Postępy Biochemii 59 (1) 2013

53

Agata Nowak-Stępniowska



Paulina Pergoł
Alfreda Padzik-Graczyk

Pracownia Biochemii, Instytut Optoelektroni-

ki, Wojskowa Akademia Techniczna, Warsza-

wa



Pracownia Biochemii, Instytut Optoelektroni-

ki, Wojskowa Akademia Techniczna, ul. Kali-

skiego 2, 00-908 Warszawa; tel.: [phone],

e-mail: [e-mail]

Artykuł otrzymano 22 lipca 2012 r.

Artykuł zaakceptowano 11 października 2012

r.

Słowa kluczowe: metoda fotodynamiczna,

fotouczulacze, reaktywne formy tlenu, nowo-

twory

Wykaz skrótów: 5-ALA (ang. 5-aminolaevulinic

acid) — kwas 5-aminolewulinowy; CIN (ang.

cervical intraepithelial neoplasia) — wewnątrzna-

błonkowa neoplazja szyjki macicy; EPR (ang.

enhanced vascular permeability and retention)

— wzmożona przepuszczalność naczyniowa

oraz zatrzymywanie cząsteczek w tkance no-

wotworowej; MLA (ang. methyl ester of 5-ALA)

— ester metylowy kwasu 5-aminolewulinowe-

go; PACT (ang. photodynamic antimicrobial che-

motherapy) — fotodynamiczna antybakteryjna

chemioterapia; PDD (ang. photodynamic dia-

gnosis) — diagnostyka fotodynamiczna; PDT

(ang. photodynamic therapy) — terapia fotody-

namiczna; ROS (ang. reactive oxygen specious)

— reaktywne formy tlenu; RRP (ang. recurrent

respiratory papillomatosis) — nawracająca bro-

dawczakowatość układu oddechowego

Metoda fotodynamiczna diagnostyki i leczenia

nowotworów — mechanizmy i zastosowania

STRESZCZENIE

N

owotwory są diagnozowane u ponad kilku milionów ludzi rocznie. Ze względu m.in.

na słabą antygenowość jak i lekooporność większości nowotworów, PDT może stać się

efektywną alternatywną, bądź uzupełniającą do chirurgii, metodą leczenia. PDT wymaga

trzech elementów: fotouczulacza, źródła światła oraz tlenu. PDT jest z sukcesem stosowana

w wielu klinikach na świecie, również w Polsce. Terapia ta jest wykorzystywana w leczeniu

schorzeń onkologicznych (m.in. nowotwory głowy, szyi, płuc, przełyku, trzustki, pęcherza

moczowego, narządu rodnego), jak i nieonkologicznych (liszaj twardzinowy, gronkowiec

złocisty, brodawczakowatość).

WPROWADZENIE — METODA FOTODYNAMICZNA

Pomimo ogromnego postępu w medycynie, wciąż wiele osób na świecie

umiera z powodu zbyt późnej diagnozy lub braku skutecznych metod leczenia

nowotworów (m.in. oporność wielolekowa komórek nowotworowych w che-

mioterapii stanowi poważny problem kliniczny).

Metoda fotodynamiczna jest nową obiecującą techniką diagnozowania (PDD

— Photodynamic Diagnosis) i leczenia (PDT — Photodynamic Therapy) nowo-

tworów, która została zaakceptowana i jest obecnie stosowana w wielu klinikach

[1]. Metoda ta cieszy się dużym uznaniem, ponieważ pozwala przede wszyst-

kim na selektywne niszczenie tkanki nowotworowej bez zbędnych uszkodzeń

tkanek zdrowych. Cechuje się znacznie mniejszymi efektami ubocznymi w po-

równaniu do standardowych terapii (chirurgia, radio- i chemioterapia) [2,3].

Poza zastosowaniami onkologicznymi PDD i PDT znalazły także zastosowanie

w leczeniu wielu schorzeń nieonkologicznych [4].
Terapia fotodynamiczna (PDT) wymaga trzech składników [5]:
• fotouczulacza, który uczula tkankę nowotworową na działanie światła;
• źródła światła, zdolnego do wzbudzenia skumulowanego w tkance nowo-

tworowej fotouczulacza — źródło światła wzbudzającego musi być dobrane

do stosowanego fotouczulacza (pasmo emisji źródła światła musi się pokry-

wać z pasmem absorpcji fotouczulacza — jest to warunek zainicjowania reak-

cji fotochemicznej);

• tlenu rozpuszczonego w tkance.

MECHANIZMY DZIAŁANIA

Znane są dwa główne mechanizmy reakcji fotodynamicznej, które są ściśle

uzależnione od stężenia tlenu w środowisku reakcji [5-7]. W przypadku obu ty-

pów mechanizmów początkowe reakcje przebiegają podobnie (Ryc. 1). W wy-

niku absorpcji fotonu (fotouczulacz naświetlany światłem o długości fali pokry-

wającej się z jego maksimum absorpcji) fotouczulacz przechodzi z singletowego,

podstawowego stanu energetycznego (

1

P

0

) do wzbudzonego stanu singletowe-

go (

1

P

*

). Część energii

zostaje wypromienio-

wana w postaci kwantu

fluorescencji (składowa

diagnostyczna — PDD),

a część energii na skutek

przejścia

międzysys-

temowego (ISC) prze-

prowadza fotouczulacz

do wzbudzonego stanu

trypletowego (

3

P

*

) (skła-

dowa terapeutyczna —

PDT).

Rycina 1. Reakcje zachodzące w mechanizmie typu I oraz II [5].

54

www.postepybiochemii.pl

W mechanizmie typu I (niskie stężenie tlenu w środo-

wisku reakcji) zachodzą dalej następujące przemiany (Ryc.

1). Między wzbudzonym stanem trypletowym fotouczu-

lacza (

3

P

*

) a substratem (RH) czyli tkanką nowotworową

dochodzi do przeniesienia atomu wodoru lub elektronu,

co prowadzi do wytworzenia rodników (R

·

i PH

·

) i aniono-

rodników (P

·-

i RH

·-

) fotouczulacza i substratu, które reagu-

ją z tlenem będącym w podstawowym stanie trypletowym

(

3

Σ

g

3

O

2

), prowadząc do wytworzenia reaktywnych form tle-

nu (ROS, ang. reactive oxygen species), które niszczą tkankę

nowotworową w procesie utleniania [5,6]. Powstanie anio-

norodnika ponadtlenkowego (O

2

·-

) generuje w środowisku

fizjologicznym kolejne ROS (Ryc. 2) [8].

W mechanizmie typu II (wysokie stężenie tlenu w środo-

wisku reakcji), zachodzą dalej następujące przemiany (Ryc.

1). W wyniku przejścia fotouczulacza do wzbudzonego sta-

nu trypletowego (

3

P

*

), dochodzi do przekazania energii mię-

dzy fotouczulaczem we wzbudzonym stanie trypletowym

(

3

P

*

) a cząsteczką tlenu (

3

Σ

g

3

O

2

), znajdującego się w podsta-

wowym stanie trypletowym (przekazanie energii między

cząsteczkami jest dozwolone, ponieważ oba indywidua

występują w tym samym stanie spinowym). W ten sposób

generowany zostaje tlen w stanie wzbudzonym, tzw. tlen

singletowy (

1

∆

g

1

O

2

*

) o silnych właściwościach utleniających.

Stan singletowy charakteryzuje się tym, że wszystkie elek-

trony w atomie są sparowane (spiny antyrównoległe). Na-

tomiast w stanie trypletowym mogą występować atomy

oraz cząsteczki, które posiadają dwa niesparowane elek-

trony (spiny równoległe). Większość związków organicz-

nych występuje w podstawowym stanie singletowym. Tlen

charakteryzuje się trypletowym stanem podstawowym, a

wzbudzonym singletowym. W związku z tym tlen posia-

dając dwa niesparowane elektrony może reagować tylko z

cząsteczką mającą również dwa niesparowane elektrony.

Reaktywność tlenu jest ograniczona, ponieważ znaczna

część cząsteczek ma sparowane elektrony. Dlatego też tlen

w stanie trypletowym, ze względu na trudność ze znale-

zieniem odpowiednich reagentów do reakcji dwuelektro-

nowej, reaguje zazwyczaj ze związkami jednoelektronowo

tj. poprzez przyjęcie od nich jednego elektronu i generując

wolne rodniki. Istnieją dwie formy tlenu singletowego: del-

ta (

1

∆

g

1

O

2

*

) i sigma (

1

Σ

g

1

O

2

*

) (Ryc. 3) [8,9]. W reakcji fotody-

namicznej główną rolę odgrywa jedynie niższy wzbudzony

stan singletowy delta (

1

∆

g

), ponieważ jest to stan metastabil-

ny charakteryzujący się stosunkowo długim okresem półtr-

wania [5].

Mechanizm typu II jest dominujący ze względu na tleno-

wy charakter organizmu ludzkiego. Spadek stężenia tlenu

w czasie, w tkance poddanej fotodynamicznej terapii, jest

proporcjonalny do stężenia fotouczulacza i dawki energii

[7]. W miarę wyczerpywania się tlenu zaczyna przeważać

mechanizm typu pierwszego.

