G

ENETYKA

NETYKA

NETYKA

n

a

u

c

za

n

ie

b

io

lo

g

ii

i

p

rz

yr

o

d

y

2

0

12

2

Genetyka 2012

W

YKŁAD

1

Genetyka jest nauką badającą zjawiska dziedziczności i zmienności organizmów żywych.

INFORMACJA GENETYCZNA

NOŚNIKI INFORMACJI GENETYCZNEJ

Upakowanie DNA w chromatynie eukariotycznej
DNA występuje zawsze w powiązaniu z białkami. W komórce prokariotycznej (bakteryjnej) ilość białek
powiązanych z DNA jest stosunkowo niewielka. We wnętrzu jądra komórki eukariotycznej występuje
natomiast duża ilość białek (histonowych i niehistonowych) tworzących wraz z DNA i RNA złożoną
strukturę zwaną chromatyną. Ilość DNA w komórkach eukariotycznych jest bardzo duża.

Poziomy organizacji chromatyny:

•

nukleosom

•

nukleofilament

•

solenoid

•

supersolenoid z pętli chromatynowych

•

włókna chromatynowe- mini pasma

•

zwoje włókien chromatynowych z rozetami

•

stosy rozet – chromosom metafazowy

NUKLEOSOM

Nukleosom to rdzeń nukleosomu wraz z owiniętym DNA i cząsteczką histonu H1.

Nukleosom powstaje gdy histony łączą się między sobą powodując że DNA owija się w przybliżeniu dwa
razy wokół utworzonego kompleksu histonów. Ten kompleks – cząsteczka rdzeniowa nukleosomu zawiera
w swoim wnętrzu dwie cząsteczki histonu H3 i dwie histonu H4. Tetramer H3-H4 otaczany jest dwiema
parami czyi dimerami histonów H2A-H2B. Przypuszczalnie koniec każdej cząsteczki histonu sterczy w
postaci ogona z rdzenia, gotów do oddziaływań z innymi cząsteczkami. U wielu (ale być może nie u
wszystkich) organizmów histon H1 pomaga w zakotwiczeniu DNA do rdzenia.
Histony H3 i H4 są przykładem bardzo „konserwatywnych białek” tj. takich które prawie nie ulegają
zmianom w procesie ewolucji. Bardzo podobne histony występują np. w komórkach drożdży, roślin i ludzi.

Zawartość DNA w diploidalnym genomie wyrażana jest jako 2C. Przez C oznaczono umowną wartość ilości
DNA w jądrze komórkowym. W gametach zawartość DNA jest więc 1C, od telofazy do początku fazy S
wynosi 2C a po replikacji DNA wynosi aż 4C. Zawartość 2C DNA nie jest skorelowana z łączna długością
chromosomów.

W jądrach komórkowych niemal wszystkich organizmów występuje duży nadmiar zawartości DNA w
stosunku do potrzeb związanych z zapewnieniem pełnej funkcjonalności tych organizmów.
Ten intrygujący problem biologii nazwano ,,paradoksem zawartości C DNA”. Paradoks C DNA jak również
brak zależności między zawartością DNA i liczbą chromosomów jest spowodowany obecnością sekwencji
powtarzalnych.

BUDOWA CHROMOSOMU METAFAZOWEGO

Skład genetyczny organizmów eukariotycznych kształtował się w długim procesie ewolucyjnym, w wyniku
którego każdy gatunek ma stałą i charakterystyczną dla siebie liczbę chromosomów. Chromosomy
metafazowe są najbardziej skondensowaną formą chromosomów. Badania w mikroskopie optycznym, po
odpowiednim wybarwieniu wykazują szereg cech morfologicznych umożliwiających ich identyfikację.

CENTROMER

3

Genetyka 2012

W każdym chromosomie znajduje się centromer, zwany przewężeniem pierwotnym, który jest
odpowiedzialny za rozdział siostrzanych chromatyd w anafazie. W centromerze wyróżniamy domenę
,,łączącą” tj. region chromatyny między siostrzanymi chromatydami oraz domenę ,,centralną”, która jest
skupieniem chromatyny centromerowej, położonej między kinetochorem a domeną łączącą. Do centromeru
przyczepiona jest swoiście grupa kilku białek, z których część tworzy kinetochor, czyli obszar
wyspecjalizowany, związany z przemieszczaniem się chromosomów do biegunów komórki.
W centromerach ssaków znajdują się sekwencje powtarzającego się satelitarnego DNA.
Funkcja satelitarnego DNA nie jest znana. Związek z heterochromatyną a także podobna (u różnych
gatunków) długość, zbieżna z odległością pomiędzy kolejnymi nukleosomami zdają się wskazywać na udział
sekwencji satelitarnych w organizacji DNA na nukleosomie a następnie w budowie chromosomu jako
stabilizatora jego struktury.
Sekwencjom satelitarnym przypisana jest rola w tworzeniu centromeru oraz w koniugacji chromosomów,
rekombinacji pomiędzy niehomologicznymi chromosomami oraz w regulacji transkrypcji.

OBSZAR JĄDERKOTWÓRCZY NOR

W komórkach Eukaryota istnieje wielkie zapotrzebowanie na nowe cząsteczki rRNA. Szacunkowe dane
mówią nawet o 10

7

rybosomów w komórce zwierzęcej (u E. coli około 20 tys. rybosomów). Jeśli komórka

dzieli się raz na 24 godziny, to nowe rybosomy, a więc i nowe cząsteczki rRNA muszą być syntetyzowane z
szybkością około 100 cząsteczek na minutę. Jest to możliwe dzięki istnieniu licznych kopii genów dla rRNA
zlokalizowanych w obszarach jąderkotwórczych chromosomów.

CHROMOSOMY OLBRZYMIE (POLITENICZNE)

Chromosomy z gruczołów ślinowych Drosophila są zdespiralizowane i przez to bardzo długie. Zachowują
wygląd przypominający stadium profazy, dzięki czemu zawsze nadają się do barwienia i szczegółowej
obserwacji.
Chromosomy politeniczne umożliwiają także badania obszarów wykazujących aktywność metaboliczną
genów w chromosomach. Obszary takie charakteryzują się rozluźnieniem struktury prążków i wytwarzaniem
charakterystycznych zgrubień zwanych pierścieniami Balbianiego lub pufami.

TELOMERY

W każdej komórce somatycznej człowieka znajduje się 46 liniowych chromosomów. Wiadomo, że liniowe
chromosomy są znacznie mniej stabilne niż koliste, spotykane choćby w postaci plazmidów. Dlaczego zatem
taka mniej stabilna struktura zachowała się w toku ewolucji przez miliony lat?. Okazuje się że właśnie w tej
,,słabszej” stabilności możliwe jest częstsze (oczywiście tylko w perspektywie ewolucji) zachodzenie
rekombinacji oraz przypadkowych translokacji międzychromosomalnych, warunkujących występowanie
różnorodności genetycznej żyjących organizmów.
Dzisiejsze zainteresowanie telomerami i telomerazą wzięło się z doświadczeń przeprowadzonych w latach
trzydziestych przez dwoje wybitnych genetyków McClintok i Mullera. Pracując niezależnie od siebie i
badając odmienne organizmy, oboje zauważyli, że chromosomy mają na swych końcach specjalne składniki,
które zapewniają im stabilność. Muller wymyślił dla nich nazwę „telomery” (z greckiego telos – koniec,
meros – część).
McClintock stwierdziła, że bez tych końcowych tworów chromosomy kleją się do siebie, ulegają zmianom
strukturalnym i w ogóle „źle się prowadzą”. Zagraża to przeżyciu i wiernej replikacji chromosomów, a w
efekcie i komórkom w których się znajdują.
Sekwencje telomerowe zlokalizowane w terminalnych odcinkach ramion chromosomów są szczególnym
rodzajem tandemowo ułożonych sekwencji. Sekwencje te zawierają kopie wysoce konserwatywnych,
krótkich (6-7 pz) sekwencji powtórzonych tysiące razy, o motywie TTTAGGG. Końce telomerowego DNA
mają wystający fragment 3’ bogaty w guaninę, który tworzy kompleksy wewnątrz i międzyniciowe,
stabilizowane przez zasady A-C lub G-A, a więc niezgodnie z modelem budowy DNA Watsona – Cricka.

