Piotr Świątczak

Tomasz Ramięga

Marcin Kopciara

Ćwiczenie 4

ENZYMATYCZNA HYDROLIZA SUROWCÓW SKROBIOWYCH

Celem ćwiczenia będzie enzymatyczna hydroliza surowców skrobiowych z wykorzystaniem α -amylazy i glukoamylazy.

Schemat budowy skrobi. Amylaza katalizuje hydrolizę wewnętrzną wiązań α(1-4) glikozydowych.

α -amylaza (EC 3.2.1.1) hydrolizuje wiązania α-1,4-glukanowe w polisacharydach zawierających trzy lub więcej jednostek α-D-glukozy powiązanych w pozycjach 1,4. Działa w sposób niewybiórczy, wykazuje małe powinowactwo do oligosacharydów o niskiej masie cząsteczkowej; szybkość hydrolizy jest wprost proporcjonalna do stopnia polimeryzacji substratu. Wraz ze wzrostem jednostek glukozy w łańcuchu, wzrasta stopień hydrolizy. W zależności od pochodzenia α -amylazy produkty hydrolizy skrobi mogą być różne: maltoza, maltotrioza, maltotetroza, maltodekstryny, glukoza. Enzymy z tej grupy umożliwiają hydrolizę wiązań α -1,4-glikozydowych zarówno w amylozie jak amylopektynie. Nie są aktywne w stosunku do wiązań α-1,6- (np. w amylopektynie). Produktami hydrolizy w tym przypadku są oligosacharydy posiadające konfiguracje α przy węglu C1. Enzymy te działają w środku łańcucha polimerowego.

Powoduje to gwałtowny spadek lepkości hydrolizowanego kleiku skrobiowego.Znane są dwa rodzaje α-amylazy: termostabilna i termolabilna. α -amylaza termostabilna jest enzymem pochodzenia bakteryjnego. Termolabilne α-amylazy są enzymami pochodzenia grzybowego. Produktami hydrolizy skrobi

w tym przypadku są: maltoza i maltotrioza. Enzymy pochodzenia grzybowego wykazują większą w porównaniu do swoich bakteryjnych odpowiedników odporność na zmiany pH środowiska

reakcji.

Glukoamylaza (EC 3.2.1.3) hydrolizuje wiązania α-1,4-glukanowe w skrobi, glikogenie, oraz pokrewnych poli- i oligosacharydach usuwając jednostki glukozy od nieredukujących końcow łańcucha. Enzym ten działa na skrobie odcinając po jednej jednostce glukozowej, aż do miejsca rozgałęzienia. Hydroliza wiązań 1,6- glikozydowych z udziałem glukoamylazy również jest możliwa choć proces ten przebiega z bardzo niska szybkością, 20-30 razy mniejszą niż wiązanie α-1,4-glukanowe i tylko w jego obecności. W przypadku wysokich stężeń glukozy lub enzymu możliwa jest także podobnie jak w przypadku hydrolizy kwasowej reakcja repolimeryzacji

(rewersji) glukozy z wytworzeniem maltozy i izomaltozy. Glukoamylaza charakteryzuje sie dużą odpornością na zmiany pH. Enzym ten najwyższa aktywność przejawia przy pH z

zakresu 4,0-5,6 w temperaturze 40-65±C. Odwrotnie niż w przypadku α--amylazy jony Ca2+

wykazują inhibicyjne działanie na proces enzymatycznej hydrolizy z udziałem glukoamylazy.

Enzymatyczna metoda oznaczenia zawartości skrobi polega na całkowitej hydrolizie tego polisacharydu do glukozy przy wykorzystaniu α -amylazy i glukoamylazy. W pierwszym etapie prowadzi się proces upłynnienia skrobi przy wykorzystaniu α -amylazy, następuje spadek lepkości roztworu. W drugi etapie wytworzone dekstryny są hydrolizowane do glukozy przy wykorzystaniu glukoamylazy.

Wykonanie ćwiczenia:

Sporządziliśmy naważkę 1g surowca skrobiowego, którą zawiesiliśmy w 15ml wody. Do zawiesiny wprowadziliśmy 0,2ml roztworu α -amylazy. Zawiesinę ogrzaliśmy w 70ºC w czasie 15 minut, mieszając periodycznie. Następnie roztwór ochłodziliśmy i przelaliśmy do kolby miarowej na 100ml, dodaliśmy 1ml glukoamylazy i uzupełniliśmy buforem octanowym o pH 4,7 do 100ml. Próbę ogrzaliśmy w temp. 60ºC, w czasie 30 minut. Po ochłodzeniu roztworu oznaczyliśmy zawartość glukozy zgodnie z instrukcją.

Wykonanie prób do oznaczenia

	Próba odczynnikowa	Próba wzorcowa	Próba badana
Odczynnik	2 ml	2 ml	2 ml
Wzorzec	-	0,02 ml	-
Roztwór badany	-	-	0,02 ml
H2O	0,02 ml	-	-

Obliczenia ze wzorów

Gdzie:

A_B absorbancja próby badanej

A_WZ absorbancja wzorca

Gdzie:

0,9 współczynnik wynikający z przeliczenia glukozy na skrobię

mg _skrobi w 1g surowca w naszym przypadku to 65 mg _skrobi w 1g surowca.

Tabela z wynikami:

Surowiec	% skrobi	AWZ	AB	Glukoza [^mg/100]	% hydrolizy
Mąka grochowa	45	0,455	1,35	296,7	59,34
Płatki owsiane	69	0,365	1,80	507,0	66,00
Kleik ryżowy	85	0,455	1,55	340,7	36,07
Mąka pszenna	65	0,500	2,00	400,0	55,38
Mąka ryżowa	75	0,200	0,48	240,0	28,80
Mąka Ziemniaczana	80	0,200	2,00	900,0	~100
Kleik ryżowy	85	0,520	2,00	384,0	40,70
Mąka kukurydziana	75	0,520	1,30	250,0	30,00

Wnioski:

α -amylazy i glukoamylazy są enzymami efektywnie hydrolizującymi skrobię. W surowcach poddanych badaniu zawartość skrobi jest różna . Inna jest również wydajność hydrolizy dla każdego z produktów. Wśród badanych surowców, produkty ryżowe oraz mąka kukurydziana charakteryzują się najniższym procentem hydrolizy. Uzyskane wyniki są jednak obarczone pewnym marginesem błędu, wynikającym z niedokładności podczas wykonywania oznaczenia. Widoczne jest to przy mące ziemniaczanej, gdzie % hydrolizy wynosił w granicach 100%, co jest wynikiem niemożliwym do uzyskania w naszych warunkach.

---