Do analizy związków organicznych
szczególnie przydatne jest połączenie chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS),
które pozwala na uzyskanie wielu dokładnych danych na temat struktury poszczególnych związków
oraz ustalenie ich mas cząsteczkowych. Informacje na temat obecności w cząsteczce analizowanej
substancji ró\
nych grup funkcyjnych daje połączenie GC ze spektroskopią w podczerwieni (GC-
IR). Istnieją równie\
połączenia chromatografii gazowej i spektroskopii atomowej, zarówno
absorpcyjnej, jak i emisyjnej, przydatne np. w analizie związków metaloorganicznych.
2.3. Parametry opisujące jakość rozdziału i sprawność kolumny
2.3.1. Jakość rozdziału chromatograficznego
Miarą skuteczności rozdzielenia składników mieszaniny jest:
" współczynnik selektywności ą (retencja względna; zdolność fazy stacjonarnej do
rozdzielenia dwóch składników) dla sygnałów związków A i B jest wyra\
any wzorem:
tRB - tM kB
Ä… = = (11)
tRA - tM kA
" zdolność rozdzielcza kolumny RS:
tRB - tRA
RS = 2 (12)
wA + wB
gdzie: wA i wB oznaczają szerokości pików substancji A i B mierzone przy podstawie.
Rozdzielczość zale\
y od wielu czynników aparaturowych. Znaczący wpływ ma temperatura
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 12
analizy, co zostanie bli\
ej omówione w dalszej części instrukcji.
2.3.2. Sprawność kolumny  pojęcie półki teoretycznej
Sprawność kolumny decyduje o tym, jaka będzie jakość uzyskanego chromatogramu.
Wysoka sprawność objawia się ostrymi, wąskimi pikami substancji chromatografowanych i dobrym
rozdziałem mieszaniny. Miarą sprawności kolumny chromatograficznej jest wysokość równowa\
na
półce teoretycznej (WRPT lub HETP, height equivalent to a theoretical plate).
Półka teoretyczna  objętość kolumny, w której osiągany jest stan równowagi między stę\
eniami
substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i stacjonarnej. Im więcej półek teoretycznych
(mniejsza wartość WRPT) ma kolumna, tym większa jest jej sprawność.
Ka\
da kolumna składa się z N hipotetycznych półek teoretycznych, czyli:
L = NH (13)
oraz:
L
N = (14)
H
gdzie: L  długość kolumny, H  wysokość równowa\
na półce teoretycznej (WRPT).
Liczbę półek teoretycznych mo\
na obliczyć, wykorzystując w tym celu substancję testową o
współczynniku retencji k w zakresie 5-10, pod warunkiem, \
e pik tej substancji ma kształt krzywej
Gaussa. Wtedy:
2
ëÅ‚ öÅ‚
tR
ìÅ‚ ÷Å‚
N = 5,54ìÅ‚ ÷Å‚ (15)
w1/
íÅ‚ 2 Å‚Å‚
lub:
2
ëÅ‚ öÅ‚
tR
ìÅ‚ ÷Å‚
N = 16ìÅ‚ ÷Å‚ (16)
wB
íÅ‚ Å‚Å‚
gdzie: tR  czas retencji (wygodnie jest zastąpić go odległością retencji na wydruku
chromatogramu), w1/2  szerokość piku w połowie jego wysokości, wB 
szerokość piku przy podstawie (szerokości piku i czas retencji wyra\
amy
zawsze w takich samych jednostkach - czasu lub odległości).
Analogicznie obliczamy efektywną liczbę półek teoretycznych, ale zamiast całkowitych
czasów retencji u\
ywamy w tym celu czasów zredukowanych. Kolumny kapilarne osiągają
wartości 4000-5000 półek teoretycznych na metr, co czyni je kilkukrotnie bardziej sprawnymi od
kolumn pakunkowych i wielokrotnie  od kolumn do niskociśnieniowej chromatografii cieczowej.
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 13
Wartość WRPT w chromatografii podziałowej zale\
y od trzech zasadniczych czynników:
" dyfuzji wirowej gazu nośnego (A), wprost proporcjonalnej do średnicy ziaren
wypełnienia kolumny (w przypadku kolumn kapilarnych z ciekłą fazą stacjonarną  do
parametrów nośnika tej fazy),
" dyfuzji podłu\
nej (B) w fazie ruchomej (dyfuzji cząsteczek wzdłu\
kolumny w obu jej
kierunkach), zale\
nej od krętości drogi gazu nośnego w obrębie ziaren wypełnienia,
" oporu przenoszenia masy w fazie stacjonarnej (C), zale\
nego od współczynnika retencji
k, grubości filmu fazy stacjonarnej oraz od współczynnika dyfuzji danego związku w
ciekłej fazie stacjonarnej.
