10. HODOWLA KOMÓREK I TKANEK
Hodowla jest to utrzymywanie oddzielonych od organizmu komórek, tkanek, a nawet narządów w warunkach sztucznych (in vitro) przez okres dłuższy niż 24 godz. Metodyka ta stwarza unikalną możliwość obserwacji zachowania się żywych komórek pozbawionych kontrolnego i regulacyjnego wpływu innych tkanek i całego organizmu.
10.1. Klasyfikacja i terminologia
W obrębie pojętej ogólnie hodowli tkanek rozróżniamy:
• hodowlę komórek (nie wytwarzających wyżej zorganizowanych struktur tkankowych),
• hodowlę tkanek,
• hodowlę organotypową (dotyczy zarówno embrionalnych zawiązków narządów, jak i fragmentów lub całych narządów pobranych z dojrzałego organizmu).
Z hodowlą związane są pewne specyficzne określenia terminologiczne:
• hodowla pierwotna: zapoczątkowana pobraniem komórek lub tkanek bezpośrednio z organizmu;
• linia komórkowa: powstaje przez przeniesienie części hodowli pierwotnej do odrębnej hodowli. Jeżeli materiał daje się potem wielokrotnie przenosić ("pasażować") do kolejnych hodowli, mówimy o tzw. ustalonej linii komórkowej. Linie komórkowe dzielimy na diploidalne, czyli takie, w których 75% lub więcej komórek wykazuje diploidalną liczbę chromosomów, oraz na linie heteroploidalne. Te ostatnie charakteryzują się często nieograniczonym czasem wzrostu i łatwo ulegają transformacji nowotworowej;
• szczep komórkowy: wyprowadza się go z hodowli pierwotnej lub linii komórkowej poprzez wyodrębnienie komórek o określonej charakterystyce, która utrzymuje się w trakcie dalszych pasaży szczepu. Cecha charakterystyczna szczepu może dotyczyć: szczególnego wyposażenia chromosomowego, antygenowego, zdolności do produkcji specyficznego związku chemicznego, braku określonego enzymu lub organelli, niewrażliwości na jakąś substancję toksyczną, itp.;
• klon komórkowy: jest to populacja komórek wywodząca się z jednej komórki macierzystej i powstała na drodze jej wielokrotnych podziałów.
10.2. Pożywki i warunki hodowli
Utrzymanie hodowli tkankowej wymaga spełnienia dwóch podstawowych warunków:
• dostarczenia komórkom wszystkich składników niezbędnych do ich rozwoju i wzrostu;
• niedopuszczenia do zanieczyszczenia hodowli mikroorganizmami, innymi komórkami oraz substancjami toksycznymi.
Pierwszy warunek realizowany jest poprzez hodowanie komórek i tkanek na specjalnych pożywkach, zastępujących żywym komórkom ich naturalne środowisko. Wyróżniamy pożywki naturalne (osocze, surowica, wyciągi tkankowe) oraz sztuczne, o składzie ściśle dobranym do wymagań danej hodowli.
Najszerzej stosowane są pożywki sztuczne. W ich skład wchodzą z reguły następujące komponenty:
• substancje odżywcze i energetyczne (aminokwasy, glukoza, lipidy, zasady purynowe i pirymidynowe),
• witaminy, niezbędne dla prawidłowego metabolizmu komórek,
• sole mineralne, będące źródłem jonów koniecznych dla licznych procesów czynnościowych (agregacja, adhezja do podłoża, migracja).
Do pożywek sztucznych dodaje się przeważnie niewielkie ilości surowicy (najczęściej cielęcej lub końskiej), która zawiera białka i czynniki wpływające na wzrost i podział komórek. W przypadku hodowli komórek wyżej zróżnicowanych (np. dokrewnych) nie stosuje się dodatku surowicy, gdyż zawarte w niej czynniki mogą wpływać na badane funkcje metaboliczne komórek. Pożywkę uzupełnia się wówczas odpowiednio dobranymi składnikami w formie chemicznie czystej, np. czynnikami wzrostu, hormonami, transferyną czy fibronektyną (ta ostatnia ułatwia przyleganie komórek do podłoża).
pH pożywki musi być zbliżone do naturalnego pH komórek i tkanek w organiźmie (in vivo) i utrzymywane jest przez bufory zawarte w pożywkach (węglanowy, fosforanowy, HEPES). Składnikiem pożywki może być również czerwień fenolowa - wskaźnik reagujący zmianą barwy na zmianę pH pożywki świadczącą o jej "zepsuciu" i nieprzydatności. Również osmolarność pożywki nie może się znacznie różnić od fizjologicznej dla danych komórek.