Wolne rodniki są w przeważającej większości czynnika-

mi silnie utleniającymi, ale ze względu na krótkie okresy

półtrwania niszczą struktury komórkowe w najbliższym

sąsiedztwie ich powstawania. Natomiast tlen singletowy

charakteryzuje się dostatecznie długim okresem półtrwania

w środowisku wodnym, aby utlenić także struktury komór-

kowe poza obrębem jego powstania [5].

Reaktywne formy tlenu generowane w wyniku reakcji

fotodynamicznej to czynniki o dużym potencjale destruk-

cyjnym. Czynniki te w pierwszej kolejności niszczą błony

komórek oraz organelli subkomórkowych w szczególności

błony plazmatyczne i mitochondrialne. Jednakże wszystkie

składniki subkomórkowe ulegają uszkodzeniu w zależności

od lokalizacji fotouczulaczy w komórce [5,8,9].

FOTOUCZULACZE

Fotouczulacze stosowane w diagnostyce i terapii metodą

fotodynamiczną muszą spełniać wiele warunków takich jak

[5]:
• powinny być związkami chemicznie czystymi, o znanym

i trwałym składzie;

• powinny wykazywać minimalną toksyczność w ciemno-

ści i być toksyczne tylko w obecności światła;

• powinny selektywnie zatrzymywać się w tkance nowo-

tworowej przez co najmniej kilkadziesiąt godzin;

• nie powinny dawać efektów fototoksycznych w zdro-

wych tkankach;

Rycina 2. Reakcje kolejnych redukcji anionorodnika ponadtlenkowego (w opar-

ciu o [9], zmodyfikowano).

Rycina 3. Formy tlenu singletowego w roztworach wodnych (w oparciu o [9],

zmodyfikowano).

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

55

• powinny charakteryzować się wysoką reaktywnością

fotochemiczną, zdolnością do efektywnej produkcji tle-

nu singletowego i innych reaktywnych form tlenu oraz

długim czasem życia stanu trypletowego, co jest podsta-

wą wysokiej cytotoksyczności dla komórek nowotworo-

wych;

• powinny powodować jak najmniejsze skutki uboczne;
• pasma absorpcji fotouczulaczy nie powinny pokrywać

się z pasmami absorpcji barwników wewnątrz organi-

zmu (endogennych).

W rzeczywistości do tej pory nie znaleziono fotouczu-

lacza, który spełniałby wszystkie te wymogi. Najbardziej

rozpowszechnioną grupą fotouczulaczy są pochodne porfi-

rynowe jak protoporfiryna IX [10]. W latach 70. hematopor-

firyna (Hp) oraz mieszaniny pochodnych hematoporfiryny

(HpD) były najczęściej stosowanymi fotouczulaczami okre-

ślanymi jako pierwsza generacja fotouczulaczy. Pionierskie

wysiłki Doughertiego i innych z Centrum Onkologii Ro-

swell Park dały początek rozwojowi PDD i PDT. Dougherty,

Kessel i współpracownicy z sukcesem wyizolowali dimery

i oligomery do n = 8 z HpD tworząc Photofrin II. Jego dzia-

łanie okazało się dwukrotnie skuteczniejsze w stosunku do

stosowanych przez Lipsona pochodnych hematoporfiryny

(HpD). Dzięki temu terapia fotodynamiczna zaczęła być

stosowana w klinikach, a fotouczulacze dostępne komercyj-

nie [5,6].

W latach 80. powstała druga generacja fotouczulaczy

pochodzących z różnych rodzin chemicznych jak: TPPS

n

—

sulfonowana tetrafenyloporfiryna [11], ftalocyjaniny cynko-

we i glinowe [12], m-THPC — meso-tetra(hydroksyfenylo)

chloryny [13], chloryna e6 [14], m-THPP — meso-tetra(3-

-hydroksyfenylo) porfiryna [15], merocyjanina 540 [16],

hyperycyna [17] czy pochodne błękitu metylenowego [18].

Ogromne zainteresowanie wzbudziło także zastosowanie

kwasu 5-aminolewulinowego (ALA) (Malik i Lugaci, rok

1987), który jest prekursorem endogennej protoporfiryny IX

— ligandu hemu (Ryc. 4a,b) [5].

Liczne badania pokazują, że najlepsze właściwości wy-

kazują fotouczulacze amfifilowe. Posiadają one w swej

strukturze domeny lipofilowe i zwykłe łańcuchy boczne

wykazujące właściwości hydrofilowe. Związki amfifilowe

dobrze kumulują się w komórkach nowotworowych, gdyż

są podwójnie umocowane; częścią cząsteczki w strukturach

lipidowych, a podstawnikami bocznymi w wodnej części

komórki [5].

W Pracowni Biochemii i Spektroskopii Instytutu Opto-

elektroniki Wojskowej Akademii Technicznej w Warsza-

wie opracowano technologię otrzymywania i oczyszczania

nowej klasy fotosensybilizatorów amfifilowych, będących

diaminokwasowymi pochodnymi protoporfiryny PP(dA-

A)

2

Arg

2

(Ryc. 4c) [19]. Opis otrzymywania PP(dAA)

2

poda-

no w patentach [20,21]. Związki te wykazują właściwości

lipofilowe i tylko w niewielkim stopniu rozpuszczają się w

wodzie. W celu uzyskania związków rozpuszczalnych w

wodzie dwie grupy karboksylowe w resztach kwasu pro-

pionowego pierścienia porfirynowego, wysolono argininą

uzyskując połączenia jonowe, co opisują patenty [22,23]. W

ten sposób otrzymuje się związki PP(dAA)

2

Arg

2

dobrze roz-

puszczalne w wodzie, ale jednocześnie dobrze dyfundujące

przez błony biologiczne.

Założono, że przyłączenie aminokwasowych podstaw-

ników do pierścienia porfirynowego zwiększy efektywność

oddziaływania z receptorami błonowymi komórek nowo-

tworowych, co powinno się przyczynić do ułatwienia trans-

portu tych związków do wnętrza komórek i skuteczniej

zwalczać komórki nowotworowe [5,24,25].

Kilka innych fotouczulaczy jest obecnie używanych eks-

perymentalnie w różnych fazach badań przedklinicznych i

klinicznych.

Rycina 4. Struktury związków: a — 5-ALA, b — protoporfiryny IX, c — PP(dAA)

2

Arg

2

.

56

www.postepybiochemii.pl

SUBKOMóRKOWA LOKALIZACJA FOTOUCZULACZY

Oddziaływanie fotouczulacza z komórkami w obrębie

tkanki docelowej lub nowotworowej znacząco wpływa na

wynik PDT. Kluczowym parametrem tych oddziaływań

jest subkomórkowa lokalizacja fotouczulaczy, ponieważ

fotouczulacze mogą lokować się w obrębie wielu różnych

organelli komórkowych takich jak: mitochondria, lizosomy,

siateczka śródplazmatyczna, aparat Golgiego i błony ko-

mórkowe. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja w komórkach

zależy m.in. od struktury fotouczulacza. Fotouczulacze, któ-

re są hydrofobowe mają dwu lub mniejszy ładunek ujemny

(tj.-2,-1,0 itd) mogą dyfundować przez błonę komórkową i

potem przemieścić się do błony organelli wewnątrzkomór-

kowych. Te fotouczulacze także mają zdolność największej

absorpcji w komórkach in vitro, a zwłaszcza gdy są obecne

w stosunkowo niskim stężeniu w obrębie komórkowego

medium. Fotouczulacze, które są mniej hydrofobowe mają

większy niż dwa ładunek ujemny (tj.-2,-3,-4 itd) są zbyt po-

larne, aby dyfundować przez błonę i są w związku z tym

pochłaniane w mechanizmie endocytozy. Absorpcja foto-

uczulacza przez komórki nowotworowe jest kluczowa dla

efektywnego PDT, ponieważ ROS mają krótki okres pół-

trwania i działają blisko miejsca ich powstania. Poznanie

lokalizacji fotouczulacza jest ważne by wybrać najbardziej

efektywny fotouczulacz dla każdego zastosowania [26].

FARMAKOKINETYKA I BIODYSTRYBUCJA

FOTOUCZULACZY

Podany dożylnie fotouczulacz może przyłączyć się do

różnych białek surowicy, co wpływa na jego farmakokine-

tykę i biodystrybucję w obrębie ciała ludzkiego. Farmako-

kinetyka fotouczulaczy zależy od miejsca jego kumulacji

oraz od tego jak mocno wiąże się w obrębie specyficznego

obszaru docelowego (np. komórek nowotworowych). Ta-

kie właściwości farmakokinetyczne fotouczulacza mogą

bezpośrednio wpływać na parametry luminescencji i de-

terminować stopień niszczenia komórek nowotworowych.

Kontakt fotouczulaczy, związanych z białkami surowicy, z

powierzchnią komórek śródbłonka umożliwia związanie z

przydanką naczyń (zewnętrznej błony ściany naczyń). Od

tego etapu, fotouczulacz może albo wiązać się z zewnątrz-

komórkową macierzą albo lokować w obrębie komórek no-

wotworowych. W końcowym etapie, fotouczulacz jest usu-

wany z obszaru docelowego przez naczynia limfatyczne lub

krwionośne i wydalany przez wątrobę lub nerki. Końcowy

efekt PDT w stosunku do komórek nowotworowych zależy

od tego, w którym stadium wchłaniania fotouczulacz zosta-

nie wzbudzany przez światło o odpowiedniej długości fali

[26].

