Ćwiczenie 1 (MO)

1. Sterylizacja = wyjałowienie ≠ dezynfekcja



Sterylizacja to pozbycie się wszystkich form wegetatywnych i przetrwalnikowych bakterii.







Dezynfekcja to pozbycie się do 100% form wegetatywnych bakterii (np. poprzez gotowanie,

przetarcie powierzchni etanolem itd.)



Zadanie: wyjaśnij pojęcia (dekoktacja, tyndalizacja, gotowanie, wyżarzanie)

2. Metody sterylizacji

a) sterylizacja w suchym gorącym powietrzu.

Urządzenie do takiej sterylizacji to szafa sterylizacyjna, potocznie nazywana „suszarką”.

Parametry sterylizacji: 162 °C, 2h,

Sterylizowane materiały: szkło, elementy metalowe, materiały sypkie (np. piasek), wata, korki bibułowe i z waty

b) sterylizacja w parze bieżącej (tyndalizacja)

Przeprowadzana w aparacie Kocha. Budowa aparatu Kocha (niehermetyczna pokrywa, kocioł wewnętrzny z
dziurkowanym dnem, kocioł zewnętrzny, grzałki, woda)

Tyndalizacja (parametry): ogrzewanie materiałów przez 30 min w 100°C, a następnie inkubacja tych materiałów w
37°C. Podgrzewanie i inkubację wykonujemy łącznie trzykrotnie.
W trakcie ogrzewania w 100°C zabijane są formy wegetatywne bakterii. Ponadto, dzięki ogrzewaniu i
odpowiednim warunkom pokarmowym następuje indukcja germinacji form przetrwalnikowych i powstają z nich
formy wegetatywne. W kolejnych ogrzewaniach do 100°C te drobnoustroje są również zabijane.

Sterylizowane materiały: niektóre roztwory i pożywki z żelatyną, związkami żelaza, niektórymi aminokwasami i
cukrami.

Zadanie: ze źródeł internetowych pobierz schemat budowy aparatu Kocha

c) sterylizacja w parze nasyconej (autoklawowanie)

budowa autoklawu(hermetyczna pokrywa, płaszcz, komora wewnętrzna z otworem, odpowietrzacz, grzałki i woda)

Parametry i sterylizowane materiały:



¾ atmosfery, 117°C, 15min [pożywki z niektórymi białkami i aminokwasami]







1 atmosfera, 121°C, 20 min [większość pożywek, większość elementów plastikowych w tym tipsy do pipet
automatycznych, opcjonalnie materiały szklane i metalowe]







2 atmosfery, 134°C, 40 min [brudy mikrobiologiczne (wykorzystane hodowle i wszystko co miało z nimi
kontakt)]



Zadanie: ze źródeł internetowych pobierz schemat budowy autoklawu

d) sterylizacja przez sączenie – surowica krwi (w wysokich temperaturach aglutynuje), węglan wapnia (uwalnia się CO

2

),

mocznik (rozpada się na CO

2

i H

2

O), bufory (tracą właściwości buforujące), niekt. pożywki

*Filtry porcelanowe starego typu: Chamberlanda, Seitza i Schotta, Berkefelda

*Filtry jednorazowego użytku z nitrocelulozy, octanu celulozy, PVDF i in.
średnica porów: 0,2 µm, 0,3 µm, 0,45 µm i in.

*Filtry strzykawkowe jednorazowego użytku z nitrocelulozy, octanu celulozy, PVDF i in.
średnica porów: 0,2 µm, 0,3 µm, 0,45 µm i in.

e)

inne metody sterylizacji: UV, prom. jonizujące, tlenek etylenu, ozon, chlor, fluor

f)

UHT -

cienki strumień sterylizowanego w ten sposób płynu ogrzewany w szybkim czasie do

135

°C

, przez 1-2

sekundy, a następnie szybko schładzany. Pozwala to na pozbycie sie drobnoustrojów, a jednocześnie zachowanie
części walorów smakowo-zapachowych

3. Pasteryzacja.

Pasteryzacja nie jest formą sterylizacji. W wyniku tego procesu zabijanych jest 70% form wegetatywnych. Metoda polega na
ogrzewaniu żywności i napojów, a następnie na ich gwałtownym schłodzeniu (w ten sposób właściwości smakowe i zapachowe
zostają zachowane).

Wyróżniamy kilka form pasteryzacji:

*pasteryzacja niska: 30 minut 63°C
*pasteryzacja wysoka: 15 sekund 72°C wysoka

4. Kontrola autoklawu:

a)

test biologiczny (Sporal A) – fiolka zawierająca endospory B. stearothermophilus na bibułce. Obok znajduje się

szklana rurka z pożywką zawierającą purpurę bromokrezolową (barwa fioletowa). Test wkłada się do autoklawu,
przeprowadza sterylizację, a po wyjęciu testu ściska się cały pakiet tak aby szklana rurka w środku pękła i pożywka wylała się
na bibułkę. Inkubacja 2 dni w 56°C. Jeżeli po 2 dniach barwa fioletowa zmieni się na żółtą oznacza to, że autoklaw jest
niesprawny. Barwa fioletowa oznacza, że w trakcie inkubacji nie doszło do rozwoju spor bakteryjnych czyli ich tam nie ma
(więc autoklaw sprawny).

b)

test chemiczny – taśma w kolorze żółtym naklejana na sterylizowane materiały. Jeżeli po sterylizacji taśma

pozostaje żółta oznacza to, że autoklaw jest niesprawny. Jeżeli taśma zmieni barwę na żółtą oznacza to, że autoklaw osiągnął
odpowiednie parametry sterylizacji

c)

test chemiczny II – pakiecik, wewnątrz którego jest wskaźnik chemiczny ze zdolnością do migracji wewnątrz

pakietu pod wpływem odpowiedniej temperatury. Jeśli osiągnie punkt „accept” to autoklaw sprawny. Punkt „reject” –
autoklaw niesprawny

5. Kontrola sterylizacji w suchym, gorącym powietrzu

Sporal S –

test biologiczny. Krążki

bibuły nasączone formami przetrwalnikowymi

B. subtilis

wkładamy do suszarki razem ze

sterylizowanymi materiałami i przeprowadzamy wyjałowienie (2h, 160°C). Następnie inkubuje się bibułkę w pożywce płynnej
(bulion zwykły) przez 7 dni w 37°C. Jeżeli pożywka pozostaje klarowna po inkubacji – autoklaw sprawny. Jeżeli pożywka uległa
zmętnieniu (poprzez rozwój bakterii) należy uznać, że aparat sterylizacyjny nie osiąga wymaganych parametrów.

6.

Przygotowanie szkła do inkubacji

a) mycie szkła wodą z płynem

b) korki z bibuły

c) pipety zatykane watą