Marian Kamiński
Metody Analizy Technicznej
Cz-1. Systemy Zapewnienia Jakości
Strona 1 z 6
Politechnika Gdańska
Wydział Chemiczny
Katedra Chemii Analitycznej
Zasady wykonania walidacji metody analitycznej
Walidacja metod badań – zasady postępowania w LOTOS Lab
1. Metody badań stosowane w LOTOS Lab należą do następujących grup:
1.1. Metody zgodne z uznanymi normami krajowymi, albo międzynarodowymi, wykonywane
w zakresie zastosowań i zgodnie z procedurą podaną w normie;
1.2. Metody opracowane przez uznanych producentów aparatury badawczej, albo opisane w
renomowanych czasopismach naukowych, albo opracowane przez uznane instytuty
branżowe, lub przez uczelnie wyższe i poddane walidacji przez opracowującego oraz
stosowane w LOTOS Lab w zakresie objętym udokumentowanymi danymi z walidacji;
1.3. Metody generalnie zgodne z uznanymi normami krajowymi, albo międzynarodowymi
lecz zmodyfikowane w LOTOS Lab i wykonywane w sposób skorygowany, albo w
zmienionym zakresie zastosowania;
1.4. Metody opracowane, albo zaadoptowane przez LOTOS Lab i wykonywane zgodnie z
procedurą opracowaną w Laboratorium.
2. Dla metod z grupy 1.1. i 1.2. może zostać wykonana uproszczona walidacja, natomiast
zastosowanie do badań metod należących do grupy 1.3. i 1.4. wymaga wykonania,
uprzednio, pełnej walidacji. Zgodnie, jednak, z wymaganiami p. 5.4.5.2. normy PN-EN
ISO/IEC 17025:2001, "walidacja powinna być na tyle obszerna, na ile jest to konieczne
przy danym zastosowaniu, albo obszarze zastosowania" metody badań.
2.1. Walidacja metod badań stosowanych w LOTOS Lab obejmuje, co najmniej, następujące
etapy postępowania (p.2.1.1.) oraz wymaga zbadania następujących parametrów (p.2.1.2 -
w przypadku walidacji uproszczonej i p.2.1.2 oraz 2.1.3. w przypadku walidacja pełnej).
2.1.1. Etapy postępowania walidacyjnego:
• Określenie zakresu stosowania metody badań, tzn. określenie zakresu zmienności
parametrów badanych próbek oraz zakresu zmienności tzw. "matrycy" badanych próbek;
• Opracowanie programu badań walidacyjnych z podaniem odpowiednich wartości
kryterialnych, wymaganych dla walidowanej metody badań;
• Zatwierdzenie programu walidacji przez Dyrektora LOTOS Lab;
• Wykonanie badań walidacyjnych zgodnie z zatwierdzonym programem walidacji;
• Opracowanie wyników badań walidacyjnych i przygotowanie pisemnego raportu
walidacji, uwzględniającego przede wszystkim stwierdzenia dotyczące spełnienia
wymagań, określonych w programie walidacji;
• Zatwierdzenie raportu walidacji przez Dyrektora LOTOS Lab, równoznaczne z
wprowadzeniem metody do bieżącego stosowania w Laboratorium.
2.1.2. Parametry i właściwości metody badań, które powinny zostać zbadane podczas
walidacji uproszczonej:
•
Laboratoryjna precyzja metody badań (odchylenie standardowe pojedynczego wyniku,
odchylenie standardowe wartości średniej, przedział ufności wartości średniej dla
poziomu ufności 0.95), określona dla zakresu stosowania metody badań w laboratorium,
Marian Kamiński
Metody Analizy Technicznej
Cz-1. Systemy Zapewnienia Jakości
Strona 2 z 6
Politechnika Gdańska
Wydział Chemiczny
Katedra Chemii Analitycznej
tzn. dla przeciętnych, najniższych i najwyższych wartości mierzonego parametru /
właściwości badanych próbek;
•
Laboratoryjna powtarzalność metody badań, wyznaczona na poziomie ufności 0.95, z
zastosowaniem rezultatów otrzymanych przy wyznaczaniu laboratoryjnej precyzji, z
uwzględnieniem założenia, że z reguły będą wykonywane dwa kolejne oznaczenia
badanego parametru i obliczona zgodnie z zasadą opisaną w "Zapewnienie jakości analiz
chemicznych", IMP 1998, pod red. M. Dobeckiego. Obliczenie laboratoryjnej
powtarzalności może też zostać wykonane z zastosowaniem wszystkich kombinacji
hipotetycznych rozstępów między poszczególnymi wynikami otrzymanymi w serii
oznaczeń, po odrzuceniu - z zastosowaniem testu Q - Dixona - wyników obarczonych
błędem grubym.
