18-534

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: 163-171

DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH

W KULTURACH in vitro TULIPANA

Małgorzata

Maślanka

, Anna

Bach

Katedra Roślin Ozdobnych, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie

Wstęp

Tulipan, ze względu na długotrwałą i mało wydajną drogę rozmnaŜania, jest

obiektem  wielu  badań,  mających  na  celu  zwiększenie  plonu  oraz  przyspieszenie  jego
uprawy.  Obiecującą  technologią  produkcji  tulipana  jest  somatyczna  embriogeneza,  ze
względu  na  bardzo  szybki  i  wydajny  sposób  rozmnaŜania

ROOMEN

1997].

Somatyczne zarodki, powstające z komórek innych niŜ zygota, czyli na drodze
rozmnaŜania bezpłciowego, poprzez manipulowanie składem poŜywki, mogą tworzyć
się w duŜej ilości, w stosunkowo krótkim czasie

PCZYŃSKA

2006].

Liczba uzyskanych

zarodków,  obok  ich  jakości,  decyduje  o przydatności  somatycznej  embriogenezy  do
masowej  produkcji  roślin.  W przypadku  tulipana  nie  opracowano,  jak  dotąd,  metody
szybkiego i synchronicznego otrzymywania licznych somatycznych zarodków, pomimo
poznania juŜ mechanizmów kontrolujących te procesy.

Celem przeprowadzonych badań było określenie wpływu czasu trwania kultury

na efektywność formowania zarodków somatycznych (terminu pojawienia się
pierwszych zarodków globularnych i torpedo oraz ich liczby) u tulipana. Zbadano takŜe
wpływ róŜnych stęŜeń auksyny na dynamikę formowania zarodków.

Materiał i metody

Badania przeprowadzono na tulipanach odmiany ‘Apeldoorn’ (naleŜącej do grupy

mieszańców Darwina) i ‘Rosy Wing’ (z grupy pojedynczych późnych). Jako
eksplantaty inicjalne zastosowano zaląŜnie, wyizolowane z chłodzonych przez 12
tygodni, w 5

C, cebul o obwodzie 11-12 cm. Zdezynfekowane eksplantaty cięto na 1-2-

mm fragmenty (plastry) i wykładano do szalek Petriego na poŜywki zawierające sole
mineralne według

URASHIGE

i S

KOOG

[1962]

, 25 lub 50

M Picloramu; 0,25-10

M BA,

3% sacharozy, zestalone 0,7% agarem. Kultury prowadzono w ciemności, w 20

Tworzący się Ŝółty, embriogeniczny kalus odejmowano od tkanki matecznej,
namnaŜano na jednej z poŜywek inicjalnych, a następnie poddano działaniu 10 lub 5

M Picloramu oraz 1

M BA, w celu formowania zarodków somatycznych, zgodnie

z procedurą według

ACH

i P

TAK

[2001].

W czasie 20 tygodni prowadzenia kultury określono procent eksplantatów

róŜnicujących zarodki globularne oraz liczbę, powstałych z 1 g kalusa, zarodków w

M. Maślanka, A. Bach

164

stadium torpedy (długości 5-10 mm), w zaleŜności od genotypu, stęŜenia auksyny i
czasu trwania kultury.

Analizę histologiczną formujących się struktur sporządzono w oparciu

o preparaty mikroskopowe, wykonane metodą parafinową według

ILUTOWICZA

i K

UśDOWICZA

[1951].

Doświadczenie wykonano w 5 powtórzeniach po 5 eksplantatów.

Wyniki opracowano statystycznie za pomocą metody analizy wariancji. Porównanie
ś

rednich i określenie grup jednorodnych wykonano przy uŜyciu testu Duncana, z

uwzględnieniem poziomu istotności

= 0,05.

Wyniki i dyskusja

RóŜnicowanie zarodków w fazie rozwoju globularnego

Do rozwoju somatycznych zarodków u tulipana niezbędne jest obniŜenie stęŜenia

auksyny w poŜywce lub jej usunięcie

UDE

IJKEMA

1997].

RóŜnicowanie zarodków

stymuluje równieŜ obecność cytokinin, najsilniej podczas powstawania zarodków w
stadium globularnym, któremu towarzyszą intensywne podziały komórkowe

ZWEYKOWSKA

1994].

