1

7. Biochemia - nukleotydy i kwasy nukleinowe

Białka są kodowane przez geny

DNA

RNA

białko

chemiczna natura

sekwencja nukleotydów

sekwencja nukleotydów

sekwencja aminokwasów

Dogmat biologii molekularnej

replikacja

transkrypcja

translacja

białko

Kwasy nukleinowe (DNA i RNA) składają się z nukleotydów

fosforan

pentoza

(ryboza

lub deoksyryboza)

puryna

lub pirymidyna

pirymidyna puryna

puryny

pirymidyny

puryna adenina

guanina

pirymidyna cytozyna uracyl

tymina

2

Nukleotydy i nukleozydy: deoksyrybonukleotydy

nukleotyd:

deoksyadenylan deoksyguanylan

deoksytymidylan deoksycytydylan

A, dA, dAMP G, dG, dGMP

t, dT, dTMP C, cD, dCMP

(deoksyadenozyno-

(deoksyguanozyno-

(deoksytymidyno-

(deoksycytydyno-

5’fosforan) 5’-fosforan) 5’-fosforan) 5’-fosforan)

nukleozyd:

deoksyadenozyna deoksyguanozyna deoksytymidyna deoksycytydyna

nukleotyd: zasada + cukier + fosforan

nukleozyd: zasada + cukier

zasada:

adenina guanina

tymina cytozyna

Nukleotydy i nukleozydy: rybonukleotydy

nukleotyd:

adenylan guanylan

urydylan cytydylan

(adenozyno-

(guanozyno-

(urydyno-

(cytydyno-

5’-fosforan) 5’-fosforan) 5’-fosforan) 5’-fosforan)

A, AMP G, GMP

U, UMP C, CMP

nukleozyd:

adenozyna guanozyna

urydyna cytydyna

zasada:

adenina guanina

uracyl cytozyna

nukleotyd: zasada + cukier + fosforan

nukleozyd: zasada + cukier

Niektóre rzadkie zasady w DNA

Niektóre rzadkie zasady w RNA

DNA

RNA

Nukleotydy łączą się z sobą
za pośrednictwem wiązania
fosfodiestrowego

wiązanie fosfodiestrowe

RNA ulega szybkiej hydrolizie w warunkach alkalicznych

3

5’-koniec

3’-koniec

5’

3’

5’

3’

Sekwencję DNA zapisujemy od 5’ do 3’-końca

Oligononukleotyd: krótka sekwencja kwasu nukleinowego (<50 zasad).
Polinukleotyd: długa sekwencja kwasu nukleinowego.

Nukleotydy absorbują promienie ultrafioletowe

Struktura DNA

Wiązania wodorowe łączą z sobą dwie nici DNA
G

≡≡≡≡

C: trzy wiązania wodorowe

A=T: dwa wiązania wodorowe

Model dwuniciowej helisy DNA

większa bruzda

mniejsza bruzda

odstęp między zasadami: 0.34 nm

Obraz dyfrakcji promieni rentgenowskich
na hydratowanym włóknie DNA

3.6 nm

Podwójna helisa ma stałą szerokość

wnętrze

jest hydrofobowe

fosforany
mają ujemny
ładunek

wiazanie wodorowe

Pary zasad są ułożone prostopadle do cukrów

cukier

zasada

fosforan

4

1953: DNA = podwójna spirala. James Watson, Francis Crick

Cambridge

DNA ma duży i mały rowek

Komplementarność zasad w helisie DNA:

A=T; C

≡≡≡≡

G

Replikacja DNA według Watsona i Cricka

macierzysta potomne macierzysta

nić nici nić

Palindrom

→

→

→

→

struktura spinki do włosów

spinka do włosów

jednoniciowe DNA (RNA)

mRNA (informacyjny RNA) koduje białka

DNA

RNA

białko

chemiczna natura

sekwencja nukleotydów

sekwencja nukleotydów

sekwencja aminokwasów

5

Struktura mRNA

Drugorzędowa struktura mRNA

Trójwymiarowa struktura RNA: rybozym

Rybozymy: cząsteczki RNA,
które mają zdolność katalizowania
reakcji (przeważnie związanych
z metabolizmem RNA)

„hammerhead ribozyme”

Właściowści DNA:
denaturacja

dwuniciowe DNA

denaturacja

częściowo zdenturowane DNA

zdenturowane DNA

rozdzielenie
nici

Czynnikiem powodującym denaturacje
może być ciepło lub zasadowe pH.