BiorÄ…c pod uwagÄ™ te trzy czynniki, mo\
na je połączyć w jedno uproszczone równanie,
opisujące sprawność kolumny i zwane równaniem van Deemtera:
B
H = A + + Cu (17)
u
gdzie: k
oznacza liniową prędkość przepływu gazu nośnego.
Zale\
ność ta jest równaniem hiperboli o ró\
nym przebiegu dla ró\
nych gazów nośnych (Rys. 5).
AnalogicznÄ… do wzoru (17) zale\
ność mo\
na napisać, zamieniając w równaniu wartość
prędkości przepływu gazu nośnego temperaturą. Oznacza to, \
e dana kolumna z określoną fazą
stacjonarną ma zarówno optimum termiczne, w którym osiąga maksymalną sprawność, jak i
optymalną wartość k
. Zwykle stosowane są temperatury i prędkości przepływu gazu większe, ni\

wartości optymalne, obliczone z równania van Deemtera. Wią\
e siÄ™ to z faktem, \
e pewien spadek
sprawności kolumny jest rekompensowany krótszym czasem analizy.
Zagadnienie teorii półek teoretycznych jest znacznie szerzej opisane w literaturze
poświęconej chromatografii.
Rys. 5. Zale\
ność WRPT od prędkości przepływu gazu nośnego dla azotu, helu i wodoru.
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 14
2.4. Czynniki wpływające na przebieg i jakość rozdziału
Wysoka sprawność kolumny, objawiająca się małymi wartościami WRPT, decyduje w
głównej mierze o tym, jak wyglądają piki analizowanych substancji. Im wy\
sza sprawność, tym
piki wÄ™\
sze i ostrzejsze. Aby jednak dwie substancje rozdzieliły się w wystarczającym stopniu,
wymagana jest równie\
dostateczna selektywność na danej fazie stacjonarnej (patrz wzór 11). Rys.
6 przedstawia chromatogramy uzyskane na kolumnie o tej samej sprawności, ale ró\
nej
selektywności fazy stacjonarnej wobec rozdzielanych składników.
Rys. 6. Chromatogramy tych samych związków, uzyskane podczas analizy na fazie stacjonarnej o zbyt małej (z
lewej) i wystarczającej (z prawej) selektywności [2].
Uzyskane chromatogramy wskazujÄ…, \
e w pierwszym przypadku rozdzielczość była zbyt
niska (patrz wzór 12). Przyjmuje się, \
e składniki są dobrze rozdzielone, gdy rozdzielczość jest nie
mniejsza ni\
1, natomiast rozdzielenie pików do linii podstawowej uzyskujemy przy RS=1,15.
Zakładając \
ądaną rozdzielczość i uwzględniając parametry rozdzielania, mo\
emy obliczyć ilość
półek teoretycznych N (a zatem tak\
e długość kolumny), potrzebną do osiągnięcia zało\
onej
rozdzielczości:
2
Ä… k +1
2
N = 16RS ëÅ‚ öÅ‚ëÅ‚ öÅ‚ (18)
ìÅ‚ ÷Å‚ìÅ‚ ÷Å‚
íÅ‚Ä… -1Å‚Å‚íÅ‚ k Å‚Å‚
gdzie: zdolność rozdzielcza kolumny RS, ą  współczynnik selektywności,
k  współczynnik retencji.
Znaczny wpływ na rozdział mieszaniny składników mogą mieć procesy zachodzące na
powierzchni wewnętrznych ścianek kolumny, które zostały pozbawione warstwy ciekłej fazy
stacjonarnej. Im dłu\
szy czas u\
ywania kolumny i bardziej drastyczne warunki analizy (wysoka
temperatura), tym większe fragmenty ścianki kolumny mogą być odsłaniane. Sprawia to, \
e zwiÄ…zki
o większej polarności (zawierające grupy hydroksylowe, aminowe czy karboksylowe) są
adsorbowane na powierzchni ścianki kolumny. Nale\
y pamiętać, \
e szklane i kwarcowe kolumny
kapilarne wykazują aktywność adsorpcyjną ze względu na obecność na ich powierzchni grup
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 15
silanolowych. Efektem powy\
ej opisanego zjawiska mo\
e być: zmiana czasów retencji związków,
poszerzenie pików (związane ze zwiększeniem WRPT), zmniejszenie powierzchni pików
(powoduje błędy w analizie ilościowej) i deformacja kształtu sygnałów (tzw. ogonowanie, Rys. 7).