„Ciąg krańcowej nudy”

•

telomery wszystkich zwierząt, pierwotniaków, Neurospora
(TTAGGG)n (tysiące razy)

•

telomery u roślin

4

Genetyka 2012

TTTAGGG

•

orzęski (ich kod najbardziej odległy od uniwersalnego)
TTTTGGGG lub TTGGGG

W Los Almos w 1991 r. sklonowano ludzki telomer i wyznaczono jego sekwencję nukleotydową. Wykryto,
że telomer:

•

zawiera stabilną ewolucyjnie repetytywną sekwencję (TTAGGG)n niosącą informacje krytyczną dla
utrzymania chromosomów jako integralnych całości i ich funkcjonowania

•

nie zawiera informacji o sekwencjach aminokwasowych białka

•

zapobiega skracaniu się chromosomów w replikacji

•

zapobiega rozpadaniu chromosomu i jego degradacji

•

jest strażnikiem chroniącym końce chromosomu przed działaniem enzymów

•

powstał długo przed pojawieniem się dinozaurów

•

najprawdopodobniej odpowiada za starzenie się i śmierć komórki

Długość telomerów jest genetycznie uwarunkowana i jest dziedziczna. Każdy gatunek ma charakterystyczną
średnią liczbę powtórzeń. U Tetrahymena (orzęski) telomer zawiera średnio 70 powtórzeń, u człowieka
2000. Dobór naturalny nadał naszym telomerom taką długość (od ok. 7 tys. „liter” DNA do ok. 10 tys.) aby
mogły przetrwać co najwyżej 75-90 lat używania i napraw. Indywidualne różnice długości życia między
ludźmi mogą mieć źródło w różnicy w długości telomerów.

SUBTELOMEROWY DNA

Obszar subtelomerowy ( subtelomerowy DNA):

•

jest buforem między telomerem a regionami kodującymi białka

•

może służyć do odkrycia markerów związanych z genami odpowiedzialnymi za choroby genetyczne

TELOMERAZA

W 1984 r. odkryta przez Card Greider i Elizabeth Blackburn (,,eliksir wiecznego życia’’, ,,mityczny enzym”
niezwykle trudny do znalezienia w ludzkich komórkach”).
Podobnie jak wszystkie polimerazy i praktycznie rzecz biorąc enzymy, telomeraza zbudowana jest z białka
koniecznego do jej działania. Jest to jednak enzym unikalny – zawiera ponadto pojedyncza cząsteczkę RNA,
która stanowi niezbędną nukleotydową matrycę do budowania podjednostek telomerowych.
Z powodu używania RNA przez telomerazę zaliczono ją do reliktów ,,świata RNA”. Białko TEP1 jest
uderzająco podobne do odwrotnej transkryptazy, enzymu umożliwiającego namnażanie się retrowirusów
wewnątrz genomu. Uważa się że telomeraza jest przodkiem retrowirusów i transpozonów, pierwotnym
,,wynalazcą” transkrypcji RNA na DNA

YAC

(Yeast artificial chromosome)

Pierwszy na świecie sztuczny chromosom został skonstruowany in vitro w 1983 roku i wprowadzony do
komórki drożdży Sacharomyces cerevisiae (n=16). YAC powielał się razem z pozostałymi chromosomami i
przenosił do potomnych komórek geny, które dodano na drodze inżynierii genetycznej.
YAC-i konstruuje się z syntetycznych minichromosomów zawierających drożdżowy centromer (C), miejsce
inicjacji replikacji (RO) i przyłączone telomery (Tl i Tr). Dodatkowo chromosomy te zawierają 3 geny
markerowe ( M1, M2, M3 ), które gdy ulegną ekspresji pozwalają na selekcję komórek niosących sztuczny
chromosom.
Rozcięcie odpowiedniego miejsca restrykcyjnego minichromosomu powoduje powstanie fragmentów
(centryczny i acentryczny), których końce służą do włączenia obcego DNA. Po ligacji powstaje sztuczny
chromosom z jednym krótkim i jednym długim ramieniem. To ostatnie zawiera sklonowany fragment
obcego DNA. W komórkach które zawierają YAC-i z egzogennym DNA markery M1 i M3 ulegają
ekspresji, ale M2 nie, gdyż gen ten zostaje inaktywowany poprzez insercję obcego DNA. W ten sposób
można odróżnić YAC-1 zawierające obcy DNA od ,,pustych”.

5

Genetyka 2012

Obecnie YAC-i używane są głównie do przechowywania dużych (do 2 mln nukleotydów) fragmentów DNA,
pochodzących z organizmów, których genomy są sekwencjonowane głównie w projekcie HUGO (Human
Genome Project) a więc myszy, Drosophila i człowieka. Umiejętności zdobyte przy tworzeniu YAC
wykorzystano do próby stworzenia dodatkowego ludzkiego chromosomu.

HAC

( Human Artifical Chromosome)

Sztuczny ludzki chromosom musi zawierać wszystkie niezbędne elementy, a więc początek replikacji DNA,
telomery, geny i centromer. Sekwencja centromeru może liczyć nawet kilka milionów nukleotydów i jak
dotąd nie udało się skonstruować sztucznie takiej sekwencji, która w zbudowanym in vitro HAC spełniałaby
rolę prawdziwego centromeru. Może to być spowodowane albo występowaniem poza granicami
przewężenia pierwotnego jakiegoś fragmentu sekwencji centromerowej, niezbędnej do jej prawidłowego
funkcjonowania albo też centromerowe sekwencje DNA są zbyt złożone i nie mogą być łączone w całość z
innymi izolowanymi cząsteczkami DNA.

TELOMERAZA A STARZENIE SIĘ LUDZI

„Telomery są jak zakończenia sznurowadeł. Jeśli je gubimy, komórki zaczynają się strzępić. podobnie jak w
przypadku ludzi. Gdy się starzejemy, nasze telomery się zużywają.”

REPLIKACYJNY MODEL STARZENIA SIĘ

Telomery w somatycznych prawidłowych tkankach ludzkich skracają się w miarę starzenia się ludzi. W
komórkach linii płciowej telomery pozostają nienaruszone. Gdy komórki ludzkie które są zdolne do podziału
przestają się rozmnażać czyli wchodzą w stan „starzenia”, zmieniają wygląd i funkcjonują gorzej niż w
młodości, a po pewnym czasie umierają.
Natomiast gdy zmiany genetyczne w okresie przedkryzysowym spowodują pojawienie się telomerazy,
komórki nie do końca stracą swoje telomery. Skrócone telomery uratują się i utrzymają swoją długość przy
kolejnych podziałach. W ten sposób komórki uzyskują nieśmiertelność właściwą komórkom
nowotworowym.
Niektórzy badacze podejrzewają, że utrata zdolności do podziału obserwowana w komórkach ludzkich
pozbawionych telomerazy nie wyewoluowała po to byśmy się starzeli, ale by uchronić nas przed rakiem.

W czerwcu 2004 roku w St. Petersburgu na Florydzie odbyła się 33 już coroczna konferencja naukowa
American Aging Association (Amerykańskiego Towarzystwa Badań nad Starzeniem), jednej z kilku
organizacji promujących wymianę informacji pomiędzy naukowcami, którzy zgłębiają różne aspekty procesu
starzenia i stosują w swych badaniach rozmaite modele doświadczalne: od drożdży piekarskich przez robaki,
gryzonie, ptaki, naczelne i wreszcie Homo sapiens. Ten międzynarodowy przegląd współczesnej wiedzy nad
starzeniem ujawnił kilka zasadniczych trudności, z którymi nauka musi się zmierzyć. Otóż nie istnieje jedna,
podstawowa teoria starzenia, z którą zgadzają się dziś bez zastrzeżeń wszyscy naukowcy. Teorii takich jest
co najmniej kilka, ale najczęściej wymienia się cztery:

1.

