Replikacja DNA.

Amplifikacja DNA in vitro.

CYKL KOMÓRKOWY:

G0 – faza spoczynkowa, w której komórka nie ulega podziałom
G1 – faza przerwy, przygotowanie do replikacji
S –

synteza DNA

G2 - przerwa
M - mitoza

Inicjacja replikacji

Replikon – każdy odcinek DNA, który replikuje się jako pojedyncza jednostka,
komórka ssaka – 50 000 – 100 000 replikonów
Prokariota – koliste DNA stanowi 1 replikon

Synteza DNA w kierunku 5’  3’

Polimeraza nie rozpoczyna syntezy od pierwszego nukleotydu tylko wydłuża nić już
istniejącą

Konieczność syntezy krótkich sekwencji tzw. startery, które później są usunięte

Helikaza – rozplata helisę, białka SSB zapobiegają jej odtworzeniu

Polimeraza DNA:
Prokariota – 2 polimerazy DNA
Eukariota – 5 polimeraz DNA


Nić wiodąca – syntetyzowana w sposób ciągły


Nić opóźniona – rozpoczyna się z opóźnieniem, tworzą się fragmenty Okazaki

Replikacja telomerów – końce liniowych chromosomów nie mogą być w pełni zreplikowane

Telomery: (TTAGGG)n

Enzym telomeraza – zawiera krótką cząsteczkę RNA, która działa jako matryca do syntezy
powtórzeń na wystającym końcu 3’

W komórkach somatycznych aktywność telomerazy jest hamowana – skracanie
chromosomów, w komórkach rakowych może ulec reaktywacji

1 błąd na 10

6

– 10

8

nukleotydów

Aktywność egzonukleazy 3’ -> 5’

Wierność replikacji

• Jedna z najważniejszych metod badawczych w

biologii molekularnej

• Metoda ta pozwala amplifikować fragmenty DNA
• Opracowana w 1987 r – autor K. Mullis otrzymał

w 1993 r nagrodę Nobla w dziedzinie chemii

PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR (Łańcuchowa Reakcja Polimerazy)

Naśladuje zachodzącą in vivo replikację DNA

i wymaga następujących składników reakcji:

• matrycy DNA
• starterów komplementarnych do końców

wybranej sekwencji DNA

• czterech trójfosforanów deoksynukleotydów

(dNTP)

• termostabilnej polimerazy DNA
• jonów Mg

2+

Cykl reakcji PCR obejmuje następujące po

sobie 3 etapy:

• denaturacja dupleksu DNA w temp. 92

o

C – 96

o

C

• hybrydyzacja starterów do komplementarnych miejsc na matrycy w

temp. 37

o

C – 65

o

C

• wydłużanie startera przez dosyntetyzowanie dNTP przy udziale

polimerazy DNA w temp. 72

o

C

W wyniku PCR liczba cząsteczek DNA rośnie w postępie geometrycznym (po
każdym cyklu ich liczba ulega podwojeniu). Po zakończeniu około 30 cykli liczba
kopii DNA przekracza

kilka milionów

.

Reakcję PCR przeprowadza się w bloku grzejnym zwanym
termocyklerem, gdzie ustawia się temperaturę i czas
poszczególnych cykli. Wśród prób do reakcji PCR
przygotowuje się także kontrolę dodatnią i ujemną w celu
sprawdzenia prawidłowości przebiegającej reakcji.

Czynniki wpływające na PCR

• Matryca zdegradowana lub zanieczyszczona

• Niedobór lub nadmiar polimerazy

• Stężenie i sekwencja starterów

• Temperatura przechowywania odczynników

Modyfikacje metody PCR

• Nested PCR (wewnętrzny)
• RT-PCR
• PCR-RFLP (polimorfizm długości fragmentów

restrykcyjnych)

• Real-time PCR (w czasie rzeczywistym)
• Multiplex PCR
• Qantititative PCR (ilościowy)
• Competitive PCR (konkurujący)
• Touch-down PCR (hamowany)
• RAPD-PCR (losowa amplifikacja polimorficznego DNA)
• Booster PCR (regulowany)
• Race PCR

Nested - PCR (wewnętrzny)

•

Dwie pary starterów:



Pierwsza para zewnętrzna



Druga para wewnętrzna

•

Amplifikacja DNA jest dwuetapowa

•

Dzięki użyciu dwóch par starterów zwiększona specyficzność i czułość metody

PCR ilościowy w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR)

Detektory niespecyficzne - cząsteczki fluorochromu emitujące światło o określonej długości
po związaniu z dsDNA (np bromek etydyny, SYBR Green). Najprostsza i najmniej kosztowna
metoda, ale podatna na błędy. Specyficzne - startery lub sonda wyznakowana
fluorescencyjnie np TaqMan

RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction)

SSCP PCR

(single stranded conformation polymorphism)

Do wstępnej identyfikacji mutacji punktowych.