Wszystkie te zjawiska zaburzają uzyskane chromatogramy i mogą prowadzić do błędnej
interpretacji uzyskanych wyników. Związki zawierające w swej budowie wymienione grupy
funkcyjne często analizuje się w postaci pochodnych, co nie tylko ułatwia analizę np. poprzez
zwiększenie lotności, ale równie\
niweluje w du\
ym stopniu wspomniane zakłócenia.
Rys. 7. Deformacje kształtu sygnałów chromatograficznych powstałe: (a) w wyniku przeładowania kolumny
(wprowadzenia zbyt du\
ej ilości związku na kolumnę); (b) z powodu oddziaływań o charakterze adsorpcyjnym
ze ściankami kolumny.
Jakość kolumn kapilarnych pod kątem występowania omówionych zjawisk adsorpcyjnych
mo\
na ocenić, stosując test Groba. Polega on na przeprowadzeniu analizy mieszaniny, zawierającej
ściśle określone ilości konkretnych związków chemicznych o ró\
nych właściwościach. Jedna
analiza z mo\
liwością zastosowania programu temperaturowego pozwala na oszacowanie, w jakim
stopniu zachodzi adsorpcja na ściankach kolumny.
Na jakość rozdziału wpływają tak\
e inne czynniki aparaturowe, takie jak ró\
nego rodzaju
procesy dyfuzyjne występujące w dozowniku i w połączeniu kolumny z detektorem. Wszelkie
przestrzenie, do których gaz nośny ma utrudniony dostęp oraz ró\
nice w średnicach przekroju
przewodów zwiększają wpływ tych efektów na jakość rozdziału.
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 16
2.4.1. Wpływ temperatury na jakość rozdziału
Temperatura analizy jest, obok rodzaju kolumny i fazy stacjonarnej, czynnikiem
decydującym o jakości uzyskanych wyników. Wybór odpowiedniej temperatury kolumny zale\
y od
temperatury wrzenia analizowanych związków oraz od zastosowanej fazy stacjonarnej. Nale\
y
pamiętać, aby sprawdzić limit temperatury dla kolumny, której u\
ycie planujemy. Generalnie
stosuje siÄ™ temperatury nieco ni\
sze ni\
maksymalne dopuszczalne. Polarne fazy stacjonarne majÄ…
zwykle ni\
sze limity temperatury ni\
fazy niepolarne. Dostępne są kolumny do
wysokotemperaturowej chromatografii gazowej (HT-GC), których limity przekraczają nawet
400°C. Kolumny takie, oznaczane literami HT (np. DB-1HT, RTX-1HT), posiadajÄ… zazwyczaj
niepolarne fazy stacjonarne.
Temperatury analizy w chromatografii podziałowej są zwykle nieco ni\
sze od temperatury
wrzenia analizowanych substancji. Dobór sposobu analizy zale\
y w du\
ym stopniu od
spodziewanych ró\
nic w temperaturach wrzenia analizowanych związków. Mo\
liwe sÄ… dwie
podstawowe metody analizy:
" analiza w stałej temperaturze (w izotermie)  gdy temperatury wrzenia poszczególnych
składników nie ró\
nią się o więcej ni\
kilkadziesiÄ…t stopni Celsjusza,
" analiza w programowanej temperaturze, polegajÄ…ca na podwy\
szaniu temperatury
kolumny o staÅ‚Ä… wartość, zwykle od 1 do 10°C na minutÄ™; czÄ™sto na poczÄ…tku i koÅ„cu
takiej analizy stosuje się izotermy (w temperaturze startowej oraz końcowej).
W obu przypadkach, znalezienie optymalnych warunków analizy polega na znalezieniu "złotego
środka" pomiędzy czasem analizy a jakością uzyskanego chromatogramu.
Analiza w izotermie wymaga dobrego dopasowania temperatury procesu, aby zarówno czas
analizy, jak i jakość uzyskanych wyników były zadowalające. Nale\
y pamiętać, \
e wy\
sza
temperatura pozwala skrócić czas analizy, ale pogarsza rozdzielczość. Niska temperatura z kolei
pozwala na lepsze rozdzielenie składników mieszaniny, ale wydłu\
a czas analizy i powoduje
poszerzenie i asymetryczność pików. W skrajnych przypadkach zbyt niska temperatura mo\
e nie
pozwolić na elucję wszystkich składników, natomiast zbyt wysoka  uniemo\
liwić rozdzielenie
substancji, które będą eluowały prawie w tym samym czasie. W praktyce, dla mieszanin związków
ró\
niÄ…cych siÄ™ temperaturÄ… wrzenia o okoÅ‚o 100°C i wiÄ™cej, znalezienie optymalnej temperatury
analizy w izotermie często okazuje się niemo\
liwe. W takim przypadku, nale\
y zastosować analizę
w programowanej temperaturze.