Kultury zwykle prowadzi się w ciemności, stymulującej m.in.

rozwój zarodków globularnych

ACH

ARCHOŁ

2000]

oraz obniŜającej stopień

deformacji zarodków w stadium torpedy

AŚLANKA

ACH

2007].

rednie oznaczone tymi samymi literami nie róŜnią się istotnie na poziomie istotności

=0,05; means marked

with the same letter du not differ significantly at the significance level

=0.05

Rys. 1. Wpływ czasu trwania kultury i stęŜenia auksyny na róŜnicowanie zarodków globularnych

u odmiany ‘Apeldoorn’

Fig. 1.

Effect of cultivation time and auxin concentration on the globular embryo diffe-
rentiation of cv. ‘Apeldoorn’

W przeprowadzonym doświadczeniu, formowanie zarodków globularnych

zachodziło  na  drodze  embriogenezy  pośredniej,  przez  kalus.  RóŜnicowanie  to  miało
miejsce  od  pierwszych  tygodni  doświadczenia,  ale  nasiliło  się  po  2-3  miesiącach
prowadzenia  kultury.  W przypadku  odmiany  ‘Apeldoorn’  i  poŜywki  z 5

M auksyny,

najwyŜszy procent eksplantatów formujących zarodki globularne, wynoszący 76%,
odnotowano po 8 tygodniach trwania kultury. Stosując 10

M Picloramu, większe

róŜnicowanie zarodków, równe 60%, otrzymano po 12 tygodniach od załoŜenia

DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH ...

165

doświadczenia,  w  stosunku  do  pozostałego  okresu  kultury.  Wraz  z  upływem  czasu
trwania  kultury  obniŜała  się  wydajność  kalusa  embriogenicznego  w tworzeniu
zarodków,  a  po  20  tygodniach  pod  wpływem  5

M Picloramu nie obserwowano

róŜnicowania nowych zarodków (rys. 1).

U tulipana ‘Rosy Wing’ zaobserwowano intensywniejsze róŜnicowanie zarodków

globularnych po 2-3 miesiącach, w stosunku do całego okresu kultywacji, niezaleŜnie
od stęŜenia auksyny (rys. 2).

objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1

Rys. 2. Wpływ czasu trwania kultury i stęŜenia auksyny na róŜnicowanie zarodków globularnych

u odmiany ‘Rosy Wing’

Fig. 2.

Effect of cultivation time and auxin concentration on the globular embryo diffe-
rentiation of cv. ‘Rosy Wing’

Tabela 1; Table 1

Procent eksplantatów róŜnicujących zarodki globularne, w zaleŜności od genotypu

i stęŜenia auksyny, przez 20 tygodni prowadzenia kultury

Percentage of explants forming globular embryos, depending on genotype

and auxin concentration, for 20 weeks of cultivation

PoŜywka; Medium

Odmiana; Cultivar

Apeldoorn

Rosy Wing

M Picloram, 1

M BA

39,2 b

20,8 a

M Picloram, 1

M BA

33,6 b

23,2 a

rednia; Average

36,4 b

22,0 a

objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1

Oceniając wpływ stęŜenia auksyny na róŜnicowanie zarodków, u obu odmian

tulipana stwierdzono, Ŝe badana cecha nie była zaleŜna od róŜnych stęŜeń Picloramu
(tab. 1). RóŜnicowanie zarodków globularnych uzaleŜnione było natomiast od
genotypu.

Odmiana ‘Apeldoorn’ efektywniej formowała początkowe stadia zarodków

(36,4% eksplantatów) niŜ ‘Rosy Wing’ (22% eksplantatów; tab. 1).

Kalus embriogeniczny obu badanych odmian tulipana, utrzymywany na po-

ywkach z 10 lub 5

M Picloramu oraz 1

M BA, stopniowo tracił embriogeniczny

charakter i róŜnicował coraz mniej zarodków. W kulturach kalusa przetrzymywanych

M. Maślanka, A. Bach

166

przez  dłuŜszy  czas  na  poŜywce  z auksyną  lub  cytokininą  następują  zwykle  zmiany
epigenetyczne,  polegające  na  względnie  trwałym  uniezaleŜnieniu  się  od  egzogennych
regulatorów.  Procesowi  temu  sprzyja  prowadzenie  kultur  w  ciemności

RLIKOWSKA

1997].

Być moŜe kalus tulipana po kilku miesiącach kultury in vitro traci stopniowo

wraŜliwość na obecne w poŜywce auksyny i cytokininy, albo teŜ stosowane regulatory
w niŜszych stęŜeniach działają słabiej. O działaniu regulatorów roślinnych decyduje nie
tylko ich rodzaj i koncentracja, ale takŜe wraŜliwość eksplantatu na te regulatory w
momencie aplikacji. Działanie substancji wzrostowych zaleŜy takŜe od wieku kultur

RLIKOWSKA

1997].