Starzenie jest wynikiem kumulacji efektów destrukcyjnej działalności wolnych rodników,
powstających W mitochondriach podczas procesów oddychania komórkowego;

2.

Proces starzenia się i średnia długość życia osobników każdego gatunku zostały zaprogramowane
przez ewolucję i zależą od działania określonych genów;

3.

Zmiany w późnym wieku są wynikiem glikacji białek, czyli nieenzymatycznego procesu przyłączania
reszt cukrowych do cząsteczek białek, co w rezultacie powoduje ich nieprawidłowe funkcjonowanie;

4.

Zmiany starcze biorą się głównie ze zmian w mitochondriach, a nagromadzanie się uszkodzeń
mitochondrialnego DNA wywołuje kaskadę reakcji biochemicznych, prowadzącą do śmierci
komórek i w efekcie do osłabienia wydolności całego organizmu.

TELOMERAZA I RAK

Telomeraza jest kontrolowana przez gen (geny?), którego locus (loci) znajduje się na krótkim ramieniu 3.
ludzkiego chromosomu. Wprowadzenie chromosomu 3. ze zdrową kopią tego genu do hodowli komórek

6

Genetyka 2012

raka spowodowało ich obumarcie (co udowodnił w swoim doświadczeniu Robert Newbold z Brunnel
Univerity w Wielkiej Brytanii). Dzika kopia genu zablokowała produkcje telomerazy, co w konsekwencji
doprowadziło do śmierci komórek nowotworowych. Odkrycie to wskazuje, że telomeraza nie jest
przypadkowym składnikiem komórek nowotworowych, ale musi być elementem procesu kancerogenezy.

W

YKŁAD

2

ORGANIZACJA GENOMU EUKARIOTA

Genom to całkowity DNA komórki obejmujący zarówno geny jak i odcinki międzygenowe.
Genotyp to opis genetycznej zawartości organizmu.
Genom człowieka składa sie z genomu jądrowego (3000 Mb) i genomu mitochondrialnego, w genomie
przechowywana jest informacja genetyczna. Genom jądrowy tworzą liniowe cząsteczki DNA w 22 parach
autosomów oraz chromosomach X i Y.

ORGANIZACJA JĄDROWEGO GENOMU CZŁOWIEKA

1 kb (kilobase pairs) = 10

3

par zasad

1 Mb (Megabase pairs) = 10

6

par zasad

3000 Mb = 3000 • 10

6

= 3 mld par zasad

2100 Mb = 2100 • 10

6

= 2.1 mld par zasad

900 Mb = 900 • 10

6

= 0.9 mld par zasad

5' UTR Untranslated Region (lider)
nie ulegający translacji obszar mRNA powyżej kodonu inicjacyjnego
3' UTR Untranslated Region
nie ulegający translacji obszar mRNA poniżej kodonu terminacyjnego

GENY I SEKWENCJE ZWIĄZANE Z GENAMI

W ujęciu tradycyjnym gen zdefiniowany jest jako locus o konkretnej lokalizacji, która może ulegać
mutacjom przejawiającym się fenotypowo.
Analizy fizyczne (np. sekwencjonowanie) wskazują jednak, że badane regiony chromosomowe zawierają
ponad dwa razy większą liczbę genów, niż wynikałoby to z liczby regionów ulegających przejawiającym się
fenotypowo mutacjom. Zdarza się bowiem, że różne mutacje w obrębie jednego genu mogą współtworzyć
efekt fenotypowy.
Gen jest to region DNA obejmujący jednostkę transkrypcyjną wraz z sekwencjami regulatorowymi.
Taka wizja genu również nie jest zbyt wyraźna w kontekście doniesień o prawdopodobnym istnieniu wielu
genów kodujących małe, regulatorowe RNA, które bezpośrednio oddziałują z transkryptami.
Niewielkim udogodnieniem rozwiązującym część trudności jest ograniczenie zliczanych genów tylko do
tych, które kodują białka. Znana jest jednak możliwość kodowania kilku różnych białek przez pojedynczą
jednostkę transkrypcyjną. Zjawisko to, choć typowe głównie dla prokariotów i wirusów, stwierdzono także u
Caenorhadtis elegant. Niewykluczone zatem, że występuje również u innych eukariontów.
Powszechne i kłopotliwe w obliczaniu genów u wielokomórkowych eukariotów jest alternatywne składanie
(splicing) cząsteczki mRNA, w wyniku którego z jednego typu pierwotnego transkryptu powstają różne
warianty danego białka.

Gen jest to liczba różnych jednostek transkrypcyjnych lub ich części, które mogą ulegać translacji tworząc
jeden polipeptyd albo ich zespół. Zgodnie z tą zasadą ulegający alternatywnemu składaniu transkrypt, który
daje całe i skrócone białko, traktowany jest jako pochodzący z jednego genu.
Podobnie niejasna jest sytuacja z regionami o charakterze regulatorowymi, które w tej konwencji wchodzą
w obręb genów. Powstają one bowiem niezdefiniowane pod względem odległości od sekwencji kodującej
oraz przynależności do innych miejsc wiązania białek regulatorowych oraz metylacji, które utrzymują
lokalną strukturę chromatyny.
Poza tymi wątpliwościami nie wiadomo także, jak traktować nakładające się jednostki transkrypcyjne i geny
występujące w obrębie intronów innych genów (geny intronowe).

7

Genetyka 2012

Definicja genu, nawet pomijając kontekst medyczny coraz mniej przystaje do wielowarstwowej złożoności
mechanizmów genetycznych.

CISTRON

Jest to synonim pojęcia genu jako jednostki funkcjonalnej, wyznaczonej na zasadzie testu komplementacji w
pozycjach cis i trans. Każda para nukleotydów jest jednostką mutacji, a jednostką rekombinacji każde
wiązanie miedzynukleotydowe (fosfodiestrowe) w obrębie genu. Zerwanie wiązań fosfodiestrowych może
nastąpić każdymi dwoma sąsiednimi nukleotydami.
Cistron jest odcinkiem DNA, w którym para mutacji w konfiguracji trans powoduje albo brak określonego
enzymu, albo wytworzenie tego enzymu w formie strukturalnie zmienionej.

TEST CIS-TRANS (TEST KOMPLEMENTACJI)

Jest to test genetyczny pozwalający ustalić, czy dwie mutacje genu m

1

i m

2

zaszły w tej samej jednostce

funkcjonalnej czyli cistronie oraz określić granice danego regionu genetycznego.
Dla przeprowadzenia tego testu porównuje się heterozygoty, w których badane mutacje znajdują się w tym
samym chromosomie (co nazywa się konfiguracją cis) ++/m

1

m

2

z takimi heterozygotami, w których mutacje

te znajdują się na różnych chromosomach (co nazywa się konfiguracją trans) +m

2

/m

1

+.

Dwie mutacje recesywne m

1

i m

2

zalicza się to tego samego cistronu, jeżeli ich konfiguracja trans daje

fenotyp mutanta, zaś konfiguracja cis daje fenotyp normalny. Jeżeli jedna lub obie mutacje są dominujące, to
uważa się, że nalezą do tego samego cistronu, jeżeli fenotyp heterozygoty o konfiguracji cis różni się od
fenotypu heterozygoty z konfiguracją trans. Natomiast jeżeli konfiguracje cis i trans mają identyczny
fenotyp, dowodzi to, że badane mutacje zaszły w różnych cistronach.
Między mutacjami tego samego cistronu może zajść wewnątrzcistronowa komplementacja, w której
niezależne mutacje w tym samym cistronie w położeniu trans mogą dawać normalny fenotyp. Fakt ten
wymaga krytycznego rozpatrywania wyników testu cis-trans.