BIOLOGICZNE ASPEKTY ODPOWIEDZI ORGANIZMU

NA TERAPIę FOTODYNMICZNĄ (PDT)

Efekt fotodynamiczny przez szereg lat był uważany jako

efekt działający lokalnie, czyli tylko w tej tkance, w której

został wywołany [5].

Obecnie wiadomo, iż reakcja PDT prowadzi do ogól-

noustrojowej antynowotworowej reakcji immunologicznej

[27,28]. W przypadku nowotworów indukowanych przez

wirusy, układ odpornościowy może rozpoznawać taki an-

tygen wirusowy i go unieszkodliwić. Identyfikacja antyge-

nów związanych z nowotworami jest niezwykle trudna w

przypadku nowotworów nie wywołanych wirusami.

Większość nowotworów posiada mechanizmy, które

utrudniają ich eliminację z organizmu.

Należą do nich m.in.:
• słaba antygenowość,
• częste reakcje krzyżowe z antygenami własnymi,
• immunosupresja,
• zmienność antygenowa.

Komórki nowotworowe charakteryzują się zdolnością

rekrutowania pewnych komórek ze szpiku i krwioobiegu.

Są to m.in. makrofagi, granulocyty, komórki tuczne i fibro-

blasty. Niektóre z rekrutowanych komórek, głównie makro-

fagi i fibroblasty, pod wpływem komórek nowotworowych

podlegają przeprogramowaniu fenotypowemu. W ten spo-

sób powstają charakterystyczne dla nowotworów makro-

fagi TAM (ang. Tumor Associated Macrophages) i fibroblasty

CAF (ang. Carcinoma Associated Fibroblast). Te zmienione

komórki wraz z pozostałymi zrekrutowanymi przez nowo-

twór komórkami łącznie z macierzą pozakomórkową two-

rzą tzw. mikrośrodowisko nowotworowe. To środowisko i

komórki nowotworowe są odpowiedzialne za angiogenezę

i immunosupresję [29,30].

PDT powoduje lub wzmaga odpowiedź antynowotwo-

rową, niszczy strukturę nowotworu i tym samym umoż-

liwia bezpośrednie oddziaływanie pomiędzy komórkami

układu immunologicznego a nowotworowymi, prowadząc

do ogólnoustrojowej antynowotworowej odpowiedzi im-

munologicznej. PDT prowadzi do śmierci komórek nowo-

tworowych na drodze bezpośredniej i pośredniej. Śmierć

na drodze bezpośredniej obserwuje się w wyniku naświe-

tlania, gdy energia jest przekazywana z fotouczulacza w

stanie wzbudzonym do tlenu cząsteczkowego tworząc tlen

singletowy (typ II). Te wysoce reaktywne cząsteczki powo-

dują bezpośrednie fotouszkodzenie białek, tłuszczów i in-

nych cząsteczek w miejscu kumulacji fotouczulacza, prowa-

dząc bezpośrednio do śmierci komórek nowotworowych w

mechanizmie nekrozy i/lub apoptozy. Należy wspomnieć,

że mechanizm śmierci zależy od wielu czynników. Naj-

ważniejsza jest wewnątrzkomórkowa lokalizacja fotouczu-

lacza, ponieważ uszkodzenie mitochondriów generalnie

prowadzi do apoptozy, podczas gdy uszkodzenie np. błon

plazmatycznych może opóźnić lub zatrzymać apoptozę

i indukować nekrozę [31]. Z kolei dawka energii wpływa

na generację nekrozy albo apoptozy. Wysoka dawka ener-

gii dezaktywuje enzymy (kaspaza 3), które są niezbędne

do wywołania apoptozy i prowadzi zazwyczaj do nekrozy

[27,28].

Obserwuje się różnice w ogólnoustrojowej odpowiedzi

immunologicznej, ponieważ nekroza w większym stopniu

niż apoptoza prowadzi do stanu zapalnego, co stanowi

pierwszy krok indukcji specyficznej odpowiedzi immuno-

logicznej.

Fototoksyczne zmiany w śródbłonku naczyń tkanki no-

wotworowej wywołane przez PDT prowadzą do trwałego

niedotlenienia komórek nowotworowych. Efekt naczynio-

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

57

wy wywołany PDT prowadzi do zwiększonej przepuszczal-

ności naczyń, okluzji naczyń, a w rezultacie niedokrwiennej

śmierci pozostałych komórek nowotworowych (ścieżka po-

średnia).

Bezpośredni efekt PDT na komórki odpornościowe może

być szkodliwy. Limfocyty kumulują fotouczulacz i też

mogą zostać zniszczone przy naświetlaniu, prowadząc do

lokalnej supresji układu immunologicznego [27,28].

Komórki układu immunologicznego są znajdowane w

podstawie tkanki nowotworowej, oddzielone od komó-

rek nowotworowych przez zewnątrzkomórkową macierz.

PDT niszcząc strukturę tkanki nowotworowej umożliwia

bezpośrednie oddziaływanie między komórkami układu

immunologicznego a nowotworowymi. Po początkowym

uszkodzeniu komórek nowotworowych i komórek układu

odpornościowego silna reakcja zapalna zachodzi lokalnie,

która aktywuje i przyciąga nieuszkodzone leukocyty z in-

nych miejsc. Fotouszkodzenie błon prowadzi do aktywacji

fosfolipaz błonowych powodując masowe uwalnianie pro-

duktów hydrolizy lipidów i metabolitów kwasu arachido-

nowego [30,32]. Oba te czynniki są mediatorami zapalenia.

Co więcej zmiany w ścianach naczyń krwionośnych przy-

ciągają neutrofile i płytki krwi [33-36]. Te komórki uwal-

niają więcej mediatorów zapalnych, które mają właściwo-

ści chemotaktyczne zdolne do masowej rekrutacji komórek

układu odpornościowego i przemieszczania ich do miejsca

uszkodzenia. PDT jest związana z ekspresją genów i pro-

dukcją białka wielu cytokin: IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, TNF-a,

G-CSF [37,38]. Te cytokiny są ważnymi białkami regulujący-

mi proces zapalny. Uwalnianie tych czynników chemotak-

tycznych z tkanki nowotworowej powoduje przyciąganie i

kumulację nielimfoidalnych komórek charakterystycznych

dla procesu zapalnego. Kilka minut po zakończeniu reak-

cji PDT duża liczba neutrofilów przemieszcza się do tego

obszaru [27,28]. Inwazja neutrofilów poprzedza rekrutację

komórek tucznych, limfocytów T, monocytów i makrofa-

gów [27,28]. Fagocyty usuwają martwe komórki [27,28]. W

celu zwalczenia i długoterminowej kontroli nowotworu jest

ważna ścieżka pośrednia jak i bezpośrednia.

Ze względu na wpływ terapii fotodynamicznej na układ

immunologiczny podejmuje się próby modulacji przeciw-

nowotworowej odpowiedzi immunologicznej z wykorzy-

staniem PDT i elementów układu odpornościowego. Poni-

żej opisano jedną z metod.

MODULACJA PRZECIWNOWOTWOROWEJ

ODPOWIEDZI IMMUNOLOGICZNEJ Z UDZIAŁEM

KOMóREK DENDRYTYCZNYCH I PDT

Odpowiedź immunologiczna jest aktywowana m.in.

przez sygnały niebezpieczeństwa (zagrożenia), rozpozna-

wane przez komórki, które stanowią odporność wrodzo-

ną. Z tych komórek, komórki dendrytyczne (profesjonalne

komórki prezentujące antygen limfocytom T) są głównym

łącznikiem między wrodzoną a nabytą odpowiedzią im-

munologiczną [39]. Jednym z najważniejszych czynników

komórkowych indukowanych w wyniku PDT (który jest

uwalniany z nekrotycznych komórek nowotworowych) jest

zewnątrzkomórkowe HSP70 należące do rodziny białek

szoku cieplnego HSPs [40].

Ekspresję genów, które kodują HSPs indukuje wiele

szkodliwych czynników zarówno egzo- jak i endogennych,

na jakie narażona jest komórka (m.in. wolne rodniki, róż-

ne typy promieniowania). W warunkach prawidłowych,

zawartość HSP70 jest niska, wzrasta dopiero w warun-

kach stresu. Rola m.in. HSP70 w procesie nowotworzenia

związana jest przede wszystkim z ich antyapoptotycznymi

właściwościami, gdyż główną funkcją HSPs jest ochrona

przed czynnikami stresu. Co więcej HSP70 i inne (HSP90

i GRP96) zidentyfikowano w przestrzeni pozakomórkowej.

Okazuje się, że zewnątrzkomórkowo umiejscowione białka

biorą udział w odpowiedzi immunologicznej jak również

wpływają na reakcję zapalną, czego wynikiem jest synteza

cytokin zapalnych [41,42].

Komórki dendrytyczne posiadają specyficzne receptory

dla HSPs. Indukcja HSPs w wyniku PDT może stanowić

sygnał zagrożenia stymulujący różnicowanie komórek den-

drytycznych i indukcję syntezy cytokin, włączając IL-15 i

IL-12, a przez to wzmagać prezentację antygenu limfocy-

tom T CD8

+

). Dlatego prowadząc hodowlę komórek den-

drytycznych w obecności lizatu komórek nowotworowych

uszkodzonych PDT można wzmóc przeciwnowotworową

odpowiedź immunologiczną [40].

