Marian Kamiński

Metody Analizy Technicznej

Cz-1. Systemy Zapewnienia Jakości

Strona 1 z 6

Politechnika Gdańska

Wydział Chemiczny

Katedra Chemii Analitycznej

Zasady wykonania walidacji metody analitycznej

Walidacja metod badań – zasady postępowania w LOTOS Lab

1. Metody badań stosowane w LOTOS Lab należą do następujących grup:

1.1. Metody zgodne z uznanymi normami krajowymi, albo międzynarodowymi, wykonywane

w zakresie zastosowań i zgodnie z procedurą podaną w normie;

1.2. Metody opracowane przez uznanych producentów aparatury badawczej, albo opisane w

renomowanych czasopismach naukowych, albo opracowane przez uznane instytuty
branżowe, lub przez uczelnie wyższe i poddane walidacji przez opracowującego oraz
stosowane w LOTOS Lab w zakresie objętym udokumentowanymi danymi z walidacji;

1.3. Metody generalnie zgodne z uznanymi normami krajowymi, albo międzynarodowymi

lecz zmodyfikowane w LOTOS Lab i wykonywane w sposób skorygowany, albo w
zmienionym zakresie zastosowania;

1.4. Metody opracowane, albo zaadoptowane przez LOTOS Lab i wykonywane zgodnie z

procedurą opracowaną w Laboratorium.

2. Dla metod z grupy 1.1. i 1.2. może zostać wykonana uproszczona walidacja, natomiast

zastosowanie do badań metod należących do grupy 1.3. i 1.4. wymaga wykonania,
uprzednio, pełnej walidacji. Zgodnie, jednak, z wymaganiami p. 5.4.5.2. normy PN-EN
ISO/IEC 17025:2001, "walidacja powinna być na tyle obszerna, na ile jest to konieczne
przy danym zastosowaniu, albo obszarze zastosowania" metody badań.

2.1. Walidacja metod badań stosowanych w LOTOS Lab obejmuje, co najmniej, następujące

etapy postępowania (p.2.1.1.) oraz wymaga zbadania następujących parametrów (p.2.1.2 -
w przypadku walidacji uproszczonej i p.2.1.2 oraz 2.1.3. w przypadku walidacja pełnej).

2.1.1. Etapy postępowania walidacyjnego:

• Określenie zakresu stosowania metody badań, tzn. określenie zakresu zmienności

parametrów badanych próbek oraz zakresu zmienności tzw. "matrycy" badanych próbek;

• Opracowanie programu badań walidacyjnych z podaniem odpowiednich wartości

kryterialnych, wymaganych dla walidowanej metody badań;

• Zatwierdzenie programu walidacji przez Dyrektora LOTOS Lab;
• Wykonanie badań walidacyjnych zgodnie z zatwierdzonym programem walidacji;

• Opracowanie wyników badań walidacyjnych i przygotowanie pisemnego raportu

walidacji, uwzględniającego przede wszystkim stwierdzenia dotyczące spełnienia
wymagań, określonych w programie walidacji;

• Zatwierdzenie raportu walidacji przez Dyrektora LOTOS Lab, równoznaczne z

wprowadzeniem metody do bieżącego stosowania w Laboratorium.

2.1.2. Parametry i właściwości metody badań, które powinny zostać zbadane podczas

walidacji uproszczonej:

•

Laboratoryjna precyzja metody badań (odchylenie standardowe pojedynczego wyniku,

odchylenie standardowe wartości średniej, przedział ufności wartości średniej dla
poziomu ufności 0.95), określona dla zakresu stosowania metody badań w laboratorium,

Marian Kamiński

Metody Analizy Technicznej

Cz-1. Systemy Zapewnienia Jakości

Strona 2 z 6

Politechnika Gdańska

Wydział Chemiczny

Katedra Chemii Analitycznej

tzn. dla przeciętnych, najniższych i najwyższych wartości mierzonego parametru /
właściwości badanych próbek;

