Wykład 7 biotechnologia leków 17.04.08

Bioprocesy i bioreaktory

Biotechnologia - interdyscyplinarna dziedzina nauki i działalności przemysłowej, która obejmuje szereg dyscyplin szczegółowych zajmujących się wykorzystaniem żywych organizmów lub ich części składowych do otrzymywania produktów powszechnego użytku, takich jak: szczepionki, antybiotyki i produkty spożywcze.

Dyscypliny naukowe wykorzystywane w dziedzinie biotechnologii można podzielić na trzy grupy:

Zmierzające do uzyskania i poznania właściwości organizmu (szczepu)produkcyjnego:

-mikrobiologia

-biochemia

-biologia molekularna

-biofizyka

-biologia komórki

-genetyka

-inżynieria genetyczna

Służące do wykorzystania organizmu lub jego cześć do opracowania i prowadzenie przemysłowego procesu produkcyjnego

-fizjologia

-technologia fermentacyjna

-inżynieria bioprocesowa

-technologia chemiczna

-techniki separacyjne

Wykorzystywane do zagospodarowania produktu biosyntezy oraz racjonalnego projektowania nowych produktów szczególnie leków:

-chemia bioorganiczna

-technologia chemiczna

-inżynieria chemiczna

-chemia teoretyczna i obliczeniowa

-biochemia

-biofizyka

Bioprocesy - przemiany chemiczne katalizowane przez enzymy wyizolowane z organizmów żywych lub przebiegające w obrębie organizmu żywego, komórek roślinnych, zwierzęcych oraz struktur subkomórkowych

Rodzaje bioprocesów:

1. Biosynteza - katalizowana enzymatycznie synteza związków organicznych organicznych podstawowych (pierwotnych) i wtórnych przemian biochemicznych zachodzących w organizmach żywych.

Zastosowanie:

-wytwarzanie licznych leków: antybiotyki, witaminy, hormony, insulina ludzka i zwierzęca, interferon, interleukiny, przeciwciała monoklonalne.

-otrzymywanie artykułów przemysłowych: barwniki, rozpuszczalniki, aminokwasy, polisacharydy

-wytwarzanie biomasy paszowej z produktów odpadowych (np. z melasy i serwatki)

2. Biotransformacja (biokonwersja) - proces przekształcania struktury chemicznej związków organicznych przy udziale mikroorganizmów lub wyizolowanych enzymów

W przemyśle Biotransformacja służy do prowadzenie katalizowanych przez enzymy drobnoustrojowe, następujących jednostkowych procesów chemicznych:

-utlenianie- epoksydacja, hydroksylacja

-redukcja - kwasów, aldehydów, związków nienasyconych

-hydroliza - amidów, estrów

-kondensacja- tworzenie nowych wiązań C-C, estryfikacja, fosforyzacja, aminacja, glikozylacja

-izomeryzacja - przemieszczenie wiązań podwójnych, grup hydroksylowych, procesy racemizacji i epimeryzacji

-rozrywanie wiązań - dekarboksylacja i dealkilacja

Zastosowanie:

-otrzymywanie kwasu glukozowego z glukozy ( jeden z etapów otrzymywania wit. C)

-produkcja leków sterydowych poprzez biotransformacje mikrobiologiczna sterydów roślinnych

-produkcja antybiotyków

3. Fermentacja - przemiany biochemiczne, w których węglowodany lub inne związki energotwórcze ulegają utlenieniu w warunkach beztlenowych np. fermentacja:

- alkoholowa (rozkład glukozy do etanolu)

- mlekowa (redukcja kwasu pirogronowego do mlekowego)

- octowa (utlenienie etanolu do kwasu octowego)

4. Biohydroliza - procesy hydrolizy związków organicznych przy udziale enzymow z klasy hydroliz

5. Biodegradacja - proces naturalnego rozkładu związków chemicznych przez organizmy żywe (głównie bakterie)

Zastosowanie:

-mikrobiologiczne oczyszczanie ścieków komunalnych i przemysłowych

-wytwarzanie biomasy paszowej dla zwierząt hodowlanych

-produkcja biogazu

6. Biokumulacja - mikrobiologiczna kumulacja głównie jonów metalu ze źródeł rozproszonych np. niskoprocentowych rud i odpadów hutniczych (ważne dla przemysłu metalurgicznego) - tzw. proces mikrobiologicznego ługowania lub bioługowania.