1. Amplifikacja danego fragmentu
2. Denaturacja
3. Elektroforeza

• Zmiana właściwości fizyko-chemicznych DNA spowodowana
różnicami składu nukleotydowego
• Wykorzystanie różnic mobilności cząsteczek w żelu
• Nawet pojedyncza mutacja może powodować zmiany konformacji,
co skutkuje zmianą mobilności DNA

RAPD PCR

(random amplified polymorphic DNA)

• Losowe namnażanie sekwencji, stosowany jeden krótki starter, większa liczba cyki

• Starter wiąże się z genomowym DNA w wielu miejscach, po amplifikacji na żelu
charakterystyczny układ prążków („odcisk palca”)

PGD Diagnostyka preimplantacyjna

Pozwala na genetyczną analizę komórek jajowych przed zapłodnieniem bądź też zarodków
przed implantacją metodą wspomaganego rozrodu.

Zastosowanie techniki PCR

DIAGNOSTYKA MIKROORGANIZMÓW (JAKOŚCIOWA I ILOŚCIOWA):

zakażenia bakterią: Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Mycobacterium

tuberculosis, Borrelia burgdorferii

pierwotniakiem Toxoplasma gondii

wirusem HIV, CMV (cytomegalia), Herpes simplex, zapalenia wątroby typu B (HBV),

typu C (HCV)

DIAGNOSTYKA CHORÓB NOWOTWOROWYCH:

mutacja w genach BRCA1 i BRCA2

ryzyko nowotworowe - mutacje genów kodujących białka naprawcze, odpowiedzialne za

nadwrażliwość na estrogeny

zagrożenia nowotworem szyjki macicy – wykrywanie wirusa HPV (wirus brodawczaka

ludzkiego)

DIAGNOSTYKA CHORÓB GENETYCZNYCH

•

mukowiscydoza

•

DMD, BMD

•

choroba Alzheimera, Parkinsona

•

dziedziczna skłonność miażdżycowa

DIAGNOSTYKA NIEPŁODNOŚCI MĘSKIEJ O PODŁOŻU GENETYCZNYM
•

(brak plemników w nasieniu - mikrodelecje na chromosomie Y)

USTALANIE POKREWIEŃSTWA I OJCOSTWA

KRYMINALISTYKA

BADANIE ŻYWNOŚCI W KIERUNKU MODYFIKACJI GENETYCZNEJ GMO
•

(kukurydza, soja, zboża, pomidory, ziemniaki) - analiza jakościowa i ilościowa

BADANIA MIKROBIOLOGICZNE ŻYWNOŚCI
•

(Staphylococcus aureus, Salmonella species, Shigella species, Listeria species)

BADANIA NAUKOWE
•

(biologia molekularna, biotechnologia, badania ewolucyjne, antropologia, badania środowiskowe)

Sekwencjonowanie

Metoda wykorzystywana do :
• wykrywania nowych mutacji
• diagnostyki gatunków niedostatecznie poznanych, nowych

szczepów

-

DNA w postaci czystej (np. plazmidy zawierające klony)

-

Polimeraza klonuje ssDNA

-

4 reakcje – każda z innym ddNTP

-

Rozdzielenie różnej długości fragmentów DNA na żelu

Sekwencjonowanie - metoda Sangera

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

• Elektroforeza
• Utrwalenie badanej próby na podłożu (membrana)
• Zablokowanie niezwiązanych miejsc
• Inkubacja z sondą
• Odpłukanie niezwiązanych cząsteczek
• Wywołanie - uwidocznienie miejsc powiązania sondy
z badaną próbą

Southern blotting Hybrydyzacja DNA

Nothern blotting Hybrydyzacja RNA

Western blotting Hybrydyzacja białka