W metodyce hodowlanej stosuje się szereg gotowych, wieloskładnikowych pożywek sztucznych, zawierających komplet elementów niezbędnych do rozwoju i wzrostu komórek, jak np. podłoże Eagle'a, Dulbecco, Hanksa i in.
Drugi warunek prawidłowej hodowli - niedopuszczenie do jej zanieczyszczenia mikroorganizmami - spełniany jest poprzez utrzymywanie bezwzględnej jałowości całej procedury hodowlanej. Szkło laboratoryjne używane do hodowli (butelki, płytki Petry'ego, probówki, pipety, itp.) myje się starannie w detergentach, wytrawia w stężonym kwasie azotowym, zobojętnia ługiem sodowym, wielokrotnie płucze i sterylizuje w autoklawach. Korzysta się również z jednorazowych, jałowych naczyń z tworzyw sztucznych. W procedurach hodowlanych używa się wyłącznie wody podwójnie destylowanej. Wreszcie, do samych pożywek często dodaje się antybiotyków (penicylina, streptomycyna, chloramfenikol, mykostatyna), aby zabezpieczyć hodowlę przed rozrostem przypadkowo zawleczonych bakterii, grzybów czy wirusów. Należy jednak podkreślić, iż antybiotyki nie zwalniają z bezwzględnego przestrzegania warunków jałowości hodowli.
Ponadto całe oprzyrządowanie laboratoryjne mające bezpośredni lub pośredni kontakt z materiałem hodowlanym poddaje się sterylizacji, a samą hodowlę prowadzi się w wyodrębnionych pomieszczeniach, do których doprowadza się uprzednio wyjałowione powietrze, lub też wyjaławia się je okresowo za pomocą promieniowania UV.
Pracownicy zatrudnieni w laboratorium hodowli tkanek muszą podczas pracy używać odrębnego, wyjałowionego ubioru, maski oraz specjalnego obuwia.
W przypadku krótkotrwałych hodowli komórek można zrezygnować z bezwzględnej jałowości całego pomieszczenia hodowlanego pod warunkiem wyposażenia pracowni w tzw. komory przepływu laminarnego, w których odpowiedni system pomp i filtrów powoduje ciągły przepływ jałowego powietrza. Wnętrze takiej komory pozostaje zatem jałowe pomimo niejałowości bezpośredniego otoczenia.
10.3. Metodyka hodowli
Hodowlę można prowadzić w systemie otwartym lub zamkniętym. System otwarty to hodowla w naczyniach, w których materiał hodowany kontaktuje się ze środowiskiem zewnętrznym (płytki Petry'ego, płytki wielodołkowe), wobec czego skład tego środowiska musi być ściśle kontrolowany, głównie przez utrzymywanie określonego stężenia gazów (przede wszystkim CO2). System zamknięty otrzymujemy przez hodowanie materiału w hermetycznie zamkniętych naczyniach (butelki Leightona, Legroix), zapewniające komórkom stałe warunki środowiska.
Komórki lub tkanki można hodować albo zanurzone całkowicie w pożywce, albo na jej powierzchni. Spośród metod szczegółowych wyróżnia się:
• hodowlę w kropli pożywki pokrytej warstewką oleju parafinowego, na szkiełku podstawowym;
• hodowlę w nieruchomych lub obracających się probówkach oraz butelkach;
• hodowlę na powierzchniach szkiełek mikroskopowych, płaskich naczyń szklanych lub plastikowych: w tych warunkach hodowane komórki powinny utworzyć pojedynczą warstwę (monolayer);
• hodowlę na powierzchni skrzepu osoczowego, agaru, przepuszczalnych błon lub specjalnych siatek (dotyczy hodowli organotypowych);
• hodowlę w półpłynnym agarze (komórki zostają unieruchomione, lecz mają możliwość różnicowania się);
• hodowlę w sieci kolagenu (komórki unieruchomione, możliwość badania ich wpływu na substancję międzykomórkową).