Wymagania dotyczące mikroorganizmów stosowanych w procesach biotechnologicznych

We wszystkich typach bioprocesów nie stosuje się dzikich szczepów drobnoustrojów, lecz ich wersje przemysłowe, zmodyfikowane genetycznie na drodze:

-mutacji

-hybrydyzacji komórek

-rekombinacji DNA metodami inżynierii genetycznej

Wyselekcjonowane szczepy produkcyjne puszcza być odpowiednio utrzymywane i przechowywane:

- do krótkotrwałego przechowywania (do 1 miesiąca) wykorzystuje się kultury na skosach agarowych

-do długotrwałego przechowywania przygotowuje się formy przetrwalnikowe (spory, gonidia) komórek wegetatywnych z hodowli będącej w końcowym etapie wykładniczej fazy wzrostu

Podczas przechowywania szczepów konieczne jest okresowe sprawdzanie ich stabilności genetycznej i homogeniczności, stosuje się następujące metody:

-nanoszenie na podłoża agarowe- ocena wizualna i ilościową kolonii odmiennych morfologicznie od szczepu wyselekcjonowanego

- identyfikacja genotypu i fenotypu szczepu z użyciem podłoży selektywnych

-badanie długotrwałej stabilności genetycznej w ściśle określonych warunkach w hodowlach ciągłych.

W przypadku wystąpienia genetycznych niestabilności lub niehomogenicznosci wymagana jest reselekcja szczepu produkcyjnego z pojedynczych kolonii

W skali przemysłowej hodowla szczepu produkcyjnego prowadzona jest w warunkach

aseptycznych z użyciem pożywek płynnych w bioreaktorach.

Bioreaktory - urządzenie skonstruowane w sposób umożliwiający kontrole procesu biotechnologicznego jego optymalny przebieg (pomiar i regulacje wymaganych parametrów procesu) w warunkach maksymalnego ograniczenia lub całkowitego wyeliminowania możliwości zakażeń.

Typu bioreaktorów:

W zależności od skali procesu:

-laboratoryjne (pojemność od kilku do kilkudziesięciu dm3) - wykonane całkowicie lub częściowo ze szkła

- przemysłowe (pojemność od kilkudziesięciu do kilkuset dm3) - najczęściej wykonane ze stali kwasoodpornej.

W zależności od sposobu prowadzenia procesu:

- do procesów okresowych (dla hodowli płynnych)

- do procesów ciągłych (dla hodowli płynnych)

-do procesów z komórkami immobilizowanymi (unieruchomienie komórek na odpowiednim nośniku)

W zależności od sposobu mieszania:

-z mieszaniem mechanicznych - mieszadła turbinowe, łopatkowe, śmigłowe, śrubowe

- z mieszaniem pneumatycznym- wykorzystanie strumienia gazu - bełotka, iniektor.

- z mieszaniem hydraulicznym - wykorzystanie strumienia cieczy - pompa eżektor

W zależności od warunków hodowli drobnoustrojów:

-do hodowli na powierzchni podłoża

-z nośnikiem stałym

-do hodowli wgłębnej

W zależności od rodzaju bioreaktora:

-do klasycznych procesów mikrobiologicznych

-do hodowli komórek organizmów wyższych w zawiesinie

-do hodowli komórek wyższych na nośniku

-do procesów enzymatycznych enzymatycznych roztworze

-do procesów z użyciem biokatalizatorów unieruchomionych

W zależności od warunków tlenowych:

-do procesów beztlenowych

-do procesów tlenowych

Mieszanie i napowietrzanie w bioreaktorach

W bioreaktorach wyróżniamy 2 typy mieszania:

-mikromieszanie- odbywa się na poziomie molekularnym lub bliskim molekularnego i może być scharakteryzowane przez współczynnik dyfuzji efektywnej.