Niestety zdarza się, Ŝe kalus embriogeniczny ma powolny wzrost i

szybko traci kompetencję do embriogeniczności

AGHAVAN

1997].

RóŜnicowanie zarodków w stadium torpedy

Somatyczne zarodki tulipana w stadium torpedy, długości 5-10 mm, obser-

wowano w 8 i 12 tygodniu prowadzenia kultury, odpowiednio u odmiany ‘Apeldoorn’ i
‘Rosy  Wing’.  U  obu  badanych  odmian  więcej  zarodków  uformowało  się  po  12
tygodniach  kultury,  w porównaniu  z  pozostałym  okresem  trwania  doświadczenia  (rys.
3,  4).

OUMAN

i in. [1999]

otrzymywali w pełni wykształcone zarodki tulipana po 10

tygodniach na poŜywkach niezawierających auksyn.

ACH

i P

TAK

[2001]

natomiast

obserwowały formowanie się pierwszych zarodków w 12. tygodniu od chwili załoŜenia
kultur.

objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1

Rys. 3. Wpływ czasu trwania kultury i stęŜenia auksyny na liczbę zarodków w stadium torpedy

u odmiany ‘Apeldoorn’

Fig. 3.

Effect of cultivation time and auxin concentration on the number of torpedo-shaped
embryos of cv. ‘Apeldoorn’

StęŜenie auksyny nie miało wpływu na liczbę otrzymanych zarodków w stadium

torpedy. U obu badanych odmian, więcej (o ponad 30%) uformowanych zarodków na
poŜywce z 5

M Picloramu nie stanowiło istotnej róŜnicy w stosunku do poŜywki ze

stęŜeniem Picloramu równym 10

M (tab. 2).

TAK

i B

ACH

[2007]

największą liczbę

somatycznych zarodków tulipana uzyskały na poŜywkach z przewaŜającym udziałem
Picloramu nad BA.

DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH ...

167

objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1

Rys. 4. Wpływ czasu trwania kultury i stęŜenia auksyny na liczbę zarodków w stadium torpedy

u odmiany ‘Rosy Wing’

Fig. 4.

Effect of cultivation time and auxin concentration on the number of torpedo-shaped
embryos of cv. ‘Rosy Wing’

Tabela 2; Table 2

Liczba zarodków w stadium torpedy, z 1 g kalusa, w zaleŜności od genotypu i stęŜenia auksyny,

przez 20 tygodni prowadzenia kultury

Number of torpedo-shaped embryos, from 1 g of callus, depending on genotype and auxin

concentration, for 20 weeks of cultivation

PoŜywka; Medium

Odmiana; Cultivar

Apeldoorn

Rosy Wing

M Picloram, 1

M BA

5,32 ab

1,6 a

M Picloram, 1

M BA

7,96 b

2,6 a

rednia; Average

6,64 b

2,1 a

objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1

Podobnie jak w przypadku róŜnicowania zarodków globularnych, liczba

uzyskanych  zarodków  w  stadium  torpedy  takŜe  zaleŜała  od  genotypu  rośliny.  Średnio
6,64  zarodków  otrzymano  z  1  g  kalusa  tulipana  ‘Apeldoorn’  w  ciągu  20  tygodni,
niezaleŜnie od poŜywki. Odmiana ‘Rosy Wing’ uformowała w tych samych warunkach
trzykrotnie  mniej  zarodków  (tab.  2).  Porównana  przez  autorów

ACH

, P

TAK

2002]

odmiana ‘Apeldoorn’ równieŜ charakteryzowała się większą efektywnością procesu
somatycznej embriogenezy w stosunku do odmiany ‘Red Matador’ (mieszaniec
Darwina). Z kolei w badaniach

ODWYSZYŃSKIEJ

i in. [1997]

odmiana ‘Apeldoorn’ okazała

się mieć najsłabsze zdolności do róŜnicowania, w porównaniu z innymi odmianami
tulipana.