Liniowy wzrost temperatury podczas analizy przynosi wiele korzyści. Po pierwsze 
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 17
mo\
liwe jest rozpoczęcie chromatografowania od tak niskiej temperatury, \
e wszystkie zwiÄ…zki
zatrzymają się na początku kolumny i będą przez nią migrować wraz ze wzrostem temperatury.
Dzięki temu unikamy stosowania zbyt wysokiej temperatury początkowej, powodującej słabe
rozdzielenie składników mieszaniny o najni\
szych temperaturach wrzenia. Po drugie  mo\
emy tak
dobrać szybkość wzrostu temperatury, \
e wszystkie składniki zostaną rozdzielone w zbli\
ony
sposób i w rozsądnym czasie. Nale\
y pamiętać, \
e im szybszy wzrost temperatury, tym gorszy efekt
rozdzielania i krótszy czas analizy. Do analizy du\
ej grupy związków o skrajnie ró\
nych
temperaturach wrzenia (a taki charakter mają często próbki naturalne), analiza w programowanej
temperaturze jest jedynym mo\
liwym wyborem, pozwalajÄ…cym na zadowalajÄ…ce rozdzielenie
wszystkich składników w rozsądnym czasie.
Analiza w programowanej temperaturze wymaga stosowania faz stacjonarnych o du\
ej
stabilności termicznej w szerokim zakresie temperatur. Mniej stabilne fazy mogą być stopniowo
wynoszone z kolumny wraz ze wzrostem temperatury, przez co wyniki analiz ulegajÄ… pogorszeniu,
a czas \
ycia kolumny bardzo siÄ™ skraca. Widocznym efektem tego zjawiska jest dryf (podnoszenie
siÄ™) linii podstawowej chromatogramu.
Rys. 8. Chromatogramy mieszanin n-alkanów w: mo\
liwie dobrze dobranej izotermie (a, zwróć uwagę na
poszerzenie ostatnich pików), w izotermie w zbyt wysokiej temperaturze (b) oraz w programie temperaturowym
(c) [2].
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 18
2.5. Analiza jakościowa i ilościowa w chromatografii gazowej.
2.5.1. Analiza jakościowa
Chromatografia gazowa nie jest idealnym narzędziem do identyfikacji rozdzielanych
substancji, jednak daje pewne mo\
liwości w analizie jakościowej. Podstawowym sposobem
postępowania jest wykorzystywanie parametrów retencji i porównywanie ich z danymi dostępnymi
w literaturze. Często stosuje się:
" względne czasy retencji, wyznaczane wobec określonej substancji
" indeksy retencji (patrz wzory 9, 10)
Nale\
y pamiętać, \
e wszelkie parametry retencji sÄ…, dla danego zwiÄ…zku, charakterystyczne na
określonej (lub bardzo podobnej) fazy stacjonarnej. W pewnym stopniu zale\
Ä… te\
od warunków
analizy, głównie od temperatury.
ZwiÄ…zki organiczne nale\
Ä…ce do jednego szeregu homologicznego (szereg homologiczny
tworzą związki ró\
niÄ…ce siÄ™ w budowie jedynie kolejnymi grupami  CH2  ) wykazujÄ… ciekawÄ…
cechÄ™. Zale\
ność logarytmów ich zredukowanych czasów bądz
objętości retencji od liczby atomów
węgla lub temperatury wrzenia ma przebieg w przybli\
eniu prostoliniowy, jak przedstawiono to na
Rys. 9. Jeśli mamy dane retencyjne dwóch związków z szeregu homologicznego, mo\
emy w miarÄ™
dokładnie przewidzieć parametry retencyjne innych związków z tego szeregu.
Rys. 9. Zale\
ność logarytmów zredukowanych objętości retencji (lub zredukowanych czasów retencji) od liczby
atomów węgla w cząsteczce dla związków z jednego szeregu homologicznego. Linia przerywana wskazuje na
odchylenia od prostoliniowości tej zale\
ności, istniejące dla pierwszych związków szeregu. Podobne odchylenia
wykazujÄ… homologi o bardzo du\
ych masach czÄ…steczkowych.
Stosunkowo du\
e mo\
liwości daje wykorzystanie detektorów selektywnych. U\
ycie detektora
ECD pozwala na wykrycie nawet bardzo małych ilości związków chlorowcopochodnych w
mieszaninie. Podobnie detektor FPD słu\
y do analizy związków organicznych zawierających siarkę i
fosfor, a detektor termojonowy pozwala selektywnie wykrywać związki zawierające fosfor lub azot.