Częściowo zdenaturowane DNA

DNA o podobnej sekwencji może tworzyć podwójne nici = hybrydyzacja

6

Sekwencjonowanie DNA metodą Sangera

matryca

starter

polimeraza DNA dodaje komplementarne zasady
do jednoniciowego DNA

Dideoksynukleotyd

Wprowadzony do mieszaniny wraz z „normalnymi” nukleotydami
bedzie powodował przerwanie syntezowanego łańcucha DNA

Sekwencjonowanie DNA

Automatyczne sekwencjonowanie DNA

DNA może być otrzymywane syntetycznie

Inne funkcje nukleotydów

7

ATP (adenozynotrifosforan): główny przenośnik energii w komórce

ester

bezwodnik

bezwodnik

ATP

bezwodnik octowy

octan metylu
(ester metylowy kwasu octowego)

Hydroliza wiązań bezwodnikowych daje więcej
energii, niż hydroliza estru.

ATP – środek wymiany energii swobodnej

ATP + H

2

O = ADP + P

i

+ H

+

= -30,6 kJ/mol

ATP + H

2

O = ADP + PP

i

+ H

+

= -30,6 kJ/mol

Energia swobodna uwolniona w czasie hydrolizy ATP, jest wykorzystywana
do przeprowadzania reakcji wymagających jej dostarczenia, takich jak skurcz mięśni.

Tworzenie ATP z ADP i P

i

następuje w wyniku utleniania

pokarmu w organizmach chemotroficznych, czy też pochłaniania energii świetlnej
w organizmach fototroficznych.

Cykl ATP-ADP jest podstawowym sposobem wymiany energii w układach biologicznych.

Tworzenie oraz zużywanie ATP

są procesami ciągłymi

ATP służy jako bezpośredni donor energii swobodnej w układach
biologicznych.

W typowej komórce cząsteczka ATP jest zużywana w ciągu minuty
od jej powstania.

Odpoczywający człowiek zuzywa ok. 40 kg ATP w ciągu doby.
W czasie wysiłku szybkość zużycia ATP może wynosić 0,5 kg na minutę.

Organizmy chemotroficzne uzyskują energię swobodną

w wyniku utleniania cząsteczek paliwa, takich jak glukoza i

kwasy tłuszczowe.

W organizmach tlenowych końcowym akceptorem elektronów jest O

2

.

Substraty przekazują elektrony do specjalnych przenośników
oksydoredukcyjnych, które są albo

nukleotydami pirymidynowymi

,

albo

flawinami

.

Zredukowane formy tych przenośników przekazują następnie
swoje elektrony o wysokim potencjale do O

2

za pośrednictwem

łańcucha transportu elektronów,
który znajduje się w wewnętrznej błonie mitochondriów.

Gradient protonowy powstający w wyniku tego przepływu
elektronów zasila następnie syntezę ATP z ADP i P

i

.

Proces ten nazywany jest

fosforylacją oksydacyjną.

NADH i FADH

2

są głównymi przenośnikami elektronów w

procesie utleniania „paliwa molekularnego”

Struktura utlenionej formy dinukleotydu
nikotynamidoadeninowego (NAD

+

) i

fosforanu dinukleotydu
nikotynamidoadeninowego (NADP

+

).

NAD

+

:

R

= H

NADP

+

:

R

= PO

3

2-

NAD

jest głównym akceptorem elektronów

w reakcjach utleniania substratów oddechowych.

Pierścień nikotynamidowy (niacyna)

NAD

+

, NADH, NADP

+

NAD

+

: utleniony (stężenie 10

-5

M)

NADH: zredukowany

NADP

+

: ester kwasu fosforowego, utleniony

(stężenie: 10

-6

M)

NADPH: zredukowany

NAD

+

> NADH

NADP

+

< NADPH

8

Wiązanie elektronów przez NAD

+

W tej reakcji odwodorowania jeden atom wodoru z cząsteczki substratu jest
przenoszony bezpośrednio do NAD

+

, natomiast inny pojawia się w roztworze jako

proton.

Oba elektrony z substratu przenoszone są bezpośrednio do pierścienia
nikotynamidowego.

NADPH jest głównym donorem elektronów

w biosyntezach redukcyjnych

NAD

+

: tworzenie ATP; zazwyczaj w ramach reakcji

katabolicznej.

NADPH

: reakcje biosyntezy wymagające siły redukcyjnej;

zazwyczaj jako część reakcji

anabolicznej

.

Dodatkowa grupa fosforanowa jest znacznikiem, kierującym
do odpowiednich enzymów.

NAD

+

> NADH

NADP

+

< NADPH

Dinukleotyd flawinoadeninowy,
akceptor elektronów w reakcjach
typu:

Przyjmuje 2 elektrony, ale w przeciwieństwie
do NAD

+

, wiąże proton tak samo jak jon

hydroniowy

mononukleotyd
flawinowy
(ryboflawina, B

2

)

AMP

Koenzym A: uniwersalny przenośnik grup acylowych

miejsce
reagujące

Acetylo-CoA przenosi aktywne grupy acetylowe,
podobnie jak ATP przenosi aktywne
grupy fosforanowe.