Hodowlę komórek (np. fibroblastów, leukocytów, makrofagów, komórek mięśniowych, śródbłonków naczyniowych) zapoczątkowuje się przez umieszczenie w pożywce wybranych komórek wyizolowanych z organizmu lub rozdrobnionych fragmentów tkanek/narządów, w których przeznaczone do hodowli komórki występują w znacznej ilości. Hodowlę tkankową można zapoczątkować przez umieszczenie w pożywce fragmentu tkanki. Przy zakładaniu hodowli należy zwracać uwagę na to, aby wyjściowy fragment miał niewielkie rozmiary (optymalna wielkość: 1-2 mm), bowiem zbyt duży fragment tkanki może ulec nekrozie, uniemożliwiającej wzrost i namnażanie się komórek.
W warunkach hodowli komórki zaczynają się intensywnie dzielić, zwłaszcza w obwodowych strefach tkanki, i można je stamtąd przenosić do następnych naczyń hodowlanych. W tym celu komórki oddziela się od tkanki działając enzymami proteolitycznymi rozkładającymi substancję międzykomórkową (trypsyna, pronaza, kolagenaza) oraz substancjami wychwytującymi jony dwuwartościowe (EDTA), odpowiedzialne za wzajemną adhezję komórek.
Niekiedy prowadzi się hodowlę mieszaną (kokulturę) - przeważnie dwóch, rzadziej kilku różnych rodzajów komórek, badając ich wzajemne oddziaływanie na siebie. Komórki różnych typów mogą być hodowane albo wspólnie, albo oddzielnie - w tej samej pożywce, ale w naczyniu przedzielonym na odrębne komory siatkami lub błonami pozwalającymi na wymianę produkowanych przez hodowane komórki substancji, lecz uniemożliwiającymi "przechodzenie" komórek z jednej komory do drugiej.
10.4. Kontrola żywotności komórek w hodowli
Oddzielenie komórki od jej naturalnego środowiska w organiźmie stanowi poważne zaburzenie warunków życia komórki i może powodować jej degenerację lub obumarcie. Przy zakładaniu hodowli zawsze powinno się określić odsetek komórek martwych, daje to bowiem informację o prawidłowości zastosowanych warunków izolacji, a ponadto charakteryzuje stan wyjściowy przy ewentualnych badaniach wpływu różnych substancji (np. toksycznych) na hodowane komórki.
Do testów oceny żywotności komórek w hodowli należą:
• krótkotrwała inkubacja komórek w roztworze błękitu trypanu, który nie przenika do komórek żywych - w tym teście komórki zabarwione uważa się za martwe;
• inkubację komórek w roztworach barwników pochłanianych przez żywe komórki na drodze endocytozy (błękit toluidynowy, czerwień obojętna) - w tym teście zabarwione komórki uważa się za żywe;
• ocena zdolności gromadzenia przez komórki fluoresceiny podanej w postaci octanu - w żywych komórkach następuje enzymatyczne odszczepienie reszty octanowej i akumulacja fluorochromu.
10.5. Transformacja komórek
Przez transformację rozumie się utratę przez hodowane komórki zdolności regulacji procesów wzrostu i różnicowania. Komórki transformowane charakteryzują się intensywnymi podziałami, utratą tzw. zahamowania kontaktowego (zahamowanie ruchu i podziałów komórek, które zetknęły się ze sobą błonami komórkowymi) oraz często zaburzeniami chromosomowymi. Po przeszczepieniu zwierzętom laboratoryjnym, komórki transformowane mogą dawać początek guzom nowotworowym.
Transformacja może zachodzić in vivo (pod wpływem substancji rakotwórczych i niektórych wirusów) oraz in vitro. W tym ostatnim przypadku do jej wywołania używa się wirusów onkogennych lub substancji pochodzenia roślinnego, tzw. mitogenów (fitohemaglutynina, konkanawalina A).
Specjalną odmianą transformacji jest tzw. transformacja blastyczna limfocytów indukowana in vivo przez stymulację antygenem, zaś in vitro przez antygen lub mitogeny. Polega ona na pojawieniu się w cytoplaźmie limfocyta bogatego wyposażenia biosyntetycznego (szorstka siateczka śródplazmatyczna, wolne rybosomy, aparat Golgiego) oraz na wysokiej aktywności podziałowej tych komórek. W obrazie mikroskopu świetlnego komórki blastyczne wywodzące się z limfocytów charakteryzują się zwiększoną objętością cytoplazmy, jej zasadochłonnością, jądrem o rozluźnionej chromatynie i wyraźnych jąderkach oraz częstą wakuolizacją cytoplazmy.