RODZAJE ŚMIERCI KOMóRKOWEJ

Uszkodzenia komórkowe mogą prowadzić do:
• nekrozy (stanowi szybką i nagłą śmierć komórek, która

obejmuje całe grupy komórek powodując ostry stan za-

palny na skutek utraty integralności błony komórkowej

i wycieku zawartości komórki. Nagłe uwolnienie dużej

objętości masy białkowej może spowodować nieodwra-

calne zatkanie kanalików nerkowych i poważne kompli-

kacje zdrowotne) [5,43-46].

• apoptozy (programowana śmierć trwa znacznie dłużej

niż nekroza. Ponieważ nie następuje utrata integralno-

ści błony nie dochodzi do ostrego zapalenia w obrębie

leczonej tkanki. Dodatkowo, badania in vitro pokazują

obecność oddziaływań między komórką uszkodzoną a

nieuszkodzoną w wyniku PDT. Reakcja ta ma charakter

kaskadowy. Uszkodzona komórka indukuje apoptozę w

komórce nieuszkodzonej co jest zjawiskiem korzystnym

zwłaszcza w przypadku guzów o dużej masie, kiedy to

światło nie może tak głęboko dotrzeć) [5,31,43-52].

• autofagii (trwają badania nad znaczeniem tego mechani-

zmu w procesie PDT) [53].
Ogólnie rzecz biorąc, odpowiedź komórkowa na uszko-

dzenie zależy od kilku czynników sklasyfikowanych jako

zewnętrzne (stężenie fotouczulacza, dawka energii) i we-

wnętrzne (metabolizm komórkowy, faza cyklu komórko-

wego) mających wpływ na wrażliwość komórek na PDT.

Lokalizacja subkomórkowa fotouczulacza wpływa na to czy

zajdzie apoptoza i w jakim stopniu zajdzie indukcja apop-

tozy w wyniku PDT [31]. PDT może bowiem prowadzić

do apoptozy lub nekrozy albo do kombinacji tych dwóch

mechanizmów [43-46]. Z tych względów, w metodzie PDT,

dąży się do generowania śmierci ze znaczną przewagą

apoptozy w stosunku do nekrozy.

58

www.postepybiochemii.pl

Obecnie trwają prace nad optymalizacją warunków reak-

cji fotodynamicznej leczenia różnego typu nowotworów jak

i chorób nienowotworowych. Poniżej zestawiono obszary

medycyny, gdzie z powodzeniem stosuje się metodę PDT w

leczeniu różnych schorzeń.

ZASTOSOWANIA PDD I PDT

ZASTOSOWANIA PDT W LECZENIU NOWOTWORóW

Przełyk

Choroby przełyku można z powodzeniem diagnozować

i leczyć metodą PDT. W UK PDT zaakceptowano do lecze-

nia chorób przełyku [54,55].

Płuca

PDT jest metodą stosowaną w leczeniu nowotworów

płuc. PDT z użyciem lasera Nd:YAG w przypadkach pa-

liatywnych przedłuża czas życia do nawrotu choroby. W

jednym z badań leczono 144 pacjentów w zaawansowanym

stadium nowotworu. U wszystkich pacjentów występowa-

ło 50% zwężenie światła oskrzeli, powodujące duszności.

Wszyscy pacjenci odpowiedzieli na leczenie PDT. Po 8 tygo-

dniach średnica światła oskrzeli wzrosła do 58% u wszyst-

kich pacjentów, zmniejszając duszności. Średnie przeżycie

wyniosło 5 miesięcy. Wśród pacjentów z wczesnym sta-

dium leczono 16 osób. PDT indukowało kompletną odpo-

wiedź już po 1 zabiegu. U osób z nawrotami choroby dalsze

zabiegi PDT również dały kompletną odpowiedź. Średnia

życia wyniosła 69 miesięcy [54,55].

Trzustka

Opisywane są próby kliniczne z wykorzystaniem foto-

uczulaczy: sulfonowanej ftalocyjaniny glinu (AlsPc), kwasu

5-ALA i mTHPC. W badaniach na ludziach (mTHPC (0,15

mg/kg i dawka energii z zakresu 20-40 J) z 16 pacjentów 7

przeżyło więcej niż rok (średnia życia 9,5 miesiąca) [54,55].

Głowa i szyja

PDT w leczeniu nowotworów głowy i szyi jest atrakcyjną

propozycją. mTHPC stosuje się w Europie do leczenia no-

wotworów głowy i szyi. U pacjentów z wczesnym rakiem

płasko-komórkowym 85% zostało wyleczonych (97 z 114

pacjentów). W przypadku stadium zaawansowanego no-

wotworu w badaniu z 45 osób 12 nie zareagowało na lecze-

nie (średnia życia 2 miesiące). U reszty średnia życia wynio-

sła 16 miesięcy [54,55].

Mózg

W przypadku glejaka wielopostaciowego stosuje się za-

bieg chirurgiczny przy wsparciu obrazowania z użyciem

5-ALA i PDT z wykorzystaniem Photofrinu. W jednym z

badań klinicznych na 27 pacjentów (kontrola 14, a 13 leczo-

nych) — przeżycie wyniosło 52,8 tygodni w stosunku do

24,6 tygodni u nie leczonych osób [54,55].

Terapia fotodynamiczna jako nieinwazyjna metoda zna-

lazła olbrzymie zastosowanie w dermatologii w leczeniu

zmian przednowotworowych, nowotworowych jak i nieno-

wotworowych.

W przypadku zmian nowotworowych w dermatolo-

gii [56] stosuje się dwa główne proleki, 5-ALA i jego ester

metylowy (MLA). Główne wskazania dermatologiczne do

miejscowego stosowania PDT to powierzchniowe nieme-

lanomowe nowotwory skóry i dysplazje (nieprawidłowa

budowa tkanki lub narządu powstająca w okresie rozwo-

jowym). Silnie pigmentowane raki jak melanoma nie odpo-

wiadają dobrze po leczeniu PDT, ponieważ melanina absor-

buje promieniowanie czerwone.

Poniżej opisano wyniki przykładowych chorób leczo-

nych PDT. AK — popromienne rogowacenie — uzyskuje

się odpowiedź na poziomie 70-90% (twarzowa i skórna po-

stać dają lepsze rezultaty, a obwodowa słabiej odpowiada

na leczenie — 44-73% i rośnie wznowa do 19% po 3 latach).

PDT i krioterapia dają podobne rezultaty, ale ze względów

kosmetycznych pacjenci wybierają PDT. BCC — rak pod-

stawno komórkowy — uzyskano 87% skuteczność w przy-

padku powierzchniowego i 53% dla postaci guzowatej ze

wznową 18% po 45 miesiącach. BD — choroba Bowen’a —

miejscowe PDT jest tu szeroko stosowane. Skuteczność wy-

nosi 86-93% z 18% wznów w okresie 3-5 lat. Miejscowe PDT

może być potencjalnie używane w leczeniu pacjentów po

przeszczepie organów, w których znacząco wzrosło ryzyko

rozwoju dysplastycznych zmian skórnych i raków niemela-

nomowych skóry.

INNE ZASTOSOWANIA PDT

Rozwój bakterii lekoopornych na standardowe leczenie

wzmogło poszukiwania niestandardowych metod leczenia.

PDT ma szanse być metodą stosowaną do miejscowych in-

fekcji. PDT może zmniejszyć potrzebę używania antybioty-

ków. Stąd wprowadzono pojęcie PACT — fotodynamiczna

antybakteryjna chemioterapia [57].

Tlen singletowy jako czynnik antybakteryjny ma krótki

okres półtrwania i ograniczony dystans dyfuzją (100 nm).

Rycina 5. Porównanie budowy bakterii gram ujemnych i dodatnich (w oparciu o

[57], zmodyfikowano).

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

59

W przypadku bakterii, efekt letalny związany z PDT za-

chodzi na poziomie kwasów nukleinowych [58] lub błony

komórkowej [59] lub na obu poziomach jednocześnie [60].

Bakterie gram ujemne mają dwie błony: cytoplazmatyczną

i zewnętrzną (Ryc. 5). Obecność lipopolisacharydów w ze-

wnętrznej błonie bakterii gram ujemnych wiąże się z silnym

ujemnym ładunkiem, który czyni błonę nieprzepuszczalną

dla neutralnych i anionowych związków.

Badania ostatniej dekady pokazały, że anionowe foto-

uczulacze mogłyby być efektywne w połączeniu z czynni-

kami zwiększającymi przepuszczalność zewnętrznej błony

bakterii gram ujemnych m.in. polimiksyną i EDTA [61].

Pokazano, że przyłączenie fotouczulaczy jak ftalocyjaniny,

porfiryny i chloryny do kationowych polipeptydów daje

efektywną inaktywację bakterii gram + i — (Tab. 1)[62].