-makromieszanie- rozpatrywane na poziomie bioreaktora i dotyczy warunków przepływu (cyrkulacji, przemieszczania się) mieszaniny cieczy, gazu i komórek.

Warunki mieszania i napowietrzania zależą od:

-konstrukcji bioreaktora

-szybkości obrotów mieszadła

-szybkości doprowadzania powietrza i stopnia jego dyspersji

-sposobu wzrostu drobnoustrojów

-stężenia biomasy

Podstawowym parametrem technologicznym w klasycznych bioreaktorach jest szybkość obrotów mieszadła, która musi być dostosowana do pojemności bioreaktora.

Odpowiednie mieszanie zapewnia dobre warunki wymiany gazowej (warunki natlenienia) niezbędnej dla przebiegu każdego procesu biotechnologicznego.

Poprawę warunków natlenienia hodowli można uzyskać przez zwiększenie przepływu powietrza lub szybkości absorpcji tlenu w podłożu. Nadmierne mieszanie może jednak powodować mechaniczne niszczenie komórek biomasy oraz wytwarzanie zbyt dużej ilości piany.

Piana jest heterogenicznym układem pęcherzyków dużej ilości gazu, które są rozproszone w malej ilości cieszy. Substancje pianotwórcze wprowadzane są do środowiska fermentacyjnego surowcach używanych do przygotowania podłoży (np., maki, zbóż i soi, hydrolizaty i ekstrakty). Wzrost ilości piany w trakcie procesu produkcyjnego obniża wydajność procesu i utrudnia kontrole stężenia składników.

Jako środki przeciwpianowe stosuje się oleje roślinne lub produkty syntetyczne (środki silikonowe, kopolimery tlenku etylenu i tlenku propylenu)

Sposoby prowadzenia procesów w bioreaktorze

Procesy okresowe - tzw. hodowla statyczna

Klasyczny proces polega na jednorazowym wprowadzeniu pożywki do bioreaktora i zaszczepieniu drobnoustrojami, które rozmnażają się i w czasie wzrostu lub po jego zakończeniu wytwarzają określony produkt. Po procesie produkt jest izolowany z całości hodowli z komórek i/lub z przesączu pohodowlanego, a aparatura przygotowywana jest do nowego cyklu produkcyjnego.

Procesy okresowe są proste, ale nie pozwalają na maksymalne wykorzystanie aparatury oraz potencjału metabolicznego komórek i aktywności enzymów.

Procesy okresowe z zasilaniem (FBC) - polegające na zasilaniu hodowli w bioreaktorze odpowiednio dobrana pożywką lub jej składnikami, co zapewnia ograniczenie syntezy masy komórkowej oraz zwiększenie biosyntezy produktu.

Stosuje się także okresowe odbieranie części hodowli z bioreaktora zasilanego świeżą pożywką. Procesy okresowe z zasilaniem wykorzystywane są do biosyntezy produktów niezwiązanych bezpośrednio ze wzrostem drobnoustrojów.

Procesy ciągłe - polegają na tym, że po wstępnym namnożeniu drobnoustrojów rozpoczyna się stałe zasilanie hodowli strumieniem świeżej pożywki oraz ciągłe odbieranie pożywki zużytej z zachowanie stałej objętości hodowli w bioreaktorze:

-hodowla chemostat - razem ze zużyta pożywka usuwane są niepożądane metabolity

-hodowla biostat - razem ze zużyta pożywka usuwane są produkty reakcji oraz nadmiar biomasy komórkowej.