10.6. Agregacja i segregacja komórek
Dzielące się w hodowli komórki osiągają etap, w którym stykają się ze sobą. Zachodzi wówczas zjawisko kontaktowego zahamowania ich wzrostu, a powstałe w ten sposób agregaty komórkowe wytwarzają pomiędzy sobą drogi komunikacji jonowej i metabolicznej. W zjawiskach agregacji główną rolę odgrywają jony wapnia i magnezu oraz specjalne białka błonowe (kadheryny, CAM - ang. cell adhesion molecules). Jeżeli chce się uniknąć agregacji komórek w hodowli, pożywka nie powinna zawierać jonów wapnia i magnezu.
Przy równoczesnym hodowaniu dwóch różnych linii komórkowych procesowi agregacji często towarzyszy zjawisko segregacji komórek: komórki każdego z dwóch typów "odnajdują się" przy tworzeniu agregatu i następuje w ten sposób wyraźne rozdzielenie obecnych we wspólnej hodowli linii komórkowych (np. jedna linia tworzy centralną strefę agregatu, a druga grupuje się na jego obwodzie).
10.7. Fuzja i hybrydyzacja komórek
Działając na mieszaną hodowlę dwóch rodzajów komórek somatycznych niektórymi inaktywowanymi wirusami lub pewnymi substancjami chemicznymi (glikol polietylenowy, lizolecytyna) można wywołać zjawisko fuzji, czyli połączenia się błon komórkowych i zlania ze sobą cytoplazmy dwóch odmiennych komórek. Dalsza hodowla prowadzi do hybrydyzacji takich tworów, polegającej na połączeniu ich genomów. Aparat genetyczny komórek hybrydowych będzie zatem zawierał informację obu genomów komórek macierzystych. Z uwagi na fakt, iż w warunkach doświadczalnych fuzji i hybrydyzacji mogą ulegać komórki różnych gatunków zwierząt o bardzo odmiennych genotypach, metoda ta stwarza atrakcyjne pole do badań genetycznych i cytofizjologicznych. Hybrydyzację komórek stosuje się również do produkcji przeciwciał monoklonalnych (p. rozdz. 7.2.2).
10.8. Hodowla fibroblastów, leukocytów i limfocytów
Najłatwiejszym do wykorzystania materiałem komórkowym, stwarzającym najmniej problemów metodycznych przy hodowli są fibroblasty. Rosną one żywiołowo prawie na każdym podłożu i jeżeli stanowią zanieczyszczenie hodowli innych komórek, bardzo szybko eliminują je ze środowiska hodowlanego. Z tego względu hodowlę fibroblastów stosuje się bardzo chętnie w badaniach wymagających znacznych ilości materiału hodowlanego (np. dotyczących ogólnego metabolizmu komórek), a także w w medycznych badaniach diagnostycznych, gdzie stanowią (oprócz komórek krwi) najlepiej dostępne źródło materiału komórkowego (uzyskuje się je ze skóry). Badania takie mają głównie na celu wykrycie i analizę genetycznie uwarunkowanych chorób metabolicznych.
Stosunkowo prosta i często praktykowana jest krótkotrwała hodowla leukocytów krwi obwodowej. Materiał uzyskuje się na drodze swobodnej sedymentacji heparynizowanej krwi, w trakcie której na powierzchni fazy komórkowej tworzy się tzw. kożuszek leukocytarny - warstwa komórek zawierająca prawie wyłącznie leukocyty. W przypadku hodowli limfocytów konieczny jest rozdział białych krwinek, przeprowadzany przez ich wirowanie w gradiencie Ficollu i metrizoesanu sodu (Lymphoprep) lub Ficollu i Uropoliny.
Limfocyty w hodowli poddaje się działaniu mitogenów, aby uzyskać ich transformację blastyczną i namnożenie. Skuteczność tego działania ocenia się na podstawie oceny ilości wykrywalnych morfologicznie (pod mikroskopem) form blastycznych, obliczenia indeksu mitotycznego (odsetka komórek dzielących się), czy też pomiaru wbudowywania znakowanych aminokwasów lub nukleotydów do hodowli.