•

Laboratoryjna powtarzalność metody badań, wyznaczona na poziomie ufności 0.95, z

zastosowaniem rezultatów otrzymanych przy wyznaczaniu laboratoryjnej precyzji, z
uwzględnieniem założenia, że z reguły będą wykonywane dwa kolejne oznaczenia
badanego parametru i obliczona zgodnie z zasadą opisaną w "Zapewnienie jakości analiz
chemicznych", IMP 1998, pod red. M. Dobeckiego. Obliczenie laboratoryjnej
powtarzalności może też zostać wykonane z zastosowaniem wszystkich kombinacji
hipotetycznych rozstępów między poszczególnymi wynikami otrzymanymi w serii
oznaczeń, po odrzuceniu - z zastosowaniem testu Q - Dixona - wyników obarczonych
błędem grubym.

•

Laboratoryjna niepewność wyników badań, określona / oszacowana ilościowo

poprzez wykorzystanie, co najmniej, jednej z poniżej wymienionych grup parametrów i
metod postępowania:

- Odchylenia standardowe i przedziały ufności pojedynczego wyniku, odchylenia

standardowe i przedziały ufności wartości średniej oraz laboratoryjne powtarzalności
metody;

- Przedział ufności pojedynczego wyniku oraz przedział ufności wartości średniej,

określone na podstawie rezultatów badań międzylaboratoryjnych;

- Standardowa niepewność złożona certyfikowanego materiału odniesienia (CRM), albo

materiału odniesienia Urzędu Miar, zbadana doświadczalnie z zastosowaniem
walidowanej metody analitycznej;

- Obliczenie (oszacowanie) "standardowej i rozszerzonej niepewności złożonej", według

zasady "addytywności propagacji wariancji zdarzeń niezależnych".

2.1.3. Podczas walidacji pełnej powinny zostać zbadane i wyznaczone, dodatkowo,
następujące parametry / właściwości metody badań dla zakresu przewidywanego stosowania
metody w LOTOS Lab:

- granica detekcji i granica oznaczalności,
- zakres liniowości oraz parametry odpowiedniej linii / funkcji korelacyjnej,
- selektywność i specyficzność,
- wpływ zamierzonych i niezamierzonych zmian warunków pobierania próbek, zmian

składu "matrycy' próbek oraz zmian warunków wykonywania badań na otrzymywane
wyniki, ich precyzję, powtarzalność oraz na niepewność pomiarową,

- korelacja wyników badań otrzymanych metodą walidowaną i ogólnie uznaną metodą /

metodami odniesienia

3. Inne zasady postępowania oraz dodatkowe zalecenia

3.1. Każda walidacja powinna zostać poprzedzona analizą czynników wpływających na błąd
pomiaru oraz dokonaniem na tej podstawie - w praktyce analitycznej w LOTOS Lab w takim
zakresie, na ile to możliwe - minimalizacji czynników wpływających na wartość błędu
wyników badania.

3.2. Sposoby wyznaczenia / szacowania niepewności pomiaru, podane w p. 2.1.2. mogą być
traktowane na razie jako równoważne, jednak, należy w możliwie jak najkrótszym okresie
czasu wyznaczyć dla poszczególnych metod badań niepewność złożoną, określoną wg zasady

Marian Kamiński

Metody Analizy Technicznej

Cz-1. Systemy Zapewnienia Jakości

Strona 3 z 6

Politechnika Gdańska

Wydział Chemiczny

Katedra Chemii Analitycznej

"propagacji wariancji zdarzeń niezależnych", z wyjątkiem tych metod badań, gdy można
udokumentować z wysokim poziomem ufności, że inny spośród w/w sposobów określenia /
oszacowania niepewności pomiaru jest dla tej metody bardziej właściwy.

3.3. W przypadku nie zautomatyzowanych metod badań, gdy stopień wyszkolenia
pracownika i stopień staranności wykonania przez niego czynności laboratoryjnych ma
wpływ na otrzymane wyniki, należy w ustalonym okresie czasu wyznaczyć laboratoryjną
powtarzalność, z uwzględnieniem wykonywania pomiarów przez różnych pracowników
Laboratorium.