Analiza histologicza

Analiza histologiczna otrzymanych regularnych, dwubiegunowych struktur,

z uformowanym liścieniem, pasmem wiązek przewodzących i merystemem pędowym
potwierdziła, Ŝe w przeprowadzonych badaniach istotnie formowały się zarodki

M. Maślanka, A. Bach

168

somatyczne, które swoją budową odpowiadały zarodkom zygotycznym (fot. 1).
Niestety, zregenerowane zarodki tulipana nie posiadały korzenia. WzdłuŜ somatycznych
zarodków tulipana

ODWYSZYŃSKA

i M

ARASEK

[2003]

równieŜ zaobserwowały podłuŜne

pasma  wiązek  naczyniowych,  nie  odnotowały  natomiast  formowania  się  korzonka
zarodkowego.  Brak  korzeni  u somatycznych  zarodków  tulipana  moŜna  tłumaczyć
wysoką  temperaturą  (20-23

C) kultur in vitro i obecnością cytokinin, które opóźniają

ich rozwój

ODWYSZYŃSKA

ARASEK

2003].

Fot. 1. Przekrój podłuŜny przez somatyczny zarodek tulipana (pow. 30

, li - liścień, mp -

merystem pędowy)

Photo 1.

Longitudinal section of the tulip somatic embryo (magnification 30

, li - cotyledon,

mp - shoot meristem)

Wnioski

Długość okresu prowadzenia kultury odgrywała istotną rolę w somatycznej
embriogenezie tulipanów. Wzrost róŜnicowania zarodków globularnych ob-
serwowano do 8-12 tygodnia kultury in vitro, a formowanie zarodków w stadium
torpedy nasiliło się po 3 miesiącach kultury.

StęŜenie auksyny w zakresie 5 i 10

M nie miało istotnego wpływu na róŜ-

nicowanie zarodków globularnych i formowanie torped.

Wydajność somatycznej embriogenezy zaleŜała od genotypu. Zarodki globularne
róŜnicowało średnio 36% eksplantatów ‘Apeldoorn’ i 22% ‘Rosy Wing’. Tulipan
‘Apeldoorn’ uformował większą liczbę zarodków somatycznych (średnio 6,6) niŜ

DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH ...

169

‘Rosy Wing’ (średnio 2,1) z 1 g kalusa.

Analiza histologiczna potwierdziła formowanie zarodków somatycznych
w stadium torpedy.

Literatura

ACH

A.,

TAK

A. 2001.

Somatic embryogenesis and plant regeneration from ovaries of

Tulipa gesneriana L. in in vitro cultures. Acta Horticulturae 560: 391-394.

ACH

A.,

TAK

A. 2002.

Nowa metoda mikrorozmnaŜania tulipana (Tulipa gesneriana L.)

z tkanek zaląŜni. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 483: 13-19.

ACH

A.,

ARCHOŁ

M. 2000.

Effect of light quality on proliferation of embryogenic

callus of Hyacinthus orientalis cv. Delft’s Blue. Acta Biologica Cracoviensia 42: 17.

OUMAN

H.,

ANGENS

M.,

CHOO

W.,

IJKEMA

M. 1999.

Somatic embryogenesis of tulip.

Acta Biologica Cracoviensa 41: 34.

ROOMEN

C.O.N. 1997.

Farm management aspects of somatic embryogenesis for tulip

bulb production. Acta Horticulturae 430: 383-388.

ILUTOWICZ

A.,

UśDOWICZ

A. 1951.

Mikrotechnika roślinna. PWRiL, Warszawa.

UDE

H.,

IJKEMA

M.H.G.E. 1997.

Somatic embryogenesis in tulip. Acta Horticulturae

430: 275-280.

ĘPCZYŃSKA

E. 2006.

Kiełkowanie i konwersja somatycznych zarodków in vitro. Bio-

technologia 4(75): 78-94.

AŚLANKA

M.,

ACH

A. 2007.

Wpływ kwasu abscysynowego oraz światła na wzrost

i rozwój zarodków somatycznych tulipana (Tulipa gesneriana L.). Zesz. Probl. Post.
Nauk Rol. 523: 155-161.

URASHIGE

T.,

KOOG

F. 1962.

A revised medium for rapid growth and bioassays with

tobacco tissue culture. Plant Physiology 15: 473-497.

RLIKOWSKA

T. 1997.

Regulatory roślinne w kulturach in vitro, w: Regulatory wzrostu i

rozwoju roślin. Zastosowanie w ogrodnictwie, rolnictwie, leśnictwie i w kulturach
tkanek. Jankiewicz S.L. Praca zbiorowa, PWN, Warszawa: 219-247.

ODWYSZYŃSKA

M.,

ARASEK

A. 2003.

Effects of thidiazuron and paclobutrazol on

regeneration potential of tulip flower stalk explants in vitro and subsequent shoot
multiplication. Acta Societatis Botanicorum Poloniae 72(3): 181-190.