•
Laboratoryjna niepewność wyników badań, określona / oszacowana ilościowo
poprzez wykorzystanie, co najmniej, jednej z poniżej wymienionych grup parametrów i
metod postępowania:
- Odchylenia standardowe i przedziały ufności pojedynczego wyniku, odchylenia
standardowe i przedziały ufności wartości średniej oraz laboratoryjne powtarzalności
metody;
- Przedział ufności pojedynczego wyniku oraz przedział ufności wartości średniej,
określone na podstawie rezultatów badań międzylaboratoryjnych;
- Standardowa niepewność złożona certyfikowanego materiału odniesienia (CRM), albo
materiału odniesienia Urzędu Miar, zbadana doświadczalnie z zastosowaniem
walidowanej metody analitycznej;
- Obliczenie (oszacowanie) "standardowej i rozszerzonej niepewności złożonej", według
zasady "addytywności propagacji wariancji zdarzeń niezależnych".
2.1.3. Podczas walidacji pełnej powinny zostać zbadane i wyznaczone, dodatkowo,
następujące parametry / właściwości metody badań dla zakresu przewidywanego stosowania
metody w LOTOS Lab:
- granica detekcji i granica oznaczalności,
- zakres liniowości oraz parametry odpowiedniej linii / funkcji korelacyjnej,
- selektywność i specyficzność,
- wpływ zamierzonych i niezamierzonych zmian warunków pobierania próbek, zmian
składu "matrycy' próbek oraz zmian warunków wykonywania badań na otrzymywane
wyniki, ich precyzję, powtarzalność oraz na niepewność pomiarową,
- korelacja wyników badań otrzymanych metodą walidowaną i ogólnie uznaną metodą /
metodami odniesienia
3. Inne zasady postępowania oraz dodatkowe zalecenia
3.1. Każda walidacja powinna zostać poprzedzona analizą czynników wpływających na błąd
pomiaru oraz dokonaniem na tej podstawie - w praktyce analitycznej w LOTOS Lab w takim
zakresie, na ile to możliwe - minimalizacji czynników wpływających na wartość błędu
wyników badania.
3.2. Sposoby wyznaczenia / szacowania niepewności pomiaru, podane w p. 2.1.2. mogą być
traktowane na razie jako równoważne, jednak, należy w możliwie jak najkrótszym okresie
czasu wyznaczyć dla poszczególnych metod badań niepewność złożoną, określoną wg zasady
Marian Kamiński
Metody Analizy Technicznej
Cz-1. Systemy Zapewnienia Jakości
Strona 3 z 6
Politechnika Gdańska
Wydział Chemiczny
Katedra Chemii Analitycznej
"propagacji wariancji zdarzeń niezależnych", z wyjątkiem tych metod badań, gdy można
udokumentować z wysokim poziomem ufności, że inny spośród w/w sposobów określenia /
oszacowania niepewności pomiaru jest dla tej metody bardziej właściwy.
3.3. W przypadku nie zautomatyzowanych metod badań, gdy stopień wyszkolenia
pracownika i stopień staranności wykonania przez niego czynności laboratoryjnych ma
wpływ na otrzymane wyniki, należy w ustalonym okresie czasu wyznaczyć laboratoryjną
powtarzalność, z uwzględnieniem wykonywania pomiarów przez różnych pracowników
Laboratorium.