STRUKTURA GENU

Pod względem molekularnym gen jest regionem DNA, który podlega transkrypcji. W ramach genu
rozumianego jako jednostka transkrypcyjna należy wyróżnić część strukturalną genu, czyli fragment DNA,
w którym zawarta jest informacja genetyczna o produkcie (białko, mRNA, tRNA), oraz sekwencje
regulatorowe, które odpowiadają za uruchomienie transkrypcji.
Część strukturalna genu składa się z eksonów, czyli sekwencji, które po transkrypcji uczestniczą w translacji,
oraz intronów, które są wycinane z pre-mRNA podczas składania RNA (ang. splicing) i nie uczestniczą w
translacji. Oprócz tego z obu stron części strukturalnej (na końcu 5’ i 3’) występują sekwencje oskrzydlające
(untranslated region – UTR) części kodującej pierwszego i ostatniego eksonu. Sekwencje oskrzydlające nie
podlegają translacji.
Część regulatorowa genu obejmuje sekwencje promotora, wzmacniacza (enhancer) i wyciszacza (silencer).
Promotor bezpośrednio poprzedza część strukturalną genu i pełni kluczową rolę w rozpoczęciu transkrypcji.
W obrębie promotora występują dwie sekwencje o szczególnym znaczeniu.
W odległości 30 pz od miejsca inicjacji transkrypcji występuje sekwencja TATA (ang. TATA-box), której
obecność jest niezbędna to przyłączenia polimerazy II RNA. Przyłączenie polimerazy wymaga
równoczesnego powiązania grupy białek (czynniki transkrypcyjne) z promotorem. Sekwencja CAAT
znajduje się około 70-90 pz przed miejscem rozpoczęcia transkrypcji.
Warto wreszcie zwrócić uwagę, że większość genów (około 56%) zawiera w obrębie promotora sekwencje
składającą się z licznych powtórzeń dinukleotydu CG, które są nazywane wysepkami CpG.
Wysepki CpG towarzyszą wszystkim genom ulegającym powszechnej ekspresji tzn. we wszystkich
komórkach. Są to geny pełniące funkcję gospodarza komórki (anp. housekeeping genes), czyli ich ekspresja
jest konieczna do funkcjonowania komórki.
Housekeeping genes kodują białka niezbędne w każdej typowej komórce: histony, elementy cytoszkieletu,
enzymy podstawowego metabolizmu i są czynne przynajmniej okresowo w większości tkanek. Wyspy CpG
występują średnio co 36 kpz, głównie (podobnie jak geny) w cytogenetycznych prążkach R (50% genomu).
Ich liczba w haploidalnym genomie wynosi 45 tysięcy. Wyspy CpG to regiony niemetylowanego DNA,
liczące średnio 1000 pz z wysoką częstotliwością występowania dinukleotydu GC. Ulegają one

8

Genetyka 2012

wzmożonemu trawieniu enzymami restrykcyjnymi specyficznymi dla sekwencji CpG.
Średnia długość ludzkiego genu kodującego białko to 28 tysięcy nukleotydów, na co składa się przeciętnie
8,8 eksonu rozdzielonego przez 7,8 intronu. Sekwencje eksonowe są dość krótkie, zwykle 120 nukleotydów.
Długość intronów to od 100 nukleotydów do 100 tysięcy nukleotydów. Przeciętna transkrypcja ludzkiego
genu daje trzy alternatywne RNA.

EKSOM

Eksom to wszystkie eksony genów oraz przyległe rejony regulatorowe bez intronów i pozagenowego
(śmieciowego) DNA.
Eksony charakterystyczne dla naczelnych, pochodzą z ruchomych elementów genetycznych zwanych
sekwencjami Alu (retrotranspozony). W genomie człowieka znajduje się około 1,4 mln kopii sekwencji Alu.
Wiele z nich nadal się powiela i wstawia w nowe miejsca w genomie z częstością raz na 100-200 urodzeń.
Około 5% alternatywnie składanych eksonów w ludzkim genomie zawiera element Alu. Sekwencje te
gromadzą się głównie z obrębie intronów i są razem z nimi wycinane z pre-mRNA i degradowane.
Niekiedy dochodzi jednak do przemiany utajonej intronowej sekwencji Alu w prawdziwy ekson i wystarczy
do tego zmiana jednego nukleotydu w sekwencji DNA. Ma to miejsce podczas powielania genomu i zajścia
błędu przy przepisywania sekwencji DNA, w wyniku której powstanie miejsce skladania 5` lub 3` w
sekwencji Alu. Włączenie eksonu Alu to dojrzałego mRNA da nowe bialko. Jeśli powstanie również
oryginalny mRNA (Alu jest usuwany z pre-mRNA) to mutacja ta (alternatywne włączenie Alu) będzie
korzystna dla organizmu.

Jesli Alu będzie zawsze włączany do mRNA, a oryginalnego mRNA nie będzie, powstaną zaburzenia
wywołane niewłaściwie wstawionymi sekwencjami Alu: zespół Alporta, zespół Slya, niedobór OAT.

•

zespół Alporta – wrodzona łamliwość kości, spowodowana mutacją w genie prokolagenu COL5A,
sprzężonego z chromosomem X z towarzyszącą zespołowi głuchotą i zapaleniem nerek

•

zespół Sly (MPS VII) – siódmy typ mukopolisacharydoz warunkowany mutacją w genie
β-glukuronidazy, niedobór enzymu powoduje że mukopolisacharydy, które w prawidłowej
przemianie ulegają degradacji gromadzą się w lizosomach. Objawy kliniczne to: karłowaty wzrost,
maszkaronizm (grosteskowy wyraz twarzy), przykurcz kończyn, upośledzenie rozwoju umysłowego,
zniekształcenia w rozwoju palców, rąk, kręgosłupa, płuc i serca

•

OAT (ornithine aminotransferase) – OAT koduje mitochondrialny enzym aminotransferazę
ornitynową, który jest kluczowym enzymem w szlaku przekształcającym argininę i ornitynę w
główne, pobudzające i hamujące neurotransmitery – kwas glutaminowy i GABA. Mutacje , których
rezulatatem jest niedobór tego enzymu powodują autosomalną recesywną chorobę oka (Gyrate
Atrophy)

Obecnie w genomie ludzkim około 500 tysięcy sekwencji Alu leży w obrębie intronów. 25 tysięcy z nich
mogłoby na drodze jednonukleotydowej mutacji przemienić się w eksony. Powstanie nowych białek w
wyniku włączania do mRNA eksonów pochodzących z sekwencji Alu musiało odegrać istotną rolę w
kształtowaniu gatunku ludzkiego.

Stwierdzono, że genom człowieka i orangutana (leśnego człowieka orang hutan) są identyczne w 97%.
Zróżnicowanie genomu orangutana jest dwukrotnie większe niż genomu człowieka. Ewolucja genomu
orangutana jest dużo wolniejsza niż człowieka i szympansa.
Wyjątkowa stabilność genomu tego gatunku w ciągu ostatnich 15 mln lat jest najprawdopodobniej
spowodowana brakiem powtarzających się elementów Alu. sekwencja ta stanowi niewielki procent genomu
człowieka i jej jedyna funkcją jest (według dzisiejszej wiedzy) samo kopiowanie się i rozsyłanie gotowych
kopii po całym genomie co sprzyja mutacjom i generuje genetyczne zmiany.

Sekwencje regulujące typu wzmacniacza i wyciszacza mogą być położone w znacznej odległości od genu,
którego ekspresja znajduje sie pod ich kontrolą, dzięki oddziaływaniu na nie czynników transkrypcyjnych.
Wzmacniacz jest odpowiedzialny za nasilenie transkrypcji genu, a wyciszacz za spowolnienie tego procesu.
Położenie tych sekwencji jest bardo zróżnicowane i może występować przed lub za genem, a nawet w jego
obrębie (w jednym z intronów).
Wielkość genu, a konkretnie jego części strukturalnej, mieści się w bardzo szerokich granicach od kilkuset

9

Genetyka 2012

par nukleotydów (pz) do ponad dwóch milionow pz. Przykładem bardzo małego genu jest gen SRY, który
zawiera tylko jeden ekson, składający sie z 669 nukleotydów. Produktem tego genu jest białko o długości
223 aminokwasów, odpowiedzialne za ukierunkowanie rozwoju niezróżnicowanej gonady płodowej w jądro.