3.4. Ważnymi danymi walidacji są wyniki badań tych samych próbek, wykonane różnymi
metodami analitycznymi, szczególnie, gdy dotyczy to metod badań zakwalifikowanych do
grupy 1.3. i 1.4. i istnieje uznana normowa metoda oznaczania odpowiedniego parametru.

3.5. Za wykonanie dla poszczególnych metod badań: "programu walidacji z określeniem
wymaganych kryteriów", "analizy czynników wpływających na niepewność wyników badań",
"minimalizacji czynników najważniejszych", "wykonanie badań walidacyjnych" oraz za
"opracowanie wyników badań walidacyjnych, wraz z określeniem zgodności z przyjętymi
kryteriami" odpowiada pracownik opiekujący się odpowiednią metodą badań (dawniej,
"pracownik wiodący" w zakresie określonej metody badań). Ponieważ, jednak, wykonanie
znacznej części walidacji metody badań jest skomplikowane, kierownicy odpowiednich
Laboratoriów oraz Pracowni, a także Specjaliści zatrudnieni w LOTOS Lab są zobowiązani
do udzielenia na bieżąco potrzebnej pomocy. Praca tego typu powinna być, jednocześnie,
traktowana jako realizacja podstawowych obowiązków pracownika LOTOS Lab.

Opracował:

Zatwierdził:

Zasady przygotowania programu walidacji metody badawczej

Przykład instrukcji wykonania walidacji metody analitycznej znajduje się w

„Instrukcja walidacji metody analitycznej”

1. Zakres zastosowań metody w laboratorium LOTOS Lab

Metoda badawcza „ ...” (np. "Oznaczanie zawartości azotu całkowitego" w zakresie od ..... ,
do .... mg/l”) ma w LOTOS Lab następujący zakres zastosowania: do oznaczania zawartości
.... w zakresie stężeń od ..., do ..., w rafineryjnych wodach i ściekach procesowych, w kontroli
procesu oczyszczania ścieków rafineryjnych oraz w wodach powierzchniowych. Orientacyjny
zakres zmienności składu matrycy badanych próbek, dla którego metoda jest właściwa, został
podany w p. ....... .

2. Zasada metody oznaczania

Próbka badanej wody, po ewentualnym przygotowaniu na drodze usunięcia substancji
przeszkadzających, zostaje dodana do naczynia zawierającego potrzebne reagenty i po
ustalonym okresie czasu potrzebnym dla zakończenie chemicznych reakcji analitycznych,
zostaje zmierzona absorbancja przy długości fali światła .... nm, z zastosowaniem fotometru

Marian Kamiński

Metody Analizy Technicznej

Cz-1. Systemy Zapewnienia Jakości

Strona 4 z 6

Politechnika Gdańska

Wydział Chemiczny

Katedra Chemii Analitycznej

„.....„ Wartość absorbancji zostaje przeliczona na stężenie azotu całkowitego z zastosowaniem
współczynnika kalibracyjnego zawartego w pamięci fotometru, albo wprowadzonego do
pamięci przez użytkownika fotometru. Reakcja chemiczna, powodująca sygnał analityczny,
polega na ........

3. Powszechnie stosowana metoda / y odniesienia oraz najważniejsze wzajemne
odniesienia między tymi metodami

Za metodę odniesienia należy uznać metodę „PN-ISO ......... „ Niniejsza, metoda badań,
będąca przedmiotem walidacji powinna dawać rezultaty zgodne z wynikami, otrzymywanymi
metodą „ ....... „. W przypadku niektórych badanych próbek metoda walidowana powinna
prowadzić do otrzymywania rezultatów bardziej poprawnych, ponieważ, ..... . Jednocześnie
walidowana metoda powinna być bardziej precyzyjna i bardziej odporna na czynniki
zakłócające od metody odniesienia. Albo temu podobne informacje dotyczące charakterystyki
walidowanej metody badań i metody odniesienia.