Może przenosić grupy acylowe o długości 2 – 24 C

Niektóre koenzymy zawierajace adenozynę

koenzym A

dinukleotyd nikotynamidoadenylowy dinukleotyd flawinoadenylowy

Nukleotydy jako cząsteczki regulatorowe

cykliczny 3,5’-adenozynomonofosforan (cAMP)

cykliczny 3,5’-guanozynomonofosforan (cGMP)

guanozynotetrafosforan

9

Rozluźny i superskręcony plazmid DNA

Plazmid: mała, kolista cząsteczka DNA

Usunięcie jednego obrotu
spirali powoduje powstanie
sił skręcających DNA

rozluźniony (8 obrotów)

napięty (7 obrotów)

superskręcony

rozdzielenie nici

Topoizomerazy skręcają DNA

rozluźnione DNA

superskręcone DNA

Liczba chromosomów u człowieka: 46

Każdy chromosom zawiera jedną, dwuniciową
cząsteczkę DNA.

Komórki somatyczne zawierają
podwójną liczbę chromosomów

.

ludzkie chromosomy

Ludzkie chromosomy: 22 autosomy + 2 chromosomy płciowe

Chromatyna

W komórkach eukariotycznych które się nie dzielą,
cały materiał genetyczny jest amorficzny
i jest równo rozłożony w jądrze.

Chromatyna składa się równej masy DNA i białek.
DNA jest zasocjowane z białkami zwanymi

histonami

,

i ułożone w struktury zwane

nukleosomami

.

jądro
histonowe DNA łączące nukleosomy

nukleosom

10

Histony to małe, zasadowe białka

DNA

Nukleosomy sa upakowane w struktury wyższego rzędu

Organizacja DNA w chromosomie eukariotycznym

dwie chromatydy
(10 spiral)

spirala
(30 rozet)

rozeta
(6 pętli)

pętla
(ok. 75 000 par zasad)

włókno

nukleosomy

DNA

DNA jest związane
z matrycą jądra
za pomocą sekwencji
nazywanych MAR
(Matrix Attachment Regions).

Sekwencje te są bogate w AT,
ale nie zawierają
charakterystycznych
sekwencji.

Lamina jest białkiem, które asocjuje
tworząc sieć wewnątrz jądra.
W czasie mitozy, fosforylacja lamin
powoduje ich dysocjację.

Progeria jest chorobą, w której mutacja w cząsteczce laminy
powoduje jej nieprawidłowe funkcjonowanie. Wrażliwość
chromosomów na uszkodzenia powoduje bardzo szybkie starzenie się.

11

Progeria: nieprawidłowa struktura laminy wywołana mutacją
powoduje brak możliwości naprawy uszkodzeń DNA,
i niestabilność genomu.

Chromosomy są widoczne tylko
w czasie mitozy.

W czasie interfazy, większa część
chromatyny występuje w postaci

euchromatyny

, która jest luźno

upakowaną formą chromatyny.

Heterochromatyna

jest gęsto upakowaną

formą chromatyny. Heterochromatyna
pozostaje gęsto upakowana w czasie
interfazy.

Heterochromatyna zawiera powtarzające
się sekwencje DNA, które nie ulegają
transkrypcji.

Heterochromatyna tworzy skupiska w jądrze

Każdy chromosom ma charakterystyczny wzór barwienia
barwnikiem Giemsy, nazywany pasmami G.
Regiony barwiące się różnią się zawartością zasad G-C.

Chromosom X też ma charakterystyczny układ pasm

Chromosom można nazwać

narzędziem segregacji materiału genetycznego

.

W czasie mitozy, chromosmy są przeciągane do przeciwległych
biegunów komórki przez mikrotubule, które wiążą się z centromerami.

Centromery często zawierają heterochromatynę bogatą
w sekwencje satelitarne.

12

Centromery zawierają sekwencje DNA, które wiążą specyficzne białka.
Te białka wiążą białka, które z kolei wiążą mikrotubule.

Każdy chromosom ma na obu końcach
wydłużone sekwencje zwane

telomerami

.

Telomery sa konieczne dla zachowania
stabilności chromosomu, i chronią
chromosomy przed fuzją (połączeniem
końców).

Telomery nie podlegają powieleniu
przez polimerazę DNA, ponieważ
w takim przypadku następowałoby
skracanie chromosomu przy każdym
podziale, ponieważ polimeraza
nie może wystartować na końcu DNA.

Telomer zawiera powtarzające się sekwencje C

>1

(A/T)

1-4

Koniec telomeru tworzy pętlę, ponieważ wolne końce DNA
są natychmiast rozpoznawane przez czynniki naprawcze.

3’-koniec telomeru (jednoniciowy) tworzy dupleks z homogicznym
fragmentem. Reakcja jest katalizowana przez białko TRF2.