Gigantycznym genem jest ludzki gen DMD kodujący białko dystrofinę, które jest zbudowane z 3685
aminokwasów. Gen ten jest zbudowany z około 2,5 mln pz i w jego skład wchodzi 79 eksonów i 78
intronów, ale tylko 0,6% długości tego genu obejmuje część kodującą. Mutacje w tym genie odpowiedzialne
są za rozwój choroby genetycznej dystrofii mięśniowej Duchenne`a, która prowadzi do zaniku mięśni.

Geny Eukariota są więc genami mozaikowymi tzn., że odcinki kodujące eksony (egzony) są podzielone
odcinkami niekodującymi (intronami), a informacja została zapisana w sposób nieciągły. Odkrycie genów
podzielonych obok teorii podwójnej helisy DNA jest jednym z najważniejszych odkryć w genetyce (Sharp &
Roberts, nagroda Nobla 1993).

Łączna długość intronów często przewyższa długość eksonów w danym genie. Łączenie czyli zestawianie
eksonów jest procesem precyzyjnym, a informacja zapewniająca jej prawidłowy przebieg znajduje się w
intronach. W 1982 roku Thomas R. Cech z University of Colorado stwierdził, że niektóre introny w RNA
mają zdolność do przeprowadzania tych czynności samodzielnie, bez udziału białek. Za to odkrycie otrzymał
nagrodę Nobla w 1990 roku (wspólnie z S. Altmanem).

SYMBOLIKA GENÓW I BIAŁEK

Każdy symbol genu powinien:

•

być krótki, opisowy i unikalny

•

zawierać tylko duże litery alfabetu łacińskiego i cyfry arabskie bez znaków interpunkcyjnych

•

zaczynać się od litery i nie kończyć się na „G”

•

nie zawierać odniesień do gatunku, a więc litery „H” dla ludzkich genów

ludzkie geny

BRCA1

ludzkie białko BRCA1

Inne organizmy:
geny ompF
białko ompF

Uznano trzy wyjątki od zasady nie używania znaków interpunkcyjnych w nazwie genów kodujących.
Dotyczą one symboli dla:

•

ludzkie antygeny zgodności tkankowej HLA (Human Leukocyne Antygen)

•

immunoglobuliny

•

receptory dla limfocytów T

RYBOZYMY

Pod koniec XX wieku Harry Nodler z University of California w Santa Cruz wykazał, że w reakcji tworzenia
wiązania łączącego aminokwasy w łańcuch polipeptydowy (wiązanie peptydowe) nie katalizuje żadne z
prawie 60 białek występujących w rybosomie ale 23S rRNA (u człowieka 28S rRNA).
Udowodniono, że syntetyczny RNA ma aktywność peptydylotransferazy niezbędną do syntezy wiązania
peptydowego w czasie translacji. Był to ostateczny dowód potwierdzający, że 23S rRNA jest rybozymem i
tym samym, że przed światem DNA istniał świat RNA.
Istnieje pogląd, że eksony, które można traktować jako pewne jednostki strukturalne w obrębie genów,
odpowiadają obszarom strukturalnym białka zwanych domenami. Domeny mają charakter funkcjonalny, to
znaczy, że spełniają one w cząsteczce białka określone zadania. Walter Gilbert wystąpił z hipotezą, że w
procesie ewolucji zachodziło łączenie się eksonów w różnych kombinacjach, dzięki czemu powstawały
białka o odmiennym rozmieszczeniu domem i często o nowych funkcjach (tasowanie eksonów).

10

Genetyka 2012

CYTOGENETYCZNA MAPA GENOMU

Omówione prążki są elementami mapy cytogenetycznej genomu, która przedstawia obraz wybarwionych
chromosomów widziany pod mikroskopem. Wzory prążków stanowią podstawę nie tylko do identyfikacji i
klasyfikacji chromosomów. Za ich pomocą można też lokalizować zmiany w chromosomach (delecje,
przegrupowanie, translokacje) towarzyszące różnym chorobom genetycznym.

5 q 11.2 – długie ramię chromosomu 5 pary, 1 region, 1 prążek, 2 podprążek
del(6q)
inv(6p)
del(1)(p12-p22)
[t(9;22)(q34-q11)] – translokacja przy białaczkach

W

YKŁAD

3

NIEKODUJĄCE SEKWENCJE DNA

INTRONY

Istnienie intronów odkryto w 1977 r. podczas pierwszego sekwencjonowania DNA eukariotów. Niektóre z
tych ,,wtrąconych sekwencji’’ (intervening sequences) pozostawały na miejscu przez miliony lat zachowując
swoją pozycję podczas różnicowania się gatunków, inne introny pojawiały się i znikały.

Znanych jest 8 różnych typów intronów

•

introny GU - AG

•

introny AU - AC

•

introny grupy I

•

introny grupy II

•

introny grupy III

•

introny bliźniacze

•

introny pre tRNA

•

introny archebakterii (archeony) - formy znane u prokariotów

Introny GU - AG
Występują w genach eukariontów kodujących białka (pre-mRNA). Stanowią one część dłuższych,
konserwatywnych sekwencji, które znajdują się w miejscach wycinania intronów 5’ i 3’, cechuje je duża
różnorodność.
Miejsca wycięcia po stronie 5’ intronu jest nazywane miejscem donorowym, a miejsce wycięcia po stronie
3’ miejscem akceptorowym. Wycinanie intronów GU-AG jest procesem niezwykle skomplikowanym.

Introny AU – AC
Znalezione w 20 genach roślinnych, Drosophila i człowieka. Mają one konserwatywną ale podlegającą
zmianom sekwencję. Ich wycinanie przebiega podobnie jak wycinanie intronów GU – AG ale bierze w nim
udział odmienny zestaw czynników związanych z tym procesem.

Introny grupy I

Obecnie w genach 26S rRNA i wielu genach mtDNA. Są zdolne do samowycinania się (prawdopodobnie z
udziałem białek). Mają silnie konserwowaną strukturę drugorzędową, zawierają ORF kodującą białko
maturazy, odgrywającą rolę w składaniu RNA.

Introny grupy II
Są obecne w genach mitochondrialnych. Są zdolne do samowycinania się bez udziału białek i ATP. Mają
silnie konserwatywną strukturę drugorzędową.

11

Genetyka 2012

Introny grupy III
Występują w genomach organellowych, podlegają samowycinaniu zgodnie z mechanizmem podobnym do
intronów grupy II (czyli jak u Tetrohymena), ale są od nich mniejsze i mają odrębną strukturę drugorzędową.

Introny bliźniacze (Twintrony)
Skomplikowane struktury utworzone z dwóch lub więcej intronów grupy II i/lub grupy III (jeden intron w
drugim). Są wycinane w określonej kolejności.

Introny archebakterii
Występują w genach tRNA i rRNA. Są wycinane przez rybonukleazę podobną do tej, która bierze udział w
składaniu eukariotycznego tRNA.

POCHODZENIE INTRONÓW

Odnośnie ewolucji intronów istnieją dwie przeciwstawne hipotezy:

•

introny ,,późno”
hipoteza zakładająca, że introny pojawiły się w ewolucji stosunkowo niedawno i następuje ich
stopniowa akumulacja w genomach eukariotycznych.

•

introny ,,wcześnie”
introny według tej hipotezy są bardzo stare i następuje ich stopniowa utrata z genomu
eukariotycznych

Aktualne dowody nie obalają żadnej z hipotez.