4. Cel ogólny i cele szczegółowe walidacji

Wykazać, na podstawie badań i poprzez zdobycie obiektywnych dowodów, że walidowana
metoda badań jest właściwa w zastosowaniach podanych w p.1. W związku z tym dla zakresu
zastosowań tej metody w LOTOS Lab postanowiono zbadać, wyznaczyć lub oszacować i
ocenić jej:

- Dokładność;
- Precyzję;
- Liniowość;
- Dolną i górną granicą zakresu roboczego, albo zakresu liniowości;
- Korelację rezultatów otrzymanych metodą walidowaną i metodą odniesienia (jeżeli taka
istnieje i jest uznawana za poprawną);
- Odporność na zmianę określonych parametrów i warunków wykonania badań (jeżeli mogą
mieć wpływ na otrzymane wyniki i na niepewność pomiarową, albo uzasadnienie, że
wykonywanie takich badań nie jest potrzebne)
- Niepewność pomiarową.

Za kryterium weryfikacji ocen statystycznych przyjmuje się poziom ufności 0.95, albo
poziom istotności hipotez statystycznych 0.05. Do weryfikacji hipotez statystycznych
przyjmuje się, z zasady tylko wyniki pomiarów nie obarczone błędem grubym (po weryfikacji
„surowych” danych pomiarowych i po odrzuceniu wszystkich wyników nadmiernie
odbiegających z zastosowaniem testu Q – Dixona, albo innej odpowiedniej metody
weryfikacji przynależności danych pomiarowych do określonej statystyki).
W miarę możliwości, badania zostaną wykonane dla niskich, przeciętnych i wysokich
zawartości analitu oraz dla „ubogich”, typowych i „bogatych” zawartości substancji w tzw.”
matrycy” badanych próbek. Należy umotywować przyjęty do badań zakres zmienności składu
matrycy próbek Badania powinny obejmować, co najmniej, 10 niezależnie przygotowanych
próbek, korzystnie, przez kilku pracowników uprawnionych do badań.

Marian Kamiński

Metody Analizy Technicznej

Cz-1. Systemy Zapewnienia Jakości

Strona 5 z 6

Politechnika Gdańska

Wydział Chemiczny

Katedra Chemii Analitycznej

5. Program walidacji

Program walidacji metody badawczej p.t. "....... ", wymagane wartości parametrów walidacyjnych oraz kryteria akceptacyjne metody badań p.t.

L.p.

Element celu

badań

Badane parametry / właściwości metody badań /

metody analitycznej

Wymagania oraz kryteria akceptacji

Badane próbki i zakres

zmienności warunków

analitycznych

Uwagi

Odchylenie standardowe oraz przedział ufności dla

wyniku pojedynczego oznaczenia

Odchylenie standardowe oraz przedział ufności

wartości średniej

Górna granica powtarzalności metody badania,

wyznaczona w oparciu o rozstępy między wynikami

pomiarów wykonanych przez tę samą osobę, dla tej

samej próbki laboratoryjnej (lecz dla różnych próbek

analitycznych), uzyskana w krótkim okresie czasu

Z wykorzystaniem materiałów

odniesienia o typowej i o

"skrajnych" właściwościach matrycy

Określić górną granicę

powtarzalności dla

wykonywania dwu-,

albo jednokrotnego

oznaczania próbki

analitycznej

1

Precyzja

Górna granica odtwarzalności metody oznaczania

Wyznaczyć wartości parametrów i gdy istnieją odpowiednie dane - porównać

z wartościami typowymi dla metody odniesienia. Wartości nie wyższe od

typowych dla metody odniesienia - akceptacja metody badań, wartości

wyższe - weryfikacja procedury analitycznej i powtórzenie walidacji.

Zakres zmienności badań

międzylaboratoryjnych

Wyniki badań

międzylaboratoryjnych

Błąd bezwzględny i względny wartości średniej

wyznaczony w laboratorium, odniesiony do wartości

średniej materiału odniesienia o znanej wartości

badanego parametru, wyznaczony doświadczalnie na

podstawie wyników pomiarów wykonanych z

zastosowaniem sprzętu pomiarowego posiadającego

aktualne odniesienie do "oficjalnych" jednostek miar,

ze znaną niepewnością

Materiał / y odniesienia o niskich,
wysokich i typowych wartościach

badanego parametru oraz o typowej,

ubogiej i bogatej matrycy

Błąd bezwzględny i względny wartości średniej

laboratorium odniesiony do wartości średniej z badań

międzylaboratoryjnych

Zawieranie się całego przedziału ufności wartości średniej wyników

laboratorium w przedziale standardowego błędu rozszerzonego materiału

odniesienia, albo w przedziale ufności wartości średniej wyników badań
międzylaboratoryjnych, albo w przedziale odtwarzalności, a szczególnie