3.4. Ważnymi danymi walidacji są wyniki badań tych samych próbek, wykonane różnymi
metodami analitycznymi, szczególnie, gdy dotyczy to metod badań zakwalifikowanych do
grupy 1.3. i 1.4. i istnieje uznana normowa metoda oznaczania odpowiedniego parametru.
3.5. Za wykonanie dla poszczególnych metod badań: "programu walidacji z określeniem
wymaganych kryteriów", "analizy czynników wpływających na niepewność wyników badań",
"minimalizacji czynników najważniejszych", "wykonanie badań walidacyjnych" oraz za
"opracowanie wyników badań walidacyjnych, wraz z określeniem zgodności z przyjętymi
kryteriami" odpowiada pracownik opiekujący się odpowiednią metodą badań (dawniej,
"pracownik wiodący" w zakresie określonej metody badań). Ponieważ, jednak, wykonanie
znacznej części walidacji metody badań jest skomplikowane, kierownicy odpowiednich
Laboratoriów oraz Pracowni, a także Specjaliści zatrudnieni w LOTOS Lab są zobowiązani
do udzielenia na bieżąco potrzebnej pomocy. Praca tego typu powinna być, jednocześnie,
traktowana jako realizacja podstawowych obowiązków pracownika LOTOS Lab.
Opracował:
Zatwierdził:
Zasady przygotowania programu walidacji metody badawczej
Przykład instrukcji wykonania walidacji metody analitycznej znajduje się w
„Instrukcja walidacji metody analitycznej”
1. Zakres zastosowań metody w laboratorium LOTOS Lab
Metoda badawcza „ ...” (np. "Oznaczanie zawartości azotu całkowitego" w zakresie od ..... ,
do .... mg/l”) ma w LOTOS Lab następujący zakres zastosowania: do oznaczania zawartości
.... w zakresie stężeń od ..., do ..., w rafineryjnych wodach i ściekach procesowych, w kontroli
procesu oczyszczania ścieków rafineryjnych oraz w wodach powierzchniowych. Orientacyjny
zakres zmienności składu matrycy badanych próbek, dla którego metoda jest właściwa, został
podany w p. ....... .
2. Zasada metody oznaczania
Próbka badanej wody, po ewentualnym przygotowaniu na drodze usunięcia substancji
przeszkadzających, zostaje dodana do naczynia zawierającego potrzebne reagenty i po
ustalonym okresie czasu potrzebnym dla zakończenie chemicznych reakcji analitycznych,
zostaje zmierzona absorbancja przy długości fali światła .... nm, z zastosowaniem fotometru
Marian Kamiński
Metody Analizy Technicznej
Cz-1. Systemy Zapewnienia Jakości
Strona 4 z 6
Politechnika Gdańska
Wydział Chemiczny
Katedra Chemii Analitycznej
„.....„ Wartość absorbancji zostaje przeliczona na stężenie azotu całkowitego z zastosowaniem
współczynnika kalibracyjnego zawartego w pamięci fotometru, albo wprowadzonego do
pamięci przez użytkownika fotometru. Reakcja chemiczna, powodująca sygnał analityczny,
polega na ........
3. Powszechnie stosowana metoda / y odniesienia oraz najważniejsze wzajemne
odniesienia między tymi metodami
Za metodę odniesienia należy uznać metodę „PN-ISO ......... „ Niniejsza, metoda badań,
będąca przedmiotem walidacji powinna dawać rezultaty zgodne z wynikami, otrzymywanymi
metodą „ ....... „. W przypadku niektórych badanych próbek metoda walidowana powinna
prowadzić do otrzymywania rezultatów bardziej poprawnych, ponieważ, ..... . Jednocześnie
walidowana metoda powinna być bardziej precyzyjna i bardziej odporna na czynniki
zakłócające od metody odniesienia. Albo temu podobne informacje dotyczące charakterystyki
walidowanej metody badań i metody odniesienia.