Obecnie rozpowszechniony jest pogląd, że właśnie pierwotny zapis był nieciągły i wiele sekwencji się w nim
powtarzało, co u prymitywnych organizmów dysponujących mało sprawnym mechanizmami komórkowymi
mogło zwiększać szansę, że przynajmniej część tej informacji zostanie prawidłowo powielona i przepisana.
W toku dalszej ewolucji i doskonaleniu się aparatu genetycznego taki wielokrotny zapis przestał przynosić
korzyści, a konieczność powielania nadmiaru DNA mogła stwarzać presję selekcyjną powodującą usunięcie
zbędnych sekwencji, co doprowadziło organizmy prokariotyczne do eliminacji intronów i ciasnego
upakowania genów. Pozbycie się wielu zbędnych sekwencji usprawniło funkcjonowanie komórki
prokariotycznej ale jednocześnie zawęziło ich dalsze możliwości ewolucyjne.

ALTERNATYWNE WYCINANIE INTRONÓW

Na matrycy tego samego genu mogą być produkowane nieco odmienne białka. Decyduję o tym wybór
sygnału rozpoczynającego i kończącego transkrypcję oraz sposób wycinania intronów. Przykład stanowi gen
kodujący łańcuchy lekkie miozyny kurczęcia. W tym genie występują dwie sekwencje (TATA)
wyznaczające miejsce przyłączenia polimerazy RNA i rozpoczęcia transkrypcji: jedna w odcinku
poprzedzającym gen, a następna między pierwszym a drugim egzonem.

Jeżeli transkrypcja rozpoczyna się w pierwszej pozycji, to powstanie długi transkrypt heterogennego RNA
(hnRNA), z którego następnie w czasie wycinania intronów zostanie wycięty także drugi i trzeci egzon. Z
takiego mRNA powstaje forma miozyny LC

1

syntetyzowana w mięśniach wczesnego zarodka kury. Jeżeli

transkrypcja rozpocznie się dopiero od drugiej sekwencji TATA, to powstanie krótszy transkrypt hnRNA
pozbawiony pierwszego egzonu, a ponadto w czasie wycinania intronów zostanie wycięty także egzon
czwarty. Z tego mRNA powstanie forma miozyny LC

3

, która jest syntetyzowana dopiero po 14 dniach

rozwoju zarodka. Jeden gen może więc kodować odmienne białka, syntetyzowane w różnym okresie
rozwoju lub w różnych tkankach. Także alternatywne sposoby wycinania intronów zwiększają plastyczność
funkcjonowania genów.
Warto też zwrócić uwagę, że pojęcie egzonu i intronu są względne, gdyż dany egzon może wejść w skład
mRNA lub zostać wycięty razem z sąsiadującymi intronami, stanowiąc wtedy sekwencję niekodującą.

UKIERUNKOWANE PRZEMIESZCZANIE SIĘ INTEINY

Inteina to wewnętrzny segment polipeptydu usuwany w procesie wycinania zachodzącym zaraz po
zakończeniu translacji. Proces ten jest białkową wersją wycinania intronów z pre-RNA. Jednocześnie z

12

Genetyka 2012

usunięciem intein następuje połączenie dwóch zewnętrznych segmentów ekstein. Pierwsze inteiny odkryto u
Sacharomyces cerevisiae w 1990 r.

Selfsplicing (protein splicing) – potranslacyjna obróbka białka polegająca na wycinaniu intein (sekwencje
przerywające w białkach) i łączeniu ekstein co zapewnia białku aktywność.

Inteiny podobnie jak introny grupy I uczestniczą w procesie ukierunkowanego przemieszczania się inteiny
(intein homing). Komórka heterozygotyczna pod względem genu zawierającego inteinę ma jeden allel genu
z inteiną i jeden bez inteiny. Po wycięciu z białka inteiny (specyficznej w stosunku do sekwencji
endonukleazy) przecina ona w odpowiednim miejscu gen nie zawierający inteiny.

Fragment DNA kodujący inteinę może teraz ,,przeskoczyć” w miejsce odpowiadające jej (inteiny) insercji w
genie kodującym bezinteinową wersję białka. Skutkiem tego jest przekształcenie bezinteinowej wersji genu
w wersję zawierającą internę. ,,Homing’’ jest najprawdopodobniej mechanizmem przenoszenia się
samolubnego DNA.

INTEIN HOMING – WYMUSZONA REKOMBINACJA

ENazy

Endodeoksyrybonukeazy typu II są to enzymy bakteryjne służące do cięcia obcego (fagowego) DNA. Nie
tną one sekwencji własnych, ponieważ w sekwencjach rozpoznawanych przez enzym są zmetylowane.
Introny i interny są wektorami dla ENaz. Kodujący ENazy DNA przenosi się horyzontalnie między różnymi
szczepami bakterii.

Istnieją ENazy kodowane przez introny lub inteiny, które przeprowadzają proces ,,homing’’ (ukierunkowane
przemieszczanie się inteiny czyli intein homing lub ukierunkowane przemieszczanie się intronów czyli
intron homing) tj. wymuszaną rekombinację allelu bez intronu z allelem zawierającym intron.
ENaza, która nacina DNA allelu bez intronu jest kluczowym czynnikiem inicjacji procesu „homing”. ENazy
tego typu, umożliwiają niemendlowskie dziedziczenie oraz zajmowanie nowych nisz genomowych przez
,,pasożytnicze” introny oraz inteiny.

GENY INTRONOWE (,,ZAGNIEŻDŻONE GENY’’)

Układ genów w którym jeden (lub więcej) genów znajduje się w intronie innego genu tzw. genu gospodarza.
W większości poznanych przypadków geny te zlokalizowane są na obu niciach DNA i transkrybowane w
odwrotnym kierunku, a w skrajnych przypadkach ich sekwencje kodujące nakładają się.
Geny obecne w intronach genomu jądrowego zlokalizowane są na nici DNA kodującej gen gospodarza, jak i
komplementarnej i mogą być transkrybowane niezależnie. Geny występujące w intronach (klasy I i II)
genów organelli komórkowych obecne są wyłącznie na tej samej nici DNA co ich gen gospodarz i są
kotranskrybowane. Lokalizacja genów intronowych oraz sposób ich transkrypcji wskazuje na ich
prawdopodobną rolę w regulacji ekspresji genu gospodarza.

NERWIAKOWŁÓKNIAKOWATOŚĆ

(CHOROBA RECKLINGHAUSENA)

Cecha autosomalna dominująca z pełną penetracja, ale zmienną ekspresją. Liczne plamy koloru ,,kawy z
mlekiem” we wczesnym dzieciństwie, nerwiakowłókniakowatość począwszy od wieku młodzieńczego,
okolice pachowe upstrzone piegami, nowotwór tęczówki (hamartoma). Liczne powikłania, skolioza, lekkie
upośledzenie umysłowe (10%), drgawki, guzy OUN (5%), przemiana złośliwa w nerwiakowłókniakowatość.
Częstość urodzeniowa 1/3000, 50% przypadków to mutacje de novo. Diagnoza prenatalna niemożliwa.
Gen OMGP jest odpowiedzialny za różnicowanie się komórek podczas rozwoju mózgu a jego transkrypty
obecne są tylko w oligodendrocytach CUN. Brak aktywności genu NF1 (np. w wyniku delecji) prowadzi do
nadaktywności (nadekspresji) intronowych genów genu NF1 odpowiedzialnych w ten sposób za niektóre
objawy chorobowe nerwiakowłókniakowatości. Mutacje w genach EV12A i EV12B są ponadto
odpowiedzialne za powstanie przewlekłej białaczki.

13

Genetyka 2012

Geny CF VIII/F8A, CF VIII/F8B chromosom X
W locus Xq2.8 znaleziono dwa geny F8A I F8B w regionie intronu 22. genu VIII czynnika koagulacji
(krzepnięcia krwi) o nazwie CFVIII (Coagulation factor VIII). Występują one na nici komplementarnej
względem nici DNA kodującej CFVIII.