powtarzalności, walidowanej metody badań - oznacza brak błędu

systematycznego. Częściowe rozbieżności w/w przedziałów wymagają

weryfikacji hipotezy o niezgodności wartości średnich oraz wariancji. Należy

stwierdzić brak błędu systematycznego, albo wyznaczyć wartości poprawek.

W zakresie zmienności próbek z

badań międzylaboratoryjnych i ich

parametrów statystycznych

2

Dokładność

Błąd bezwzględny i względny wartości stopnia odzysku

przy zastosowaniu metody dodatku wzorca

Średnia wartość stopnia odzysku w zakresie 0.98 do 1.02 i symetria

przedziału ufności wartości średniej stopnia odzysku oznacza brak błędu

systematycznego. Inne rezultaty wymagają zbadania wartości błędu

systematycznego metody badań i wyznaczenia poprawek

Dla niskich, wysokich i typowych

wartości dodatku oraz dla typowej,

ubogiej i bogatej matrycy

Sposoby, stosowane

alternatywnie, albo

łącznie

3

Liniowość

Liniowość zakresu roboczego metody określona dla

materiału odniesienia, albo / i na podstawie korelacji do

rezultatów dla liniowej metody odniesienia: charakter
korelacji oraz wartości współczynnika kierunkowego,

wyrazu wolnego i współczynnika korelacji linii regresji

Wyższa do 0.995 wartość współczynnika korelacji (R) oznacza liniowość i

określa liniowy zakres roboczy metody badań. Niższe od 0.97 i wyższe od

1.03 wartości wykładnika funkcji S=kc

x

(log S= x (log c) + log k, wyznaczają

granice liniowości, gdzie S – sygnał pomiarowy c – wartość mierzona

Wartość

współczynnika

kierunkowego linii

regresji określa czułość

metody

4

Granice roboczego

zakresu metody

Dolna granica oznaczalności , ewentualnie dolna

granica detekcji oraz górna granica liniowości i

ewentualnie górna granica oznaczalności

Jako dolna granica detekcji - trzykrotna wartość średnia dla ślepej próby, albo

trzykrotna wartość poziomu szumów wyznaczonego w jednostkach badanego

parametru, a jako dolna granica oznaczalności, odpowiednio, pięcio-krotność

Z użyciem materiałów odniesienia o
odpowiednim zakresie zmienności
badanego parametru, dla ubogiej,
typowej i bogatej matrycy

Marian Kamiński

Metody Analizy Technicznej

Cz-1. Systemy Zapewnienia Jakości

Strona 6 z 6

Politechnika Gdańska

Wydział Chemiczny

Katedra Chemii Analitycznej

L.p.

Element celu

badań

Badane parametry / właściwości metody badań /

metody analitycznej

Wymagania oraz kryteria akceptacji

Badane próbki i zakres

zmienności warunków

analitycznych

Uwagi

5

Korelacja

rezultatów w

stosunku do

metody odniesienia

Charakter korelacji, wartości współczynnika

kierunkowego i wyrazu wolnego oraz współczynnika

korelacji linii regresji, o ile możliwe, w całym zakresie

roboczym metody analitycznej

Wyznaczyć parametry linii regresji oraz ocenić stopień zgodności rezultatów

otrzymywanych walidowaną metodą badań oraz metodą odniesienia

Z użyciem materiałów odniesienia o

odpowiednim zakresie zmienności

badanego parametru, dla ubogiej,

typowej i bogatej matrycy

Zbadać, gdy metoda

odniesienia jest ogólnie

uznana za poprawną

6

Odporność metody

na zamierzone i nie
zamierzone zmiany

warunków

wykonania badania

Wpływ zmienności właściwości odczynników,

materiałów pomocniczych, gazów, kolumn,

stosowanych do badań, osoby wykonującej badania,

czasu przechowywania próbki itp. czynników na

otrzymane wyniki badań i na niepewność pomiarową

Wyznaczyć wartości średnie i rozstępy między średnimi wartościami

wyników badań tej samej próbki materiału odniesienia, badanej w różnych
warunkach. Wartości średnie wraz z przedziałem ufności wartości średniej