Metoda fotodynamiczna znalazła także zastosowanie w

leczeniu brodawczakowatości spowodowanej przez ludzki

wirus brodawczaka HPV. Nawracająca brodawczakowa-

tość układu oddechowego (RRP, ang. Recurrent Respiratory

Papillomatosis), wywołana przez HPV typu 6 i 11 jest naj-

częstszym łagodnym nowotworem krtani u dzieci. Kon-

wencjonalne metody nie zapobiegają przed wielokrotnymi

nawrotami choroby. W jednym z badań klinicznych zasto-

sowano miejscowo PDT z wykorzystaniem eteru dihemato-

porfiryny (4,25 mg/kg, 50J) na 48 pacjentach. Zaobserwo-

wano wyraźną poprawę. Obiecujące wyniki uzyskali także

inni badacze (statystycznie 50% poprawy). HPV wywołuje

także brodawczaki układu rozrodczego. U kobiet HPV in-

fekuje szyjkę macicy (typ 16 lub 17) i może prowadzić do

rozwoju wewnątrznabłonkowej neoplazji szyjki macicy

(CIN, ang. Cervical Intraepithelial Neoplasia), a nawet raka

szyjki macicy. W badaniach klinicznych PDT z użyciem ete-

ru/estru polihematoporfiryny (2 mg/kg, laser YAG-OPO)

uzyskano wysoką skuteczność w leczeniu CIN, ale też raka

szyjki macicy. Miejscowo stosuje się PDT z wykorzystaniem

5-ALA lub MLA w leczeniu kłykciny sromu, prącia i po-

chwy (20% 5-ALA, 100 J/cm

2

, skuteczność 95% po 1 zabie-

gu, 100% po 2 zabiegach, % wznów 6,3) [63-65].

Na koniec przedstawiono zastosowania PDT w leczeniu

schorzeń skórnych różnego pochodzenia (Tab. 2).

NANOTECHNOLOGIA W PDT

W terapii fotodynamicznej jednym z problemów ograni-

czających zastosowanie wielu fotouczulaczy jest trudność z

przygotowaniem formuły farmaceutycznej, która umożliwi

ich pozajelitowe podanie.

Problemy fotouczulaczy I-szej generacji to: są mieszani-

nami kilku częściowo niezidentyfikowanych porfiryn, sła-

ba selektywność, niski współczynnik ekstynkcji (wymagają

podania sporej ilości by uzyskać satysfakcjonujący efekt);

słaba penetracja tkanek (maximum absorpcji przy stosun-

kowo krótkich długościach fal, 630 nm) oraz wysoka ku-

mulacja w skórze (6-8 tygodni wrażliwości na światło po

PDT). Problemy Photofrinu II dały rozwój fotouczulaczom

II-ej generacji, które są czyste, dobrze scharakteryzowane,

silnie generują tlen singletowy, mają silne pasma absorpcji

w zakresie 650-800 nm i głęboko penetrują tkanki. Wadą

jest ich hydrofobowość. Słaba rozpuszczalność w wodzie,

hydrofobowych fotouczulaczy ogranicza ich dożylne poda-

nie [68,69].

Z tych powodów powstały różne strategie rozwoju sys-

temów dostarczania leków. Należą do nich m.in. osadzanie

fotouczulacza na nośniku koloidalnym jak: liposomy, czą-

steczki polimerowe czy olejowe układy zdyspergowane;

pułapkowanie fotouczulacza w lipofilowym rdzeniu lipo-

proteiny niskiej gęstości LDL oraz koniugaty fotouczulacz-

-przeciwciało monoklonalne (mAb), fotouczulacz-nanoczą-

steczka-mAb [68-73].

PASYWNE SYSTEMY DOSTARCZANIA FOTOUCZULACZY

Pasywne systemy docelowe wykorzystują naturalne

ścieżki dystrybucji: dyfuzję pasywną, fagocytozę. Zalicza-

my do nich: liposomy, olejowe układy zdyspergowane,

biodegradowalne cząsteczki polimerowe i hydrofilowe po-

limery.

Badania pokazują, że selektywna kumulacja tych nośni-

ków następuje na skutek wzmożonej przepuszczalności

naczyniowej oraz zatrzymywania różnych cząsteczek w

tkance nowotworowej (EPR, ang. Enhanced Vascular Perme-

ability and Retention) [74,75]. Nieszczelna sieć naczyń krwio-

nośnych tkanki nowotworowej prowadzi do wytworzenia

nieprawidłowej bariery śródbłonkowej; słaby drenaż limfa-

tyczny natomiast upośledza układ limfatyczny lub prowa-

dzi do niedrożności limfatycznej i wzrostu przepuszczalno-

ści naczyń. Te mechanizmy dają sposobność nośnikom aby

osiągnąć cel przez dyfuzję prostą. Wzrost przepuszczal-

ności naczyń włosowatych wielu nowotworów następuje

wskutek zaburzenia śródbłonkowej integralności komórki

prowadząc do aktywacji czynników wydzielniczych lub

prozapalnych. Te zjawiska mogą wzmóc zewnątrznaczy-

niowy transport makrocząsteczek. Pasywne gromadzenie

się makrocząsteczek długo krążących w tkance nowotworo-

wej na skutek EPR zwiększa stężenie fotouczulacza w tkan-

ce nowotworowej [68-70].

Tabela 1. Badania przeżywalności gronkowca złocistego pod wpływem PDT w różnych warunkach. Testy in vitro (na podstawie [57], zmodyfikowano).

Szczep gronkowca

lub fenotyp

Stężenie fotouczulacza

Całkowita dawka

energii [J/cm

2

]

Efekt

S. aureus Cowan I

EMRSA-16

Bchlide-IgG (10 µM)

SnCe6-IgG (4,25 µg/ml)

42

21

>99.9%

70-99,9% w zależności od fazy wzrostu

S. aureus NCTC 6571,

MRSA (dwa szczepy:

EMRSA-15 i EMRSA-16)

EMRS-12

MRSA

Dimetylowy błękit metylenowy (0,5-2,0 µM)

Sulfonowana ftalocyjanina glinu (6,0 mg/l)

5-ALA (0,38 mM)

6.3

147

100

100% śmiertelność

100% śmiertelność

100% śmiertelność

60

www.postepybiochemii.pl

Liposomy to lipidowe pęcherzyki złożone z jednej lub

więcej koncentrycznie ułożonych biwarstw fosfolipido-

wych. Ich główne składniki to fosfolipidy i cholesterol,

które są obecne w organizmie w dużych ilościach, dlatego

powinny być biokompatybilne. Prowadzone są badania

eksperymentalne oraz kliniczne z udziałem nośników lipo-

somowych jako efektywnych systemów dostarczania foto-

uczulacza w PDT. Liposomalny BPD-MA zaaprobowano do

leczenia w Szwajcarii i USA [68-70].

Olejowe układy zdyspergowane to m.in. CRM — Cre-

mophor-EL niejonowy polioksyetylowany olej rycynowy

stosowany jako czynnik emulsyfikujący. Badania pokazują

preferencyjne pochłanianie fotouczulacza zdyspergowane-

go w CRM przez tkankę nowotworową. W badaniu PDT z

wykorzystaniem fotouczulacza hematoporfiryny oraz CRM

nastąpiła regresja przeszczepionego nowotworu pęcherza

moczowego u szczura przy znacząco niższym stężeniu foto-

uczulacza w porównaniu z Hp-PDT. Z kolei CRM okazał się

skuteczniejszy niż liposom DPPC (dipalmitylofosfatydylo-

cholina) przy zastosowaniu fotuczulacza SnET

2

w leczeniu

tego samego typu nowotworu [69].

Tabela 2. PDT w leczeniu nienowotworowych chorób skóry [66].

Nienowotworowe choroby skórne odpowiadające na leczenie 5-ALA-PDT

Brodawka wirusowa

Grudkowa zmiana skórna wywołana wirusem HPV. Trwają badania nad PDT

z użyciem 20% kremu 5-ALA i różnych źródeł światła: lampy, LED, lasery, by

osiągnąć najefektywniejsze leczenie przy min. skutkach ubocznych [67].

Trądzik młodzieńczy

(pospolity)

Nie opracowano optymalnych parametrów PDT. Testuje się różne

źródła światła i moce dla PDT z użyciem 5-ALA.

Łuszczyca

Prowadzono badania pilotażowe z użyciem różnych stężeń 5-ALA (0, 2, 10 lub 20 %) i dawek energii

z zakresu 1-30 J/cm

2

. Polepszenie było widoczne u niektórych pacjentów już po 1 zabiegu, ale

efektywne leczenie obserwowano po kilkukrotnych zabiegach. Metoda wymaga dalszych badań.

Ropne zapalenie

gruczołów potowych

Choroba wywołana przez gronkowca wywołująca w gruczołach potowych i otaczającej tkance łącznej stan

zapalny. W leczeniu tej choroby metoda PDT wymaga dalszych badań nad potwierdzeniem skuteczności.

Liszaj twardzinowy

Przewlekła choroba zewnętrznych narządów płciowych. Następuje pogrubienie skóry z

wytworzeniem białawych grudek czemu towarzyszy ból i swędzenie. Uzyskano objawowe

polepszenie po PDT z użyciem 20% kremu 5-ALA i dawki energii 80 J/cm

2

. Po 6-8 tyg. u

10 z 12 kobiet nastąpiła redukcja objawów. Efekt utrzymywał się 3-9 miesięcy.

Twardzina skóry

Przewlekła choroba autoimmunologiczna, charakteryzująca się stwardnieniem skóry i tkanek na skutek

nadmiernego gromadzenia się kolagenu. Stosowano PDT z użyciem 3% 5-ALA i dawki energii 10 J/cm

2

. Zabiegi

przeprowadzano raz lub dwa razy na tydzień, przez 3-6 miesięcy w zależności od odpowiedzi klinicznej.

Choroba cofnęła się. Metoda wymaga dalszych badań aby potwierdzić jej skuteczność w badanych warunkach.