HIPOTEZY POCHODZENIA GENÓW INTRONOWYCH

Hipoteza 1
Geny intronowe pochodzą z insercji samego genu do intronu genu gospodarza. Przeniesienie genu odbyło się
przez transpozycję (retrotranspozycje) czyli integrację do chrom gospodarza odcinka DNA będącego kopią
transkryptu (mRNA).

Hipoteza 2
Geny intronowe pochodzą z insercji genu wraz z otaczającymi go sekwencjami niekodującymi, co należy
rozumieć jako insercję ,,intronu”, który posiadał już pierwotnie gen do genu gospodarza. Mechanizm
translokacji ,,zagnieżdżonego” genu jest taki sam jak w hipotezie 1, czyli jest to mechanizm
retrotranspozycyjny.

Hipoteza 3
Geny intronowe to geny ,,pochłonięte’’ przez wzrost genu gospodarza w czasie jego ewolucyjnego rozwoju.
Na takie pochodzenie mogą wskazywać geny o rozległej strukturze, kilku alternatywnych miejscach inicjacji
lub/i terminacji transkrypcji. Przykładem genów powstałych według tej hipotezy może być gen NF1.

PSEUDOGENY

Pseudogeny mogą pochodzić albo z defektów powstałych w trakcie ewolucji albo z ekspresji genu jako
nieprawidłowy produkt uboczny. Pierwszy typ – pseudogeny zwykłe, to sekwencje powstałe po inaktywacji
w skutek mutacji, tworzącej kodon stop w obrębie regionu kodującego genu. Geny takie są niefunkcjonalne,
ich białkowe produkty są skrócone: nie pełnią swej biochemicznej funkcji. U człowieka także pseudogeny
obecne są w rodzinach genów globinowych.
Retropseudogeny to sekwencje powstałe w wyniku odwrotnej transkrypcji mRNA pochodzącego z
funkcjonalnego genu. Otrzymamy cDNA (komplementarny DNA) może włączyć się do genomu bądź do
tego samego chromosomu, na którym leży funkcjonalny gen, bądź do innego chromosomu.
Retropseudogeny stanowią kopie jedynie tego regionu genu, który podlega transkrypcji. Brak w nich
sekwencji promotorowej, nie mogą więc ulegać ekspresji. Wyjątek stanowią pseudogeny pochodzące z
genów transkrybowanych przez polimerazę RNA III, które mają promotory wewnętrzne, znajdujące się w
obrębie sekwencji mRNA. Do tej kategorii nalezą elementy Alu. Retropseudogeny nie zawierają też
intronów.

Pseudogeny odkryte pod koniec lat 70 XX wieku są obecnie przedmiotem intensywnych badań
molekularnych w ramach projektu ENCODE, a wstępne wyniki podważają pogląd, że pseudogeny są
całkowicie martwymi reliktami („trupami w naszej genetycznej szafie”), zaśmiecającymi nasze chromosomy
molekularnymi skamieniałościami. Można z nich odczytać ewolucyjną historię współczesnych genów a
przez to lepiej poznać genomową ciemną materię czyli obszary pozagenomowego DNA.

W ramach projektu sekwencjonwania genomu człowieka zidentyfikowano ponad 19 tys. pseudogenów a
dalsze poszukiwania mogą doprowadzić do tego, że ich łączna liczba przekroczy liczbę genów kodujących
białka (21tys na koniec 2004 roku). Głównymi procesami przebudowującymi genomy w czasie ewolucji są
duplikacje i retrotranspozycje i one tez są odpowiedzialne za narodziny pseudogenów: nieobrobionych i
obrobionych.

PSEUDOGENOM

Największa liczba około 2000 obrobionych pseudogenów wywodzi się z rodziny 80 genów człowieka
kodujących białka rybosomalne – na przykład z genu RPL21 pochodzi aż 140 kopii pseudogenowych. Geny
te ulegają silnej ekspresji co daje więcej okazji do narodzin obrobionych pseudogenów.

14

Genetyka 2012

W

YKŁAD

4

SAMOLUBNY (ŚMIECIOWY) DNA

„molekularne śmieci”

•

pseudogeny

•

retropseudogeny

•

satelitarny DNA

•

minisatelity

•

mikrosateLity

•

transpozony

•

retrotranspozony

ROLA NIEKODUJĄCEGO DNA - HIPOTEZY

Stała obecność śmieciowego DNA wynika z „samolubności” DNA – replikuje się on niezależnie od
użyteczności względem gospodarza. Wytrzymanie presji doboru naturalnego wymaga jednak aby choć jego
część była funkcjonalna.

1.

Ochrona genów.

2.

Rezerwuar dla powstania nowych genów.

3.

Regulacja aktywności genów.

Niekodujący DNA stanowi bufor chroniący kodujące elementy przed rozerwaniem i utratą funkcji wskutek
błędów rekombinacji. Istnienie procesu crossing – over umożliwia niektórym fragmentom śmieciowego
DNA spotkanie się i połączenie w nowe, użyteczne kombinacje, w tym sekwencje kodujące białko.
Z badań projektu ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) wynika, że co najmniej 9% genomu
człowieka ulega transkrypcji na RNA. Z tych RNA tylko niewielką proporcję stanowi mRNA, pozostałe
natomiast zaangażowane są w regulację aktywności genów.

Zespół dr Erica Greena z Instytutu Badań nad Ludzkim Genomem porównał pewien śmieciowy fragment
chromosomu 7. człowieka, szympansa, pawiana, kota, psa, krowy, świni, szczura, myszy i trzech gatunków
ryb (fugu, kolcobrzucha i danio pręgowanego). U wszystkich zbadanych organizmów fragment ten był
identyczny, co wyklucza jego istnienie przez przypadek. Eksperyment wspiera pogląd o niezbędności
„molekularnych śmieci”.
Śmieciowy DNA (junk DNA) może odpowiadać za aktywację niektórych genów związanych z rozwojem
zarodkowym. Zakonserwowane od 75 mln lat, 480 całkowicie identyczne fragmenty DNA o długości co
najmniej 200 par zasad, znajdują się w bliskim sąsiedztwie najważniejszych genów sterujących rozwojem
myszy, szczurów i ludzi, co sugeruje, że odgrywają one ważna rolę w regulacji procesu rozwoju
zarodkowego i różnicowania się komórek.

DNA SATELITARNY

Nazwa satelitarnego DNA pochodzi stąd, że jego strukturę nukleotydową bogatą w pary GC, można
oddzielić od innych jądrowych sekwencji DNA genomu na drodze wirowania w gradiencie gęstości.
DNA człowieka po rozbiciu na fragmenty 50-100 kb tworzy prążek główny i trzy prążki satelitarne
(„satelity” prążka głównego). Główny prążek zawiera fragmenty DNA o niepowtarzającej się sekwencji o
składzie zasad GC zbliżonym do 40,3% czyli wartości średniej dla ludzkiego genomu.
Prążki satelitarne zawierają fragmenty powtarzającego się DNA i stąd zawartość zasad GC oraz tzw. gęstość
pławna są nietypowe w stosunku do całego genomu. Satelitarny DNA jest transkrypcyjnie nieaktywny i
zawiera wysoce repetytywne sekwencje (czyli powtarzające się w genomie ponad 20-krotnie).
DNA satelitarny występuje w centromerze i wewnątrz intronów.
Centromer jest utworzony z powtarzających się jednostek o długości 171 par zasad każda. Nazwano je
powtórzeniami DNA alfa.
Centromer jest ostatnim regionem chromosomu, który ma podlegać replikacji i obecność satelitarnego DNA
opóźnia replikację aż do samego końca cyklu komórkowego.