Transformowane i dzielące się limfocyty są dobrym materiałem do analizy morfologicznej ich chromosomów, użytecznej przy wykrywaniu nieprawidłowości i zaburzeń chromosomowych w badaniach cytogenetycznych. Dodanie do hodowli kolchicyny powoduje zatrzymanie się wszystkich podziałów komórkowych na etapie metafazy, w której chromosomy są rozproszone i dobrze wyodrębnione. Dodatkowe odsunięcie od siebie chromosomów można wywołać działając na hodowlę roztworem hypotonicznym. Tak przygotowany materiał po wybarwieniu (używa się tu często barwnika Giemsy, który ujawnia na każdym z chromosomów charakterystyczne prążki) i wykonaniu rozgniotu lub rozmazu nadaje się do oceny mikroskopowej oraz do sporządzenia kariogramu (mikroskopowego obrazu chromosomów uporządkowanych wg kolejności).
10.9. Zastosowanie hodowli komórek i tkanek
Hodowla tkanek znajduje obecnie bardzo szerokie zastosowanie w badaniach biologicznych i medycznych. Do problemów badanych przy użyciu tej techniki należą m.in.:
• funkcjonowanie aparatu genetycznego komórki,
• aberracje chromosomowe
• genetycznie uwarunkowane zaburzenia metabolizmu i wyposażenia komórek,
• produkcja przez komórki substancji biologicznie czynnych,
• wpływ na komórki substancji regulacyjnych, toksycznych, rakotwórczych oraz leków,
• procesy immunologiczne: odpowiedź komórek na stymulację antygenem i kooperacja komórek w reakcjach odpornościowych,
• przebieg zakażeń wirusowych,
• wytwarzanie szczepionek i przeciwciał monoklonalnych,
• procesy różnicowania się narządów,
• procesy wzajemnego wpływu na siebie różnych tkanek.
10.10. Przepisy praktyczne
10.10.1. Zakładanie hodowli fibroblastów
Niewielki fragment tkanki zarodkowej (np. wczesny zarodek myszy) lub skóry dokładnie rozdrobnić przez posiekanie w soli fizjologicznej, a następnie zalać roztworem 0,25% trypsyny. Po 10 min przesączyć przez 4 warstwy gazy. Do 20 ml przesączu dodać 0,5 ml surowicy cielęcej i wirować przy 1200 obr/min przez 5 min. Zlać nadsącz, do probówki z osadzonymi na dnie komórkami dodać 5 ml płynu Parkera lub Eagle'a i wytrząsnąć. Z powstałej zawiesiny komórek pobrać próbkę, w komorze Bürkera ocenić liczebność komórek, a następnie ich żywotność. Porcje zawiesiny zawierające ok. 200 000 komórek przenieść do dołków płytki wielodołkowej. Dodać pożywkę Parkera lub Eagle'a zawierającą 10% surowicy cielęcej. Hodować przez 48-72 godz.
10.10.2. Zakładanie hodowli leukocytów
Pobrać 10 ml krwi żylnej do strzykawki zawierającej roztwór heparyny (15 j.m./1 ml krwi). Odstawić w probówce do sedymentacji na 60-90 min w 37°C. Dokładnie odpipetować osocze wraz z kożuszkiem leukocytarnym. W komorze Bürkera obliczyć liczbę leukocytów w 1 mm3 pobranego osocza. Ocenić żywotność komórek.
Zmieszać osocze z płynem Parkera wzbogaconym 10% dodatkiem surowicy cielęcej uprzednio inaktywowanej w temp. 50°C przez 30 min. Docelowe stężenie leukocytów w pożywce winno wynosić 1 mln/ml. Hodować w szczelnie zamkniętych buteleczkach przy zachowaniu stosunku objętości pożywki do pojemności butelki 1:5.
10.10.3. Ocena żywotności komórek
Zmieszać 0,05 ml zawiesiny komórek z 2 ml 0,05% błękitu trypanu w soli fizjologicznej i inkubować przez 2 min. Nałożyć 1-2 krople zawiesiny na szkiełko podstawowe i ocenić pod mikroskopem odsetek komórek zabarwionych (ocena powinna się zakończyć przed upływem 4 min od czasu zmieszania komórek i barwnika).
164