Zalety procesu ciągłego:

-możliwość regulacji stanu fizjologicznego komórek przez dobór szybkości zasilania hodowli pożywką i prowadzenie procesu w ustalonych najbardziej korzystnych warunkach

-większa szybkość procesu i większa wydajność produktu

-maksymalne wykorzystanie aparatury

Procesy z immobilizowanymi komórkami lub enzymami - polegają na unieruchomieniu komórek drobnoustrojów lub wyizolowanych z nich enzymów na stałym nośniku.

Zalety:

-możliwość wielokrotnego użycia lub wykorzystanie enzymów w procesach ciągłych

-przedłużona stabilność katalityczna enzymu

-prosta technologia i aparatura

-zmniejszone koszty technologiczne procesu

Kontrola przebiegu bioprocesów

Odpowiednia jakość produktu i wysoka wydajność bioprocesu można osiągnąć jedynie wtedy, gdy prowadzi się kontrole całego procesu.

Kontrolowane parametry bioprocesu:

-temperatura - rejestrują termometry oporowe, wahania temperatury korygowane są przez system wymienników ciepła

-ciśnienie gazu - optymalne ciśnienie jest utrzymywanie przez regulacje odpływu i dopływu powietrza

-wartość pH - pomiar pH za pomocą elektrody, korygowane prze dodanie kwasu lub zasady

-stężenie jonów - pomiar spektroskopowy lub potencjometryczny

-zawartość tlenu - pomiar elektroda tlenową, regulacja ciśnieniem gazu i szybkością mieszania

-przepływ cieczy i gazu - pomiar przepływomierzem magnetycznoindukcyjnym lub termicznym.

-poziom piany- elektroniczny pomiar za pomocą sondy, dodawanie środków przeciwpianowych

-pomiar ciężaru- ważenie całego bioreaktora w celu ustalenia masy zawartości oraz ilości dodawanych i odbieranych.

-zmętnienie - pomiar optyczny gęstości populacji komórek (mętnościomierzem) w celu monitorowania krzywej wzrostu

-produkt - analiza fizykochemiczna stężenia produktu w medium

Zasady optymalizacji bioprocesów

Głównym celem optymalizacji procesu jest uzyskanie maksymalnej wydajności i czystości produktu.

Optymalizacja bioprocesu wymaga dokonania analizy współzależności parametrów procesowych oraz wyboru parametrów najważniejszych, które odgrywają zasadniczą role w sterowaniu przebiegu procesu.

Schemat zależności pomiędzy grupami parametrów biologicznych chemicznych i fizycznych bioprocesu:

Parametry sterowane Warunki procesu Wyniki

Optymalizacja procesu biotech. prowadzi się:

-podczas wstępnego opracowywania nowej technologii w skali laboratoryjnej

-przy powiększaniu skali do warunków przemysłowych

-podczas usprawniania realizowanego już procesu przemysłowego.

Obecny poziom metod analitycznych i modelowania komputerowego umożliwia pomiar lub obliczenie prawie wszystkich ważniejszych parametrów bioprocesu nie wyłączając stężenia składników wewnątrzkomórkowego

Zasadniczym czynnikiem warunkującym użycie komputerów do monitorowania, modelowania i regulacji bioprocesów jest dobra znajomość zjawisk fizycznych, chemicznych i biologicznych zachodzących podczas procesu umożliwiająca budowę modelu matematycznego danego bioprocesu.

Ilość i stan fizjologiczny biomasy, mutacje, zakażenia

Fizyczne:

obroty mieszadła, napowietrzanie, temperatura, czas

Chemiczne:

skład podłoża i roztworów dozowanych

Biologiczne: genotyp szczepu, jakości i ilość inokulum

Bieżące stężenia składników podłoża pH, pO2 pCO2

Warunki mieszania, lepkość, transport tlenu i tworzenie się piany

Wydajność produktu

Koszt surowców

Koszt energii

---