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 19
Nieporównywalnie większe mo\
liwości w porównaniu z wy\
ej wymienionymi metodami
mają układy łączące chromatografię gazową z metodami spektroskopowymi. W analizie związków
organicznych połączenie GC ze spektrometrią mas (GC-MS) jest obecnie rutynowo
wykorzystywane we wszelkich analizach, szczególnie skomplikowanych mieszanin pochodzenia
naturalnego. Mo\
liwość zarejestrowania widm mas poszczególnych związków połączona z
otrzymaniem parametrów retencyjnych substancji daje bardzo du\
e mo\
liwości ustalenia struktury
związku organicznego. Dodatkowe informacje, często w pełni wystarczające do identyfikacji
analizowanych substancji, mo\
na otrzymać dzięki analizie ró\
nego rodzaju pochodnych. Równie\

cenne informacje, chocia\
rzadko wystarczające do pełnej identyfikacji związków, daje połączenie
GC-IR, które pozwala często na określenie przynale\
ności badanych substancji do danej grupy
związków organicznych.
2.5.2. Analiza ilościowa
Chromatografia gazowa jest powszechnie wykorzystywana do wykonywania analizy
ilościowej nawet bardzo zło\
onych mieszanin. Warunkami wykonania poprawnych pomiarów są:
zachowanie stałych warunków analizy (jak np. stały przepływ gazu nośnego, stała lub zmieniająca
się o stałą wartość temperatura kolumny), mo\
liwie du\
a powtarzalność kolejnych analiz,
znajomość sposobu, w jaki detektor reaguje na konkretne związki. Du\
e znaczenie ma zakres
liniowości wskazań detektora (zakres mas lub stę\
eń, dla których odpowiedz
detektora jest
liniowa). W obrębie tego zakresu powierzchnia lub wysokość piku substancji jest wprost
proporcjonalna do masy/stÄ™\
enia zwiÄ…zku. Najpowszechniej wykorzystywanym detektorem w
analizach ilościowych jest detektor płomieniowo-jonizacyjny, dlatego te\
omawiane zagadnienia
będą dotyczyły głównie tego detektora.
Najdokładniejszą metodą wyznaczania odpowiedzi detektora jest określanie powierzchni pików.
Wysokości pików są mniej przydatne, gdy\
w przypadku, gdy część sygnałów jest poszerzona, uzyskane
wartości nie będą proporcjonalne do udziału poszczególnych substancji w mieszaninie (patrz Rys. 8a).
Obecnie powierzchnie pików są zwykle wyznaczane automatycznie przez komputer lub rejestrator. Jeśli
chcemy obliczyć powierzchnię sygnału symetrycznego, mo\
emy u\
yć jednego ze wzorów:
S = hw1/ 2h (19a)
S = 0,5hwb (19b)
gdzie: S  powierzchnia piku, h  jego wysokość, w1/2h  szerokość w połowie
wysokości, wb  szerokość przy podstawie.
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 20
Powierzchnię sygnału niesymetrycznego obliczamy ze wzoru:
w0,15 + w0,85
S = h (20)
2
gdzie: w0,15 i w0,85 oznaczają szerokość piku na 15 i 85% jego wysokości.
Jak ju\
wspomniano, detektor FID nie reaguje jednakowo na takie same masy ró\
nych
substancji. Aby otrzymane wyniki analiz ilościowych odpowiadały rzeczywistości, wprowadza się
współczynniki odpowiedzi (korekcyjne) f. Współczynnik korekcyjny jest liczbą, przez którą
nale\
y pomno\
yć powierzchnię piku, aby uzyskać wartość wprost proporcjonalną do masy
związku. Wartości te ustala się wobec głównego składnika próbki lub stosowanego wzorca (dla
tego zwiÄ…zku przyjmujemy f = 1). W takim przypadku:
mS YS
= f (21)
mW YW
stÄ…d:
mSYW
f = (22)
mWYS
gdzie: mS i mW oznaczają masę substancji badanej i wzorca, f  współczynnik
odpowiedzi, YS i YW  powierzchnie lub wysokości pików substancji i wzorca.
Ró\
nice we wskazaniach detektora FID dla ró\
nych substancji mo\
na zaobserwować,
analizując roztwór zawierający równe masy tych substancji. Odpowiedzi detektora (a zatem
powierzchnie pików) nie będą jednakowe. Analizując zło\
one mieszaniny związków pochodzenia
naturalnego, dla których trudno zdobyć wzorce, często przyjmuje się, \
e wartości współczynników
odpowiedzi są jednakowe (równe 1) dla wszystkich substancji. Jest to z
ródłem pewnego błędu. Aby
zminimalizować jego znaczenie, stosuje się wzorce dla ka\
dego szeregu homologicznego, z którego
związki są obecne w próbce. Współczynniki odpowiedzi dla homologów, które nie ró\
niÄ… siÄ™
zbytnio masą (liczbą atomów węgla w cząsteczce), są w przybli\
eniu jednakowe.