Telomery są syntezowane
przez

telomerazę

.

Telomeraza jest odwrotną
transkryptazą, zawierającą RNA,
które stanowi matrycę dla
powtarzających się sekwencji DNA.

13

Działanie telomerazy

Mutacja telomerazy u drożdży powoduje skracanie telomerów
z 400 par zasad do 0 w ciągu 120 pokoleń.
Skracanie telomerów powoduje starzenie się komórek.

Telomeraza jest aktywna tylko w komórkach zarodkowych
i aktywowanych limfocytach. Komórki ze skróconymi
telomerami nie dzielą się lub umierają.

W 90% nowotworów telomeraza jest aktywna

„Ścieranie się” chromosomów: skracanie telomerów może spowodować
fuzję chromosomów, która w czasie anafazy daje chromosomy
z delecjami i amplifikacjami.

Geny składają się z intronów i eksonów.

Eksony kodują białko, introny nic nie kodują.

W czasie splajsingu (wycinania intronów) introny są usuwane.

14

Kolejność eksonów w DNA i RNA jest taka sama

Introny zawierają zazwyczaj kodony STOP (sekwencje zatrzymania):

wycięcie intronów powoduje powstanie ciągłej ramy odczytu

Czy zawartość DNA jest powiązana

ze stopniem skomplikowania organizmu?

Ilość genów wzrasta wraz
ze stopniem skomplikowania
organizmu

Ilość genów u eukariotów może wynosić od 6000 do 40 000

Tylko połowa genów ma znaną funkcję

15

Geny zajmują 25% ludzkiego genomu,

ale tylko 1% koduje białka

Mitochondrialne DNA drożdży zawiera takie same geny

co mitochondrialne DNA człowieka

Mitochondrialne DNA u zwierząt dziedziczy się po matce

DNA plemnika wchodzi do jaja
w czasie zapłodnienia,
ale mitochondria pozoastają
zamnknięte.

Chloroplasty mają ponad 100 genów

Jak mogły powstać mitochondria

Duplikacja genów jest siłą sprawczą ewolucji.

Zduplikowane geny mogą zmienić funkcję lub zamilknąć.

16

Geny kodujące globinę są zorganizowane w grupach

Globina: białkowa część hemoglobiny. Tetramer.
Dorosły:

α

αα

α

2

δδδδ

2

,

α

αα

α

2

ββββ

2

Płód (3-9 miesięcy):

α

αα

α

2

γγγγ

2

Embrion (<8 tygodni):

ζζζζ

2

εεεε

2

,

ζζζζ

2

γγγγ

2

,

α

αα

α

2

εεεε

2

Formy płodowe mają wyższe powinowactwo wobec tlenu.

Ekspresja genów hemoglobiny zmienia się w czasie rozwoju człowieka

Wszystkie geny kodujące globiny powstały w wyniku duplikacji
i mutacji w „pragenie”, który miał 3 eksony.

Grupy (klastery)

α

αα

α

i

ββββ

zostały rozdzielone we wczesnym okresie

ewolucji kręgowców, następne geny powstały w wyniku duplikacji.

Geny kodujące globinę
zduplikowały się
i uległy dywergencji
(zróżnicowaniu)

Talasemie powstały w wyniku delecji w genach

α

αα

α

lub

ββββ

Talasemia (niedokrwistość śródziemnomorska),
spowodowana zaburzeniem stosunku liczby
jednostek hemoglobiny

α

αα

α

i

ββββ

. Brak genów

α

αα

α

objawia się w postaci oprzęku płodu.

Duplikacja genów może nastąpić w wyniku nierównego crossing-over.

Ma on miejsce wtedy, gdy rekombinacja zachodzi między miejscami,

które nie sa homologiczne.

W rezultacie, jeden chromosom ma delecję, a drugi insercję.

17

W wyniku kolejnych,
nierównych rekombinacji,
powstają powtórzenia.

Satelitarne DNA:
DNA z wieloma bardzo krótkimi
powtórzeniami, bez znanej
funkcji.

Znajdowane w dużych blokach,
często w okolicach centromeru.

Satelitarne DNA daje osobny prążek w czasie wirowania

w gradiencie gęstości

Satelitarny DNA u myszy powstał w wyniku duplikacji i mutacji,
ma 234 pz, i można w nim wyróżnić połówki i ćwiartki powtórzeń

Minisatelitarny DNA
może być pomocny
w dochodzeniu
ojcostwa

07. Biochemia - nukleotydy i kwasy nukleinowe

Tematy do zapamiętania

1. Budowa kwasów nukleinowych: nukleotydy i nukleozydy.
2. Struktura DNA, komplementarność zasad.
3. Rola i struktura mRNA.
4. Inne funkcje nukleotydów.
5. Budowa chromosomu, telomery.
6. Budowa genu, introny i eksony.