4. Cel ogólny i cele szczegółowe walidacji
Wykazać, na podstawie badań i poprzez zdobycie obiektywnych dowodów, że walidowana
metoda badań jest właściwa w zastosowaniach podanych w p.1. W związku z tym dla zakresu
zastosowań tej metody w LOTOS Lab postanowiono zbadać, wyznaczyć lub oszacować i
ocenić jej:
- Dokładność;
- Precyzję;
- Liniowość;
- Dolną i górną granicą zakresu roboczego, albo zakresu liniowości;
- Korelację rezultatów otrzymanych metodą walidowaną i metodą odniesienia (jeżeli taka
istnieje i jest uznawana za poprawną);
- Odporność na zmianę określonych parametrów i warunków wykonania badań (jeżeli mogą
mieć wpływ na otrzymane wyniki i na niepewność pomiarową, albo uzasadnienie, że
wykonywanie takich badań nie jest potrzebne)
- Niepewność pomiarową.
Za kryterium weryfikacji ocen statystycznych przyjmuje się poziom ufności 0.95, albo
poziom istotności hipotez statystycznych 0.05. Do weryfikacji hipotez statystycznych
przyjmuje się, z zasady tylko wyniki pomiarów nie obarczone błędem grubym (po weryfikacji
„surowych” danych pomiarowych i po odrzuceniu wszystkich wyników nadmiernie
odbiegających z zastosowaniem testu Q – Dixona, albo innej odpowiedniej metody
weryfikacji przynależności danych pomiarowych do określonej statystyki).
W miarę możliwości, badania zostaną wykonane dla niskich, przeciętnych i wysokich
zawartości analitu oraz dla „ubogich”, typowych i „bogatych” zawartości substancji w tzw.”
matrycy” badanych próbek. Należy umotywować przyjęty do badań zakres zmienności składu
matrycy próbek Badania powinny obejmować, co najmniej, 10 niezależnie przygotowanych
próbek, korzystnie, przez kilku pracowników uprawnionych do badań.
Marian Kamiński
Metody Analizy Technicznej
Cz-1. Systemy Zapewnienia Jakości
Strona 5 z 6
Politechnika Gdańska
Wydział Chemiczny
Katedra Chemii Analitycznej
5. Program walidacji
Program walidacji metody badawczej p.t. "....... ", wymagane wartości parametrów walidacyjnych oraz kryteria akceptacyjne metody badań p.t.
L.p.
Element celu
badań
Badane parametry / właściwości metody badań /
metody analitycznej
Wymagania oraz kryteria akceptacji
Badane próbki i zakres
zmienności warunków
analitycznych
Uwagi
Odchylenie standardowe oraz przedział ufności dla
wyniku pojedynczego oznaczenia
Odchylenie standardowe oraz przedział ufności
wartości średniej
Górna granica powtarzalności metody badania,
wyznaczona w oparciu o rozstępy między wynikami
pomiarów wykonanych przez tę samą osobę, dla tej
samej próbki laboratoryjnej (lecz dla różnych próbek
analitycznych), uzyskana w krótkim okresie czasu
Z wykorzystaniem materiałów
odniesienia o typowej i o
"skrajnych" właściwościach matrycy
Określić górną granicę
powtarzalności dla
wykonywania dwu-,
albo jednokrotnego
oznaczania próbki
analitycznej
1
Precyzja
Górna granica odtwarzalności metody oznaczania
Wyznaczyć wartości parametrów i gdy istnieją odpowiednie dane - porównać
z wartościami typowymi dla metody odniesienia. Wartości nie wyższe od
typowych dla metody odniesienia - akceptacja metody badań, wartości
wyższe - weryfikacja procedury analitycznej i powtórzenie walidacji.