Istnieje kilka metod analizy ilościowej, stosowanych w chromatografii gazowej:
" metoda normalizacji wewnętrznej,
" metoda kalibracji bezwzględnej,
" metoda dodatku wzorca,
" metoda wzorca wewnętrznego.
Metoda normalizacji wewnętrznej polega na wyznaczeniu udziału procentowego wszystkich
substancji w próbce. Powierzchnie sygnałów mierzy się, a ich sumę przyjmuje za 100% próbki.
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 21
Powierzchnia sygnału związku Ai w stosunku do sumy powierzchni wszystkich sygnałów
odpowiada zawartości związku w próbce:
Ai
%i = 100 (23)
A
"
Jeśli analizujemy związki zbli\
one strukturalnie, nie jest konieczne wyznaczanie współczynników
odpowiedzi. Dla substancji o ró\
nej budowie nale\
y je wyznaczyć, w przeciwnym wypadku
otrzymamy tylko szacunkowe wyniki.
Metoda kalibracji bezwzględnej słu\
y do określania ilości jednego lub kilku składników próbki,
które są zidentyfikowane. Dla ka\
dego związku, którego ilość w próbce chcemy wyznaczyć,
sporządza się kilka (3-5) roztworów o ró\
nych stÄ™\
eniach i kilkukrotnie wykonuje siÄ™ analizÄ™
chromatograficznÄ… dla ka\
dego z tych roztworów. Następnie oblicza się średnią powierzchnię lub
wysokość piku i wykreśla krzywą kalibracyjną, przedstawiająca zale\
ność powierzchni piku od
stÄ™\
enia substancji. Wynik analizy próbki o nieznanym stę\
eniu zwiÄ…zku odczytywany jest z krzywej.
Problemem w tej metodzie jest uzyskanie takiej powtarzalności dozowania kolejnych próbek, by
krzywa kalibracyjna była wiarygodna. Kłopotliwe jest ju\
pobranie za ka\
dym razem takiej samej
objętości roztworu do strzykawki. Nale\
y te\
pamiętać, \
e dozownik ze spliterem, powszechnie
stosowany w chromatografii gazowej, nie utrzymuje w czasie stałego stopnia podziału strumienia
gazu nośnego, a zatem nie wprowadza zawsze takiej samej ilości próbki na kolumnę. Sprawia to, \
e
zastosowanie omawianej metody w analizie ilościowej za pomocą GC jest niewielkie.
Metoda dodatku wzorca polega na wykonaniu dwóch równoległych analiz  badanej próbki
(próbka A) oraz takiej samej próbki, do której dodana została ściśle określona ilość wzorca,
będącego jednocześnie oznaczaną substancją (próbka B). Porównując uzyskane chromatogramy,
Å‚atwo zauwa\
yć, \
e w próbce B udział analitu będącego jednocześnie wzorcem jest większy. Jest to
oczywiście związane z faktem dodania pewnej jego ilości do próbki, a przyrost odpowiedzi
detektora jest wprost proporcjonalny do tej ilości. Mierzymy powierzchnie sygnałów analitu-
wzorca (A) oraz innej analizowanej substancji (B) w pierwszej (YA oraz YB) i drugiej (YA* oraz YB*)
próbce. Mo\
emy zatem napisać:
mA YA
= (24a)
mB YB
oraz:
*
mA - mWZ YA
= (24b)
*
mB YB
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 22
Pierwsze równanie dotyczy próbki bez dodatku wzorca, drugie  próbki z dodanym wzorcem. Po
rozwiązaniu układu równań, utworzonego z (24a) i (24b) otrzymujemy:
*
mWZYAYB
mA = (25a)
* *
YAYB - YAYB
oraz
YB
mB = mA (25b)
YA
KorzystajÄ…c z powy\
szych równań mo\
na obliczyć ilość wszystkich analitów obecnych w próbce.
Wprowadzenie współczynników odpowiedzi dodatkowo komplikuje obliczenia (jeśli chcesz to
sprawdzić, rozwią\
układ równań, wprowadzając te współczynniki). Analiza bez współczynników
będzie wiarygodna tylko dla substancji bardzo zbli\
onych strukturalnie (np. nale\
Ä…cych do jednego
szeregu homologicznego).