Choroba Darier’a

Genetycznie uwarunkowana choroba skóry wywołana zaburzeniem procesu rogowacenia

w obrębie mieszków włosowych i poza nimi. Zmiany dotyczą skóry, błon śluzowych oraz

paznokci. PDT z użyciem 20% 5-ALA i dawki energii 150 J/cm

2

może być wspomagającą

terapią, ale nie może zastąpić standardowego leczenia retinoidami.

Choroba Hailey-Hailey

Rzadka choroba pęcherzowa o dziedziczeniu autosomalnym, dominującym. Leczono z

powodzeniem 2 pacjentów z wykorzystaniem 20% kremu 5-ALA i naświetlano dawką

energii 120 J/cm

2

. Leczenie powtórzono po 2 miesiącach. Biopsje wykazały prawidłowy

naskórek. Nastąpiły remisje po 19 i 25 tygodniach. Mechanizm jest niejasny.

Nadmierne owłosienie

Prowadzono badania z użyciem 20% 5-ALA, dawek energii 100 i 200 J/cm

2

z wykorzystaniem lasera

argonowego. 3 miesiące po PDT 100 J/cm

2

90% włosów odrosło w stosunku do 50% w obszarach naświetlonych

200 J/cm

2

. Wysokie dawki mogą zapewnić całkowitą utratę owłosienia. Biopsja przed i po leczeniu

wskazuje na selektywne niszczenie naskórka i mieszków włosowych oszczędzając skórę właściwą.

Znamię łojowe

Występuje w postaci pojedynczego guza o zrazikowej lub brodawkowatej powierzchni

i żółtym zabarwieniu. Lokalizuje się zazwyczaj na owłosionej skórze głowy bądź

twarzy. 20% 5-ALA i dawka energii 50 J/cm

2

zapewniają efektywne leczenie.

Prąciowy liszaj płaski

Towarzyszy często chorobom autoimmunologicznym. Jest to przewlekła choroba skóry i błon

śluzowych atakująca często skórę genitaliów. Leczenie z użyciem 20% 5-ALA i dawką energii

50 J/cm

2

dało wyraźne polepszenie po 4 tyg. Po 6 miesiącach nie nastąpił nawrót choroby.

Metoda może być z powodzeniem stosowana w leczeniu prąciowego liszaja płaskiego.

Sarkoidoza

Choroba związana z układem odpornościowym. Charakteryzuje ją powstawanie ziarniniaków,

czyli małych grudek zapalnych nie ulegających martwicy. Guzowata sarkoidoza skórna jest

podatna na leczenie PDT z wykorzystaniem 5-ALA (żel 3% 5-ALA i dawka energii 20 J/

cm

2

). Po 3 miesięcznym leczeniu zmiany ustąpiły. Leczenie bez procesu zapalnego.

Nienowotworowe choroby skórne oporne na działanie 5-ALA-PDT

Międzypalcowe grzybice

Badania nie wykazały skuteczności stosowania PDT z wykorzystaniem 5-ALA. Badacze sądzą,

że pewne dotknięte chorobą obszary skóry mogą nie być osiągalne w leczeniu z powodu

skomplikowanego kształtu przestrzeni między palcowej wyjaśniają słabe rezultaty lecznicze.

Łysienie plackowate

Choroba skórna o nieustalonej do tej pory etiopatogenezie (prawdopodobnie o podłożu genetycznym).

Charakteryzuje się występowaniem przejściowych bądź trwałych ognisk wyłysienia (brak ognisk

zapalnych). Obserwuje się brak efektów leczniczych po PDT z użyciem 5-ALA. Badacze podają,

że być może serie 20 zabiegów leczniczych mogłyby dać zauważalną odpowiedź na terapię.

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

61

Biodegradowalne nanocząsteczki (m.in. PLA — poli(D,L-

-kwas mlekowy) są alternatywą dla liposomów dzięki szero-

kiej różnorodności materiałów i procesu wytwarzania. Dla

PDT doświadczenia prowadzono m.in. z hematoporfiryną,

ftalocyjaniną i m-THPC osadzonych na biodegradowal-

nych nanocząsteczkach [68]. Obiecujące wyniki uzyskano

w stosunku do nowotworu EMT-6 z użyciem fotouczulacza

ZnPcF

16

z PLA i emulsji CRM. Uzyskano 100% skuteczność

z PLA w porównaniu do 60% z CRM [69].

Terapeutyczne zastosowania pozajelitowo podanych no-

śników koloidalnych są ograniczone z powodu ich szybkiej

eliminacji z krążenia. Pochłanianie nośników przez jedno-

jądrowe fagocyty jest promowane przez opsonizację. Aby

przedłużyć ich cyrkulację w krwioobiegu dodatkowo mo-

dyfikuje się ich powierzchnię (zmiana ładunku, hydrofobo-

wości, stabilizacja steryczna) [69].

AKTYWNE SYSTEMY DOSTARCZANIA

FOTOUCZULACZY

Selektywne dostarczanie fotouczulacza do tkanki nowo-

tworowej jest możliwe dzięki ukierunkowaniu fotouczula-

cza poprzez tworzenie koniugatów z udziałem cząstek na-

kierowanych na receptor docelowy (fotouczulacz-mAb lub

fotouczulacz-nanocząsteczka-mAb) [68-70]. Do głównych

zalet tej strategii należą: wysokie powinowactwo wiążącej

cząstki do receptora lub antygenu docelowej powierzchni

komórki; bezpośrednia lub bardziej specyficzna lokalizacja

dzięki czemu można zwiększyć wydajność i selektywność

PDT stosując niższe stężenia fotouczulacza. Niezbędnym

wymogiem tej strategii jest nietoksyczność, nieimmuno-

genność i biodegradowalność koniugatów; stabilność ko-

niugatów w krwioobiegu i zdolność do pokonania barier

fizjologicznych i osiągnięcia miejsca docelowego przed in-

ternalizacją.

W tych celach wykorzystuje się m.in. lipoproteiny i prze-

ciwciała monoklonalne. W klasie lipoprotein, lipoproteiny

niskiej gęstości LDL odgrywają ważną rolę w transporcie

i uwalnianiu cząsteczki fotouczulacza do komórek nowo-

tworowych. Synteza receptorów LDL na powierzchni ko-

mórki jest regulowana przez jej zapotrzebowanie na cho-

lesterol. Wiadomo, że szybko proliferujące komórki mają

wysokie zapotrzebowanie na cholesterol do syntezy błon

komórkowych. Badania pokazują, że fotouczulacz złączo-

ny niekowalencyjnie z LDL przed podaniem prowadzi do

wzrostu wydajności PDT w porównaniu z podaniem same-

go fotouczulacza [69,70,73].

Inna strategia zakłada koniugację fotouczulacza z prze-

ciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko spe-

cyficznym antygenom komórek nowotworowych. Istnieją

bowiem różnice między komórkami zdrowymi i nowotwo-

rowymi, m.in. wyższa synteza specyficznych antygentów

i onkobiałek przez komórki nowotworowe [74,76,77]. We

wstępnych badaniach Hp-PDT z przeciwciałami skierowa-

nymi przeciw antygenom mięśniako-mięsaka M1 uzyska-

no 95% skuteczność (równoważne stężenie samego Hp lub

mAb stosowano jako kontrole).

Pomimo zachęcających rezultatów in vitro wiele proble-

mów trzeba jeszcze pokonać przed próbami klinicznymi.

Wydajność in vivo koniugatów fotouczulacz-mAb lub fo-

touczulacz-nanocząsteczka-mAb zależy bowiem od wielu

czynników, które mogą wpływać na dostępność do tkanki

nowotworowej. Zmiany w profilu antygenowym komórek

nowotworowych prowadzą do utraty specyficzności re-

ceptorów. Sugeruje się podawanie mieszanin przeciwciał

skierowanych przeciwko różnym antygenom, aby osiągnąć

maksymalną skuteczność. Do niedawna większość przeciw-

ciał używanych w badaniach klinicznych stanowiły prze-

ciwciała mysie, mogące powodować reakcje antyidiotypo-

we reakcje. Obecnie dostępne są już mniej immunogenne

przeciwciała chimeryczne, humanizowane i ludzkie [69-72].

Wzrost efektu PDT i zmniejszenie stężenia fotouczulacza

można osiągnąć używając specyficznych cząsteczek „wy-

szukujących” komórki nowotworowe jak czynnik wzrostu

EGF, specyficzne białka (transferyna) [78] czy hormony

(insulina) jako alternatywę dla mAb [69,71,72]. Nowe roz-

wiązania pozwalające na większą selektywność, większą

kumulację fotouczulacza, a przez to mniejsze dawki leku

dają obiecujące rezultaty. Przed naukowcami jeszcze wiele

lat badań nad optymalizacją leczenia nowotworów z wyko-

rzystaniem nanotechnologii i ich bezpieczeństwem, ale do-

tychczasowe wyniki dają duże nadzieje.

PDT W POLSCE

W Polsce prowadzone są badania diagnostyczne oraz

terapeutyczne z zakresu: dermatologii, gastroenterologii,

laryngologii, pulmonologii, ginekologii i ortopedii z uży-

ciem 5-ALA i Photofrinu. Do głównych klinik zajmujących

się PDT w Polsce należą: Centrum Laserowej Diagnostyki i

Terapii Fotodynamicznej w Bytomiu i Klinika Urologii Uni-

wersytetu Medycznego w Łodzi oraz Katedra Ginekologii i

Położnictwa Śląskiego Uniwersytetu Medycznego, Klinika

Ginekologii Onkologicznej B Centrum Onkologii w Warsza-

wie oraz Klinika Chorób Przyzębia Uniwersytetu Medycz-

nego w Białymstoku [5,79,80].