Zakres zmienności badań
międzylaboratoryjnych
Wyniki badań
międzylaboratoryjnych
Błąd bezwzględny i względny wartości średniej
wyznaczony w laboratorium, odniesiony do wartości
średniej materiału odniesienia o znanej wartości
badanego parametru, wyznaczony doświadczalnie na
podstawie wyników pomiarów wykonanych z
zastosowaniem sprzętu pomiarowego posiadającego
aktualne odniesienie do "oficjalnych" jednostek miar,
ze znaną niepewnością
Materiał / y odniesienia o niskich,
wysokich i typowych wartościach
badanego parametru oraz o typowej,
ubogiej i bogatej matrycy
Błąd bezwzględny i względny wartości średniej
laboratorium odniesiony do wartości średniej z badań
międzylaboratoryjnych
Zawieranie się całego przedziału ufności wartości średniej wyników
laboratorium w przedziale standardowego błędu rozszerzonego materiału
odniesienia, albo w przedziale ufności wartości średniej wyników badań
międzylaboratoryjnych, albo w przedziale odtwarzalności, a szczególnie
powtarzalności, walidowanej metody badań - oznacza brak błędu
systematycznego. Częściowe rozbieżności w/w przedziałów wymagają
weryfikacji hipotezy o niezgodności wartości średnich oraz wariancji. Należy
stwierdzić brak błędu systematycznego, albo wyznaczyć wartości poprawek.
W zakresie zmienności próbek z
badań międzylaboratoryjnych i ich
parametrów statystycznych
2
Dokładność
Błąd bezwzględny i względny wartości stopnia odzysku
przy zastosowaniu metody dodatku wzorca
Średnia wartość stopnia odzysku w zakresie 0.98 do 1.02 i symetria
przedziału ufności wartości średniej stopnia odzysku oznacza brak błędu
systematycznego. Inne rezultaty wymagają zbadania wartości błędu
systematycznego metody badań i wyznaczenia poprawek
Dla niskich, wysokich i typowych
wartości dodatku oraz dla typowej,
ubogiej i bogatej matrycy
Sposoby, stosowane
alternatywnie, albo
łącznie
3
Liniowość
Liniowość zakresu roboczego metody określona dla
materiału odniesienia, albo / i na podstawie korelacji do
rezultatów dla liniowej metody odniesienia: charakter
korelacji oraz wartości współczynnika kierunkowego,
wyrazu wolnego i współczynnika korelacji linii regresji
Wyższa do 0.995 wartość współczynnika korelacji (R) oznacza liniowość i
określa liniowy zakres roboczy metody badań. Niższe od 0.97 i wyższe od
1.03 wartości wykładnika funkcji S=kc
x
(log S= x (log c) + log k, wyznaczają
granice liniowości, gdzie S – sygnał pomiarowy c – wartość mierzona
Wartość
współczynnika
kierunkowego linii
regresji określa czułość
metody
4
Granice roboczego
zakresu metody
Dolna granica oznaczalności , ewentualnie dolna
granica detekcji oraz górna granica liniowości i
ewentualnie górna granica oznaczalności
Jako dolna granica detekcji - trzykrotna wartość średnia dla ślepej próby, albo
trzykrotna wartość poziomu szumów wyznaczonego w jednostkach badanego
parametru, a jako dolna granica oznaczalności, odpowiednio, pięcio-krotność
Z użyciem materiałów odniesienia o
odpowiednim zakresie zmienności
badanego parametru, dla ubogiej,
typowej i bogatej matrycy
Marian Kamiński
Metody Analizy Technicznej
Cz-1. Systemy Zapewnienia Jakości
Strona 6 z 6
Politechnika Gdańska
Wydział Chemiczny
Katedra Chemii Analitycznej
L.p.