ODWYSZYŃSKA

M.,

ARASEK

A.,

ABRYSZEWSKA

E. 1997.

Indukcja tworzenia pędów

przybyszowych i zarodków somatycznych w kulturach in vitro tulipana. Zeszyty Nau-
kowe AR w Krakowie 318: 195-198.

TAK

A.,

ACH

A. 2007.

Somatic embryogenesis in tulip (Tulipa gesneriana L.) flower

stem cultures. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 43: 35-39.

AGHAVAN

V. 1997.

Molecular embryology of flowering plants. Somatic embryogenesis.

Cambridge University Press: 467-499.

ZWEYKOWSKA

A. 1994.

Procesy róŜnicowania w kulturach tkanek i komórek roślinnych.

Prace Ogrodu Botanicznego Polskiej Akademii Nauk 5/6: 9-18.

M. Maślanka, A. Bach

170

Słowa kluczowe:

tulipan, somatyczna embriogeneza, zarodki globularne, torpedo

Streszczenie

Kalus embriogeniczny tulipanów odmian ‘Apeldoorn’ i ‘Rosy Wing’, uzyskany

z eksplantatów  zaląŜni,  wykładano  na  poŜywki  z  obniŜoną  zawartością  substancji
wzrostowych,  w  stosunku  do  poŜywki  namnaŜającej,  w  celu  formowania  zarodków
somatycznych.  W  czasie  20  tygodni  prowadzenia  kultury  tkanki  embriogenicznej,  na
poŜywkach  z  10  i 5

M Picloramu, określano procent eksplantatów róŜnicujących

zarodki w fazie rozwoju globularnego w zaleŜności od genotypu, stęŜenia auksyny i
czasu trwania kultury. Określano równieŜ liczbę, powstałych z 1 g kalusa, zarodków w
stadium torpedy.

Największy procent eksplantatów róŜnicujących zarodki globularne odnotowano

po 8 i 12 tygodniach prowadzenia kultury, wynoszący odpowiednio 62% i 50% dla
odmiany ‘Apeldoorn’ oraz 32% i 30% dla odmiany ‘Rosy Wing’. RównieŜ po 3
miesiącach kultury uzyskano

najwięcej zarodków w stadium rozwoju torpedo (blisko 14

szt.  u  ‘Apeldoorn’  i  4  szt.  u  ‘Rosy  Wing’),  po  tym  czasie  obniŜała  się  liczba
pozyskiwanych  zarodków.  Formowanie  zarodków  somatycznych  uzaleŜnione  było  od
genotypu  badanej  rośliny.  Średnio  6,64  zarodków  otrzymano  z kalusa  odmiany
‘Apeldoorn’  w ciągu  20  tygodni,  niezaleŜnie  od  poŜywki,  co  stanowiło  trzykrotną,
istotną przewagę nad odmianą ‘Rosy Wing’.

DYNAMICS OF SOMATIC EMBRYO FORMATION IN TULIP

in vitro CULTURES

Małgorzata Maślanka, Anna Bach

Department of Ornamental Plants, Agricultural University, Kraków

Key words:

tulip, somatic embryogenesis, globular and torpedo-shaped embryos

Summary

Embryogenic callus of tulips cv. ‘Apeldoorn’ and ‘Rosy Wing’, obtained from

ovary explants, was put on medium with a lower level of growth regulators, as
compared to the proliferation medium, in order to produce somatic embryos. During 20
weeks of the embryogenic tissue cultivation, treated with 10 and 5

M Picloram, the

effect of genotype, auxin concentration and cultivation time on the globular embryo
differentiation were investigated. The number of torpedo-shaped embryos obtained from
1g of callus were also examined.

The highest percentage of explants forming globular embryos were observed after

8 and 12 weeks of cultivation. For ‘Apeldoorn’ it was 62 and 50%, and for ‘Rosy Wing’
32 and 30%, respectively. After three months of the embryogenic callus cultivation, the
highest number of torpedo-shaped embryos (about 14 for ‘Apeldoorn’ and 4 for ‘Rosy
Wing’) were obtained. However, during the prolongation of culture the embryo number
decreased.

Somatic embryo formation closely depended on the genotype. During 20 weeks

of cultivation, ‘Apeldoorn’ tulip produced, on the average, 6,64 embryos, independently
of medium composition. It trebled the results of ‘Rosy Wing’.