Metoda wzorca wewnętrznego jest najbardziej rozpowszechnioną i dającą najbardziej wiarygodne
wyniki metodą analizy ilościowej w chromatografii gazowej. Polega na dodaniu do próbki
określonej ilości wzorca wewnętrznego, który nie jest jednym z analizowanych związków. Jeśli
analiza obejmuje szereg etapów wstępnych, typu ekstrakcja czy oczyszczanie, wzorzec nale\
y
dodać przed pierwszym z nich, na samym początku procesu analitycznego. Pozwala to na
zniwelowanie strat analitów, występujących na ka\
dym etapie analizy, o ile stopień odzysku wzorca
i analizowanych substancji będzie zbli\
ony. Zwykle stosuje siÄ™ wzorce mo\
liwie zbli\
one
strukturalnie do związków obecnych w próbce i o podobnej temperaturze wrzenia. Warunkiem jest
rozdzielanie się wzorca i analitów podczas analizy chromatograficznej. Jeśli znamy współczynniki
odpowiedzi badanych związków wobec wzorca, stosujemy wzór (21). Często nie mamy mo\
liwości
wyznaczenia współczynników (np. z powodu niedostępności wzorców), wtedy przyjmuje się, \
e dla
wszystkich związków f = 1.
2.5. Wybrane wielkości w statystycznej analizie wyników
Analiza statystyczna pozwala na ocenę uzyskanych wyników w kategoriach
matematycznych. Poni\
ej przedstawione zostanÄ… tylko wybrane, podstawowe wzory.
" Średnia arytmetyczna z n wyników wyra\
ana jest wzorem:
xi
"
x = (26)
n
gdzie xi oznacza pojedynczy wynik.
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 23
" Odchylenie standardowe pojedynczego wyniku (SD, standard deviation), które jest
miarą rozrzutu wartości indywidualnych wokół średniej, obliczamy ze wzoru:
2
- x)
"(xi
SD = (27)
n -1
" Błąd standardowy, zwany odchyleniem standardowym średniej arytmetycznej (SE,
standard error), wyra\
a siÄ™ wzorem:
2
- x)
SD
"(xi
SE = = (28)
n(n -1)
n
" Względne odchylenie standardowe średniej arytmetycznej (RSE, relative standard
error) określa wielkość błędu standardowego wobec wartości średniej i wyra\
ane jest w
%:
SE
RSE = 100 (29)
x
3. Część doświadczalna
Analizowane będą roztwory trzech związków (toluen, etylobenzen, p-ksylen), których
struktury oraz gęstości są podane na Rys. 10. Jako rozpuszczalnik zastosowano disiarczek węgla
CS2 (zastanów się, dlaczego). Wzorcem wewnętrznym jest izooktan (2,2,4-trimetylopentan) o
gęstości 0,6919 g/ml. Związki zawarte w próbce na kolumnie z niepolarną fazą stacjonarną eluują w
następującej kolejności: izooktan, toluen, etylobenzen, p-ksylen. Zastanów się, jaka własność
izooktanu sprawia, \
e jest on wymywany z kolumny jako pierwszy.
Rys. 10. Wzory strukturalne i gęstości związków analizowanych w ćwiczeniu.
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 24
3.1. Chromatograf gazowy i warunki analizy chromatograficznej
" chromatograf gazowy Varian Aerograph 1440 z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym,
" kolumna kapilarna WCOT FUSED SILICA o wymiarach 30 m x 0,25 mm, z filmem
fazy stacjonarnej CP SIL 5CB o gruboÅ›ci 0,25 µm,
" temperatura dozownika i detektora 175°C, kolumny 30°C,
" gaz nośny  argon
3.2. Warunki pracy i obsługa integratora
" model ChromJet Integrator (Thermo Separation Products)
" po włączeniu integratora nale\
y ustawić następujące parametry: atenuacja 16 (ATTEN
16 Enter), przesuw papieru 1 (CHART SPEED 1 Enter), PLOT AUTO
" do rozpoczęcia analizy i jej zakończenia słu\
y przycisk INJ/END A; raport zostanie
wydrukowany automatycznie
3.3. Sprzęt i odczynniki
" roztwory wzorcowe i badane:
PRÓBKA BADANA o nieznanych stę\
eniach toluenu, etylobenzenu i p-ksylenu,
PRÓBKA Z DODATKIEM WZORCA (próbka badana + 10 µl toluenu/10 ml
roztworu),
PRÓBKA DO WYZNACZANIA WSPÓA
CZYNNIKÓW ODPOWIEDZI (zawiera
po 20 µl izooktanu, toluenu, etylobenzenu i p-ksylenu w 10 ml roztworu),
PRÓBKA Z WZORCEM WEWN
TRZNYM (próbka badana + 10 µl izooktanu/10
ml roztworu);
" disiarczek węgla,
" strzykawka o pojemnoÅ›ci 10 µl.