Element celu
badań
Badane parametry / właściwości metody badań /
metody analitycznej
Wymagania oraz kryteria akceptacji
Badane próbki i zakres
zmienności warunków
analitycznych
Uwagi
5
Korelacja
rezultatów w
stosunku do
metody odniesienia
Charakter korelacji, wartości współczynnika
kierunkowego i wyrazu wolnego oraz współczynnika
korelacji linii regresji, o ile możliwe, w całym zakresie
roboczym metody analitycznej
Wyznaczyć parametry linii regresji oraz ocenić stopień zgodności rezultatów
otrzymywanych walidowaną metodą badań oraz metodą odniesienia
Z użyciem materiałów odniesienia o
odpowiednim zakresie zmienności
badanego parametru, dla ubogiej,
typowej i bogatej matrycy
Zbadać, gdy metoda
odniesienia jest ogólnie
uznana za poprawną
6
Odporność metody
na zamierzone i nie
zamierzone zmiany
warunków
wykonania badania
Wpływ zmienności właściwości odczynników,
materiałów pomocniczych, gazów, kolumn,
stosowanych do badań, osoby wykonującej badania,
czasu przechowywania próbki itp. czynników na
otrzymane wyniki badań i na niepewność pomiarową
Wyznaczyć wartości średnie i rozstępy między średnimi wartościami
wyników badań tej samej próbki materiału odniesienia, badanej w różnych
warunkach. Wartości średnie wraz z przedziałem ufności wartości średniej
powinny być zawarte w zakresie rozszerzonego błędu standardowego
wartości średniej materiału odniesienia, a rozstępy między wartościami
średnimi - w przedziale górnej granicy powtarzalności metody badań
Z użyciem materiałów odniesienia o
typowej wartości badanego
parametru oraz dla typowej matrycy
Wykonać w zakresie
niezbędnym, gdy nie
można wykluczyć
wpływu zmienności
warunków badań na
wyniki oznaczania
Odchylenie standardowe i przedział ufności
pojedynczego wyniku oraz odchylenie standardowe i
przedział ufności wartości średniej wyznaczone w
laboratorium (jak w p. 1.);
Przedział ufności pojedynczego wyniku oraz przedział
ufności wartości średniej określone w czasie badaniach
międzylaboratoryjnych
Standardowa niepewność złożona certyfikowanego
materiału odniesienia (CRM), albo materiału
odniesienia Urzędu Miar, gdy były badane walidowaną
metodą analityczną
7
Niepewność
pomiarowa metody
badań
Obliczona (oszacowana) "standardowa i rozszerzona
niepewność złożona", według zasady "addytywnej
propagacji wariancji zdarzeń niezależnych".
Wyznaczyć odpowiednie wartości statystyczne, albo oszacowania i podać je
w raporcie walidacji. Porównać z odpowiednimi wartościami dla metody
odniesienia. Otrzymanie dla walidowanej metody badań wartości niższych od
wyznaczonych dla metody odniesienia jest dodatkowym argumentem dla
poprawności wyboru walidowanej metody badań
Dla niskich, typowych i wysokich
wartości badanego parametru, z
uwzględnieniem matrycy ubogiej,
typowej i bogatej
Alternatywne sposoby
postępowania, o ile
możliwe należy
zastosować co
najmniej dwa,
preferując metodę
„addytywnej
propagacji wariancji”
8
Selektywność
Stosunek wartości sygnału analitycznego „Sy” od
badanego parametru do sygnału analitycznego „Sx” od
określonego wybranego składnika matrycy próbki
(Sel=Sy/Sx)
Wartość Sel > 1000 oznacza metodę selektywną, Sel>10000 – metodę
wysoce selektywną, a wartość Sel<100 metodę nie selektywną
Stężenie składników, dla których
jest badana selektywność metody w
typowym dla niej zakresie
Wykonywać tylko dla
substancji należących
do prawdopodobnych
składników matrycy
9
Specyficzność
Wpływ zmian łącznego składu matrycy na wartość
sygnału analitycznego
Metoda jest specyficzna, gdy składniki obecne potencjalnie w matrycy
badanych próbek nie powodują zmiany sygnału analitycznego powyżej 1%
względnego. Gdy wpływ składników matrycy jest wyższy, należy przed
wykonaniem analizy zastosować odpowiednie metody przygotowania próbki,
w celu usunięcia składników zakłócających
Dla niskich, typowych i wysokich
wartości badanego parametru, z
uwzględnieniem matrycy ubogiej,
typowej i bogatej oraz metody
dodatku do próbki składników
matrycy mających potencjalnie
wpływ na wartość sygnału analit.
Zbadać tylko wtedy,
gdy jest określone
prawdopodobieństwo
obecności w matrycy
próbek składników, dla
których metoda badań
jest niespecyficzna
W przypadku niektórych metod analitycznych, opisanych w normach, farmakopei, albo w literaturze naukowej i poddanych uprzednio walidacji,
wykonanie pełnego programy nie jest konieczne i wystarczy walidację ograniczyć do pierwszych pozycji powyższej tabeli.