PODSUMOWANIE

Opracowywanie nowoczesnych i skutecznych metod

diagnozowania oraz terapii nowotworów jest wciąż waż-

nym elementem medycyny. Metoda fotodynamiczna może

stać się istotnym narzędziem współczesnej onkologii mie-

dzy innymi ze względu na częstą immunosupresję standar-

dowych metod, jak naświetlanie czy chemioterapia. PDT

natomiast w leczeniu miejscowych infekcji bakteryjnych

pozwala w zasadniczy sposób zredukować czas leczenia,

efekty uboczne obserwowane po podaniu antybiotyków i

w wielu przypadkach obniżyć koszty terapii. Zastosowanie

natomiast nanotechnologii w PDT daje bardzo obiecujące

wyniki pozwalające na znaczące podwyższenie efektywno-

ści PDT przy obniżeniu skutków ubocznych terapii.

PIŚMIENNICTWO

1. Schuitmaker JJ, Baas P, van Leengoed HLLM, van der Meulen FW,

Star WM, van Zandwijk N (1996) Photodynamic therapy: a promising

new modality for the treatment of cancer. J Photochem Photobiol B

34: 3-12

2. Sibata CH, Colussi VC, Oleinick NL, Kinsells TJ (2001) Photodynamic

therapy in oncology. Expert Opin Pharmacother 2: 917-927

62

www.postepybiochemii.pl

3. Agostinis P, Berg K, Cengel KA, Foster TH, Girotti AW, Gollnick

SO, Hahn SM, Hamblin MR, Juziene A, Kessel D, Korbelik M, Moan

J, Mroz P, Nowis D, Piette J, Wilson B, Golab J (2011) Photodynamic

Therapy of Cancer: an update. Cancer J Clin 61: 250-281

4. Szeimies RM, Landthaler M, Karrer S (2002) Non-oncologic indica-

tions for ALA-PDT. J Dermatolog Treat 13(Suppl1): 13-18

5. Graczyk A (1999) Photodynamic diagnosis and treatment of cancer,

Bellona, Warszawa, ch.1-2, pp. 21-159 (in Polish)

6. Juzeniene A, Moan J (2007) The history of PDT in Norway Part one:

identification of basic mechanisms of general PDT. Photodiagn Pho-

todyn Ther 4: 3-11

7. Castano AP, Demidova TN, Hamblin MR (2005) Mechanisms in pho-

todynamic therapy: part two-cellular signaling, cell metabolism and

modes of cell death. Photodiagn Photodyn Ther 2: 1-23

8. Bartosz G (2006) Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie.

PWN, Warszawa

9. Halliwell B, Gutteridge JM (1984) Free radicals, lipid peroxidation, and

cell damage. Lancet 2: 1095

10. Sternberg ED, Dolphin D (1998) Porphyrin-based photosensitizers for

use in photodynamic therapy. Tetrahedron 54: 4151-4202

11. Evensen JF, Moan J, Winkelman JW (1987) Toxic and phototoxic effects

of tetraphenylpophinesulphonate and haematoporphyrin derivative

in vitro. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med 51: 477-491

12. Berg K, Bommer JC, Moan J (1989) Evaluation of sulfonated aluminum

phthalocyanines for use in photochemotherapy. A study on the rela-

tive efficiences of photoinactivation. Photochem Photobiol 49: 587-594

13. Ma L, Moan J, Berg K (1994) Evaluation of a new photosensitizer, me-

so-tetra-hydroksyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a

comparison of its photobiological properties with those of two other

photosensitizers. Int J Cancer 57: 883-888

14. Cunderlikova B, Gangeskar L, Moan J (1999) Acid-base properties of

chlorin e6: relation to cellular uptake. J Photochem Photobiol B 53: 81-

90

15. Friberg EG, Cunderlikova B, Pettersen EO, Moan J (2003) PH effects on

the cellular uptake of four photosensitizing drugs evaluated for use in

photodynamic therapy of cancer. Cancer Lett 195: 73-80

16. Cunderlikova B, Sikurova L, Moan J (2003) PH, serum proteins and

ionic strength influence the uptake of merocyanine 540 by WiDr cells

and its interaction with membrane structures. Bioelectrochemistry 59:

1-10

17. Uzdensky AB, Bragin DE, Kolosov MS, Kubin A, Loew HG, Moan J

(2003) Photodynamic effect of hypericin and a water-soluble deriva-

tive on isolated crayfish neuron and surrounding glial cells. J Photo-

chem Photobiol B 72: 27-33

18. Peng Q, Brown SB, Moan J (1993) Biodistribution of a methylene blue

derivative in tumor and normal tissue of rats. J Photochem Photobiol

B 20: 63-71

19. Ye S, Czuba M, Romiszewska A, Karolczak J, Graczyk A (2003) Inves-

tigation of photo-physical properties of selected diaminoacid photo-

porphyrin derivatives PP(AA)Arg

2

. I determination of quantum yield

of fluorescence. Optica Applicata 2-3(XXXIII0): 489-503

20. Padzik-Graczyk A, Konarski J, Sobczyńska J (1994) Sposób otrzymy-

wania hemin. Patent PL 165248 B1/94

21. Konarski J (1990) Sposób otrzymywania nowych pochodnych di(l-ety-

lo)deuteroporfiryny. Patent PL 148775/1990

22. Padzik-Graczyk A, Konarski J (1994) Sposób otrzymywania soli

kompleksowych hematoporfiryny i jej pochodnych. Patent PL165249

B1/1994

23. Graczyk A, Konarski J (1995,1997) Complex salts of hematoporphyrin

and its derivatives, their synthesis and therapeutic agents. Patents US

5, 45, 599A/95, EPO 539960 A2/97

24. Misiewicz-Krzemińska I, Skupińska K, Graczyk A, Kasprzycka-Gutt-

man T (2009) Influence of protoporphyrin IX amino acid substituents

on affinity to human breast adenocarcinoma MCF-7 cells. Biotech His-

tochem 84: 1-7

25. Nowak-Stępniowska A, Wiktorska K, Małecki M, Romiszewska A,

Padzik-Graczyk A (2011) Cytotoxicity of PP(Arg)

2

and PP(Ala)

2

(Arg)

2

-

mediated photodynamic therapy and early stage of apoptosis induc-

tion in prostate cancer in vitro. Acta Biochim Pol 4: 495-505

26. Robertson CA, Hawkins D, Abrahamse H (2009) Photodynamic thera-

py (PDT): A short review on cellular mechanisms and cancer research

applications for PDT. J Photochem Photobiol B 96: 1-8

27. van Duijnhoven FH, Aalbers RIJM, Rovers JP, Terpstra OT, Kuppen P

(2003) The immunological consequences of photodynamic treatment

of cancer, a literature review. Immunobiol 207: 105-113

28. Nowis D, Stokłosa T, Legat M, Issat T, Jakóbisiak M, Gołąb J (2005) The

influence of photodynamic therapy on the immune response. Photodi-

agn Photodyn Ther 2: 283-298

29. Szala S (2009) Angiogeneza i immunosupresja: jin i jang progresji no-

wotworów. Postepy Hig Med Dosw 63: 598-612

30. Jakóbisiak M, Gołąb J (2007) Immunologia. PWN, Warszawa, pp.
31. Oleinick NL, Morris R, Belichenko I (2002) The role of apoptosis in re-

sponse to photodynamic therapy: what, where, why how. Photochem

Photobiol Sci 1: 1-21

32. Almeida RD, Manadas BJ, Carvalho AP, Duarte CB (2004) Intracellu-

lar signaling mechanisms in photodynamic therapy. Biochim Biophys

Acta 1704: 59-86

33. Cecic I, Korbelik M (2002) Mediators of peripheral blood neutrophilia

induced by photodynamic therapy of solid tumors. Cancer Lett 183:

43-51

34. Cecic I, Parkins S, Korbelik M (2001) Induction of systemic neutrphill

response in mice by photodynamic therapy of solis tumors. Photo-

chem Photobiol 74: 712-720

35. Cecic I, Korbelik M (2002) Mediators of peripheral blood neutrophilia

induced by photodynamic therapy of solid tumors. Cancer Lett 183:

43-51

36. Cecic I, Stott B, Korbelik M (2006) Acute phase response-associated

systemic neutrophil mobilization in mice bearing tumors treated by

photodynamic therapy. International Immunopharmacol 6: 1259-1266

37. Gollnick SO, Evans SS, Baumann H, Owczarczak P, Maier P, Vaughan

L, Wang WC, Unger E, Henderson BW (2003) Role of cytokines in

photodynamic therapy-induced local and systemic inflammation. Br

J Cancer 88: 1772-1779

38. de Vree WJA, Essers MC, Koster JF, Sluiter W (1997) Role of interleu-

kin 1 and granulocyte colony-stimulating factor in photofrin-based

photodynamic therapy of rat rhabdomyosarcoma tumors. Cancer Res

57: 2555-2558

39. Kopeć-Szlęzak J (2008) Biologia komórek dendrytycznych. Onkol Pol

11: 106-110

40. Jung NC, Kim HJ, Kang MS, Lee JH, Song JH, Seo HG (2012) Photo-

dynamic therapy-mediated DC immunotherapy is highly effective for

the inhibition of established solid tumors. Cancer Lett 324: 58-65

41. Laskowska E (2007) Małe białka szoku termicznego — rola w apopto-

zie, kancerogenezie i chorobach związanych z agregacją białek. Poste-

py Biochem 1: 19-26

42. Kazimierczuk A, Kiliańska ZM (2009) Plejotropowa aktywność białek

szoku cieplnego. Postepy Hig Med Dosw 63: 502-521

43. Kessel D (2006) Death pathways associated with photodynamic thera-

py. Med Laser Appl 21: 219-224

44. Plaetzer K, Kiesslich T, Verwanger T, Krammer B (2003) The modes

of cell death induced by PDT: an overview. Med Laser Appl 18: 7-19

45. Buytaert E, Dewaele M, Agostinis P (2007) Molecular effectors of mul-

tiple cell death pathways initiated by photodynamic therapy. Biochim

Biophys Acta 1776: 86-107

46. Kłyszejko-Stefanowicz L (2002) Cytobiochemia. Biochemia niektórych

struktur komórkowych. Wydawnictwo naukowe PWN

47. Grądzka I (2006) Mechanizmy i regulacja programowanej śmierci ko-

mórek. Postepy Biochem 2: 157-165

48. Wojtczak L, Zabłocki K (2008) Mitochondria w życiu, chorobie i śmier-

ci komórki. Postepy Biochem 2: 129-141

49. Kmita H, Stobienia O (2006) Kanał VDAC jako regulator funkcji mito-

chondriów. Postepy Biochem 2: 129-136

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

63

50. Skalska J, Dębska-Vielhaber G, Głąb M, Kulawiak B, Malińska D, Bed-

narczyk P, Dołowy K, Szewczyk A (2006) Mitochondrialne kanały jo-

nowe. Postepy Biochem 2: 137-144

51. Jóźwiak Z, Marczak A (2006) Rola kanałów jonowych w procesie

apoptozy. Postepy Biochem 4: 373-382

52. Czarna M, Jarmuszkiewicz W (2006) Rola mitochondriów w wytwa-

rzaniu i usuwaniu reaktywnych form tlenu; związek z przesyłaniem

sygnałów i programowaną śmiercią komórki. Postepy Biochem 2: 145-

156

53. Chen N, Karantza-Wadsworth V (2009) Role and regulation of autoph-

agy in cancer. Biochim Biophys Acta 1793: 1516-1523

54. Mitton D, Ackroyd R (2008) A brief overview of photodynamic thera-

py in europe. Photodiagn Photodyn Ther 5: 103-111

55. Bredell MG, Besic E, Maake C, Walt H (2010) The application and chal-

lenges of clinical PD-PDT in the head and neck region: a short review.

J Photochem Photobiol B 101: 185-190

56. Sally H, Ibbotson MBChB (2010) An overview of topical photodynam-

ic therapy in dermatology. Photodiagn Photodyn Ther 7: 16-23

57. O’Riordan K, Akilov OE, Hasan T (2005) The potential for photody-

namic therapy in the treatment of localized infections. Photodiagn

Photodyn Ther 2: 247-262

58. Salmon-Divon M, Nitzan Y, Malik Z (2004) Mechanistic aspects of

Eschericia coli photodynamic inactivation by cationic tetra-meso(N-

methylpyridyl)porphine. Photochem Photobiol Sci 3: 423-429

59. Schafer M, Schmitiz C, Facius R, Horneck G, Milow B, Funken KH,

Ortner J (2000) Systematic study of parameters influencing the action

of rose Bengal with visible light on bacterial cells: comparison between

the biological effect and singlet-oxygen production. Photochem Pho-

tobiol 71: 514-523

60. Bertoloni G, Lauro FM, Cortella G, Merchat M (2000) Photosensitizing

activity of hematoporphyrin on Staphylococcus aureus cells. Biochim

Biophys Acta 1475: 169-174

61. Caminos DA, Spesia MB, Pons P, Durantini EN (2008) Mechanisms

of Escherichia Coli photodynamic inactivation by an amphiphilic trica-

tionic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammonium-

phenyl) porphyrin. Photochem Pchotobiol Sci 7: 1071-1078

62. Hamblin MR, O’Donnell DA, Murthy N, Rajagopalan K, Michaud

N, Sherwood ME, Hasan T (2002) Polycationic photosensitizer conju-

gates: effects of chain length and Gram classification on the photody-

namic inactivation of bacteria. J Antimicrob Chemother 49: 941-951

63. Dai T, Huang YY, Hamblin MR (2009) Photodynamic therapy for local-

ized infections-state of the art. Photodiagn Photodyn Ther 6: 170-188

64. Chen K, chang BZ, Ju M, Zhang XH, Gu H (2007) Comparative study

of photodynamic therapy vs CO

2

laser vaporization in treatment of

condylomata acuminata: a randomized clinical trial. Br J Dermatol 156:

516-520

65. Szeimies RM, Schleyer V, Moll I, Stocker M, Landthaler M, Karrer S

(2009) Adjuvant photodynamic therapy does not prevent reccurence

of condylomata acuminata after carbon dioxide laser ablation-A phase

III, prospective, randomized, bicentric, double-blind study. Dermatol

Surg 35: 757-764

66. Mitra MRCP A, Stables GI (2006) Topical photodynamic therapy for

non-cancerous skin conditions. Photodiagn Photodyn Ther 3: 116-127

67. Wang XL, Wang HW, Zhang LL, Guo MX, Huang Z (2010) Topical

ALA PDT for the treatment of severe acne vulgaris. Photodiagn Pho-

todyn Ther 7: 33-38

68. Chatterjee DK, Fong LS, Zhang Y (2008) Nanoparticles in photody-

namic therapy an emerging pradigm. Adv Drug Del Rev 60: 1627-1637

69. Konan YN, Gurny R, Allemann E (2002) State of the art in the delivery

of photosensitizers for photodynamic therapy. J Photochem Photobiol

B 6: 89-106

70. Paszko E, Ehrhardt C, Senge MO, Kelleher DP, Reynolds JV (2011) Na-

nodrug applications in photodynamic therapy. Photodiagn Photodyn

Ther 8: 14-29

71. Pucińska J, Podbielska H (2009) Nanomateriały we wspomaganiu te-

rapii fotodynamicznej. Acta Bio-Opt Inf Med 2: 178-181

72. Donnelly RF, McCarron PA, Woolfson D (2009) Drug delivery systems

for photodynamic therapy. Recent Pat Drug Deliv Formul 3: 1-7

73. Das M, Mohanty C, Sahoo SK (2009) Ligand-based targeted therapy

for cancer tissue. Expert Opin Drug Deliv 6: 285-304

74. Nerozhay D, Kańska U, Budzyńska R, Boratyński J (2007) Współcze-

sny stan badań nad koniugatami i innymi systemami dostarczania

leków w leczeniu schorzeń nowotworowych i innych jednostek cho-

robowych. Postepy Hig Med Dosw 61: 350-360

75. Maeda H, Bharate GY, Daruwalla J (2009) Polymeric drugs for effi-

cient tumor-targeted drug delivery based on EPR-effect. Eur J Pharm

Biophar 3: 3409-3419

76. Powroźnik B, Kubowicz P, Pękala E (2012) Przeciwciała monoklonal-

ne w terapii celowanej. Postepy Hig Med Dosw 66: 663-673

77. Jóźwiak Z (2010) Rola przeciwciał monoklonalnych w transporcie le-

ków do komórek nowotworowych. Nowotwory 5: 442-450

78. Łubgan D, Marczak A, Distel L, Jóźwiak Z (2006) Koniugaty transfe-

ryny — nadzieja w walce z nowotworami. Postepy Biochem 1: 72-79

79. Sieroń A, Kwiatek S (2009) Twenty years of experience with PDD and

PDT in Poland — review. Photodiagn Photodyn Ther 6: 73-78

80. Sieroń A, Gibinski P, Pustelny T, Kwiatek S, Opilski Z, Kawczyk-

Krupka A, Woznica T, Maciak E, Kubica W, Urbanczyk M, Latos W

(2008) Optical biopsy using spectral camera in BCC and oral leukopla-

kia. Photodiagn Photodyn Ther 5: 271-275

Photodynamic method of cancer diagnosis and

therapy — mechanisms and applications

Agata Nowak-Stępniowska



, Paulina Pergoł, Alfreda Padzik-Graczyk

Biochemistry Laboratory, Institute of Optoelectronics, Military University of Technology, 2 Kaliskiego St., 00-908 Warsaw, Poland



e-mail: [e-mail]

Key words: photodynamic method, photosensitizers, reactive oxygen specious, cancers

ABSTRACT

Cancers are diagnosed in over few millions patients annually. Due to inter alia weak antigenicity as well as drug-fastness of most cancers,

PDT can become an effective alternative or complementary method to surgery. Photodynamic method requires tree elements: photosensitizer,

light energy source and oxygen. Photodynamic therapy is successfully used method in many clinics all over the world, also in Poland. PDT is

used in treatment of oncological (cancers of head, neck, lung, oesophagus, pancreas, urinary bladder and ginecological cancers) as non onco-

logical diseases (

lischen sclerosus, staphylococcus aureus, papillomatosis).