powinny być zawarte w zakresie rozszerzonego błędu standardowego

wartości średniej materiału odniesienia, a rozstępy między wartościami

średnimi - w przedziale górnej granicy powtarzalności metody badań

Z użyciem materiałów odniesienia o

typowej wartości badanego

parametru oraz dla typowej matrycy

Wykonać w zakresie
niezbędnym, gdy nie

można wykluczyć

wpływu zmienności
warunków badań na

wyniki oznaczania

Odchylenie standardowe i przedział ufności
pojedynczego wyniku oraz odchylenie standardowe i
przedział ufności wartości średniej wyznaczone w
laboratorium (jak w p. 1.);
Przedział ufności pojedynczego wyniku oraz przedział
ufności wartości średniej określone w czasie badaniach
międzylaboratoryjnych

Standardowa niepewność złożona certyfikowanego
materiału odniesienia (CRM), albo materiału
odniesienia Urzędu Miar, gdy były badane walidowaną
metodą analityczną

7

Niepewność

pomiarowa metody

badań

Obliczona (oszacowana) "standardowa i rozszerzona
niepewność złożona", według zasady "addytywnej
propagacji wariancji zdarzeń niezależnych".

Wyznaczyć odpowiednie wartości statystyczne, albo oszacowania i podać je

w raporcie walidacji. Porównać z odpowiednimi wartościami dla metody

odniesienia. Otrzymanie dla walidowanej metody badań wartości niższych od

wyznaczonych dla metody odniesienia jest dodatkowym argumentem dla

poprawności wyboru walidowanej metody badań

Dla niskich, typowych i wysokich

wartości badanego parametru, z

uwzględnieniem matrycy ubogiej,

typowej i bogatej

Alternatywne sposoby

postępowania, o ile

możliwe należy

zastosować co

najmniej dwa,

preferując metodę

„addytywnej

propagacji wariancji”

8

Selektywność

Stosunek wartości sygnału analitycznego „Sy” od

badanego parametru do sygnału analitycznego „Sx” od

określonego wybranego składnika matrycy próbki

(Sel=Sy/Sx)

Wartość Sel > 1000 oznacza metodę selektywną, Sel>10000 – metodę

wysoce selektywną, a wartość Sel<100 metodę nie selektywną

Stężenie składników, dla których

jest badana selektywność metody w

typowym dla niej zakresie

Wykonywać tylko dla

substancji należących
do prawdopodobnych

składników matrycy

9

Specyficzność

Wpływ zmian łącznego składu matrycy na wartość

sygnału analitycznego

Metoda jest specyficzna, gdy składniki obecne potencjalnie w matrycy

badanych próbek nie powodują zmiany sygnału analitycznego powyżej 1%

względnego. Gdy wpływ składników matrycy jest wyższy, należy przed

wykonaniem analizy zastosować odpowiednie metody przygotowania próbki,

w celu usunięcia składników zakłócających

Dla niskich, typowych i wysokich

wartości badanego parametru, z

uwzględnieniem matrycy ubogiej,

typowej i bogatej oraz metody
dodatku do próbki składników

matrycy mających potencjalnie

wpływ na wartość sygnału analit.

Zbadać tylko wtedy,

gdy jest określone

prawdopodobieństwo

obecności w matrycy

próbek składników, dla

których metoda badań

jest niespecyficzna

W przypadku niektórych metod analitycznych, opisanych w normach, farmakopei, albo w literaturze naukowej i poddanych uprzednio walidacji,
wykonanie pełnego programy nie jest konieczne i wystarczy walidację ograniczyć do pierwszych pozycji powyższej tabeli.