3.4. Obsługa chromatografu i integratora
" odkręcić zawory argonu, powietrza i wodoru.
" włączyć zasilanie chromatografu.
" włączyć grzałkę dozownika i detektora.
" po osiÄ…gniÄ™ciu przez detektor temperatury 100°C zapalić palnik detektora FID (zapalenie
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 25
go w ni\
szej temperaturze spowoduje kondensacjÄ™ pary wodnej w obudowie) ; ww.
czynności wykonuje prowadzący!,
" włączyć i zaprogramować integrator według wskazówek z punktu 3.2.
" po ustaleniu siÄ™ temperatury dozownika i detektora na poziomie 170-180°C rozpocząć
analizy; UWAGA  DOZOWNIK JEST GOR
CY!
" po skończonych analizach wyłączyć grzałkę i zasilanie chromatografu oraz zakręcić
zawory na butlach z gazami; wykonuje prowadzÄ…cy!
3.5. Wykonanie analiz
" sprawdzić, czy przez kolumnÄ™ przepÅ‚ywa gaz noÅ›ny, wykonujÄ…c nastrzyk okoÅ‚o 1 µl
toluenu,
" wykonać analizę próbki badanej (A) oraz próbki z dodatkiem wzorca (B); wykonać 4
powtórzenia ka\
dej z próbek, nastrzykując je na przemian,
" pięciokrotnie wykonać analizę próbki do wyznaczania współczynników odpowiedzi (C),
" wykonać pięć analiz próbki z wzorcem wewnętrznym (D).
Ka\
da analiza trwa około 6-7 minut. Nale\
y nastrzykiwać po okoÅ‚o 1,5 µl próbki za pomocÄ…
strzykawki 10 µl. StrzykawkÄ™ nale\
y myć w disiarczku węgla. U\
ycie innych rozpuszczalników
spowoduje pojawienie się na chromatogramie dodatkowego sygnału. Raport z analizy obejmuje
szereg wielkości, w tym czasy retencji oraz powierzchnie pików.
4. Opracowanie wyników
" Na podstawie podanych wy\
ej gęstości związków, oblicz masy toluenu, etylobenzenu,
p-ksylenu oraz izooktanu w próbkach C i D oraz masę toluenu dodanego do próbki
badanej (B).
" Zidentyfikuj poszczególne związki na chromatogramach.
" Oblicz udział procentowy trzech badanych związków w próbce badanej, korzystając z
wyników analiz dla próbki A. Bierz pod uwagę tylko powierzchnie pików tych
substancji. Wyniki przedstaw jako średnie arytmetyczne.
" Korzystając z wyników analiz dla próbek A i B, oblicz masy poszczególnych analitów w
próbce badanej, korzystając z wzorów podanych przy opisie metody dodatku wzorca.
Wykonaj obliczenia dla ka\
dej pary pomiarów, następnie policz średnie arytmetyczne
Ćwiczenie 2. GC  porównanie metod analizy ilościowej 26
oraz odchylenia standardowe tych średnich (wzór 28). Oceń, jaki jest rozmiar
względnych odchyleń standardowych średniej (wzór 29). Czy analizy były
powtarzalne (względny błąd standardowy na poziomie 5% mo\
na uznać za
zadowalajÄ…cy wynik)? Czy uzyskane wyniki pokrywajÄ… siÄ™ z wynikami uzyskanymi
przy wyznaczaniu udziału procentowego związków w próbce badanej?
" Dla ka\
dej analizy próbki C oblicz współczynniki odpowiedzi trzech badanych
związków względem izooktanu (wzór 22). Pamiętaj, \
e dla izooktanu przyjmujemy f = 1.
" Oblicz masy analitów w próbce, korzystając z wyników analiz próbki D (wzór 21).
Pamiętaj o wyznaczonych wcześniej współczynnikach odpowiedzi! Wyniki przedstaw
jako średnie arytmetyczne. Oblicz SE i RSE dla tych średnich. Jaki jest błąd analizy?
" Porównaj wyniki z analiz próbki D (metoda wzorca wewnętrznego) z wynikami
uzyskanymi przy zastosowaniu metody dodatku wzorca. Z czego wynikają ró\
nice w
uzyskanych wartościach? Która metoda daje Twoim zdaniem bardziej wiarygodne
wyniki i dlaczego?
5. Literatura
1. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa 2005
2. Z. Witkiewicz, J. Hepter, Chromatografia gazowa, WNT, Warszawa 2001
3. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 2005