15

Genetyka 2012

Do każdej funkcji centromeru potrzebny jest odcinek powtórzeń alfa. DNA satelitarny odgrywa w
centromerze rolę strukturalną i gwarantuje nieobecność początków replikacji. argumentem przemawiającym
na korzyść strukturalnej roli jest, że jakkolwiek satelitarny DNA jest porozrzucany po genomie to większość
sekwencji jest umiejscowiona w centromerze.
W centromerze znajduje się 7 białek nigdzie poza nim nie występujących w chromosomie. Jedno z nich
CENP-A jest bardzo podobne do histonu H3 i zastępuje go w centromerowym odcinku chromosomu.
Niewielka różnica między CENP-A i H3 nadają specyficzne właściwości centromerowym nukleosomom.
DNA satelitarny występuje często wewnątrz intronów albo w obrzeżach tuż przed lub za genami. Za pomocą
satelitarnego DNA można identyfikować linie genetyczne i ustalać pochodzenie genetyczne. Zmienna liczba
powtórzeń tandemowych (VNTR) w takich sekwencjach sprawia, że nadają się one idealnie do identyfikacji
szczególnych form heterozygotycznych. Zmienność ta jest odbiciem niestabilności mutacyjnej
zlokalizowanej często na jednym z końców ciągu repetywnego. Nasycenie genomu człowieka satelitarnym
DNA (5-10% genomu) czyni z niego doskonały „wykopaliskowy” zapis ewolucji za ostatnie 800 mln lat.

DNA MINISATELITARNE I MIKROSATELITARNE

VNTR – VARIABLE NUMBER OF TANDEM REPEATS SEQUENCES

(zmienna liczna tandemowo powtarzających się sekwencji)

To nazwa najbardziej polimorficznych sekwencji w genomie człowieka, a mianowicie sekwencji mini i
mikrosatelitarnych powtarzających się w genomie jako tandemowo powtórzone zespoły.
Minisatelity to powtórzenia sekwencji o długości od 10 do 25 par zasad. Grupują się w regionach
telomerowych. Są identyfikowane metodą Southerna.
Mikrosatelity (STR ang Short tandem repear, czyli krótkie powtórzenia tandemowe) są powtarzającymi się
jednostkami o długości 1-4 zasad w liczbie powyżej 5000 w genomie człowieka. Obecnie najczęściej
wykorzystywanymi markerami DNA są dinukleotydowe powtórzenia (CA)n ze względu na ich znaczny
polimorfizm i przypadkowe rozmieszczenia.
Przydatne są mono- tri- i tetranukleotydowe mikrosatelity, lecz występują one z mniejszą częstotliwością.
Mikrosatelity są najczęściej identyfikowane w PCR. Wielkość produktu PCR zmienia się z zależności od
liczby powtórzeń zawartych w danym locus.
Biologiczna funkcja minisatelitarnego DNA nie została jak dotychczas wyjaśniona. Z obserwacji wynika, że
sekwencje te występują w regionach chromosomów odpowiedzialnych za tworzenie homologicznych par i
ewentualną rekombinację. Niektóre minisatelity ulegają transkrypcji, lecz nie kodują aminokwasów
cząsteczki białkowej. Uważa się, że mini satelitarny DNA może brać udział w procesach regulacji
transkrypcji genów, określać trwałość transkryptu i wpływać na strukturę chromosomów.
Mikrosatelitarny DNA jest szeroko stosowany w diagnostyce molekularnej chorób człowieka, głównie w
tzw. diagnostyce pośredniej, w której nie identyfikuje się molekularnego podłoża choroby. Dziedziczenie
zmutowanego genu można określić na podstawie dziedziczenia polimorficznego markera jakim jest
mikrosatelita DNA. Dzięki badaniom sekwencji trinukleotydowych zlokalizowano geny, których
uszkodzenie jest przyczyna choroby Hountingtona, dystrofii miotonicznej i zespołu łamliwego chromosomu
X. Są to bowiem choroby genetyczne, w których występuje tzw. mutacja dynamiczna polegająca na
zwiększeniu liczby trzech nukleotydów. Rodziny powtarzających się czteronukleotydów (GATA)n i
(GACA)n wspólne dla wszystkich Eucaryota są szeroko stosowane w medycynie sądowej.
MIkrosatelity są bardziej popularne jako markery DNA niż mini satelity z poniżej wymienionych powodów:

•

są dogodniej, bardziej równomiernie rozmieszczone w genomie (minisatelity bliżej końców
chromosomów)

•

są krótsze niż 300bp (10-30 kopii powtarzalnej sekwencji nie dłuższej niż 4 bp), a to umożliwia
szybsze i dokładniejsze oznaczanie polimorfizmów długości za pomocą reakcji PCR (niż dla długich
sekwencji minisatelitów)

POŚLIZG REPLIKACJI

Poślizg replikacji prawdopodobnie odpowiada też za choroby ekspansji powtórzeń trinukleotydowych,
odkryte niedawno u ludzi. Każde z tych schorzeń neurogeneracyjnych jest spowodowane wydłużaniem
stosunkowo krótkiej serii powtórzeń trinukleotydowych ponad dwukrotną długość.

TREDs (trinucleotide repeat expansion diseases) choroby ekspansji powtórzeń trinukleotydowych.

16

Genetyka 2012

Choroby monogenowe – autosomalne

a)

dominujące:

•

hipercholesterolemia

•

achondroplazja

•

neurofibrotosis (choroba Recklinghausena)

•

osteogenesis imperfecta

•

dystrofia miotoniczna

•

dyzostoza żychwowo – twarzowa

•

choroba Huntingtona

•

choroba Alzheimera

Choroby monogenowe sprzężone płcią

a)

dominujące

•

krzywica hipofosfatemiczna

•

zespół Blocka i Sulzberga

b)

recesywne

•

hemofilia A i B

•

dystrofie mięśniowe

•

agammaglobulinemia

•

X-SCID

•

daltonizm

ANTYCYPACJA

Antycypacja jest to zjawisko nasilania się ciężkości objawów choroby genetycznej w kolejnych pokoleniach.
Jest objawem mutacji dynamicznej („przyrastania genu”) typowej w chorobach o podłożu ekspansji
powtórzeń trinuleotydowych.

MOLEKULARNY PATOMECHANIZM CHORÓB TREDS

Molekularne mechanizmy patogenezy chorób z grupy TREDs są bardzo złożone. Wynika to między innymi
z różnej lokalizacji niestabilnego ciągu powtórzeń w obrębie genu i różnorodności powtarzających motywów
trójnukleotydowych. Istnieje wiele hipotez dotyczących możliwych patomechanizmów powodujących
choroby typu TREDs, jednak można je podzielić na trzy podstawowe grupy.
Pierwsza grupa obejmuje mechanizm patogenezy chorób wywołanych ekspansją powtórzeń CAG w rejonie
kodującym genu, czyli tzw. chorób poliglutaminowych. Obserwuje się tu toksyczny efekt wydłużonych
traktów poliQ w zmutowanych białkach, a ze względu na patogenną, zmienna funkcję komórkową białka
mechanizm ten określany jest jako gain-of-function (nabycie nowych funkcji). Pierwszym etapem
patogenezy poliglutaminopatii jest uformowanie przez wydłużony łańcuch poliq struktury „zamka
polarnego”. Następnym jest trawienie zmutowanego białka przez proteazy komórkowe. Odcięty ciąg
poliglutaminowy jest transportowany z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie wiele takich fragmentów
tworzy agregaty naznaczone następnie ubikwityną. Pojawienie się inkluzji jądrowych poprzedza zwykle
pierwsze objawy choroby.
Do drugiej grupy mechanizmów nazwanych loss-of-fuction a reprezentowanych przez zespół łamliwego
chromosomu X i ataksję Friedreicha, zaliczyć można transkrypcyjne wyciszanie (anp. silencing) genu FMRI
w rejonie 5’UTR genu oraz zakłócenie transkrypcji w przypadku genu X-25 prowadzącego do braku
białkowego produktu lub zredukowania jego poziomu w komórce.
Ostatnia grupa hipotez obejmuje mechanizm patogenezy RNA opisany szczegółowo dla dystrofii
miotonicznej typu I (DM1). Patomechanizm DM1 polega na tym, że zmutowane powtórzenie CUG w
transkryptach genu DMPK tworzą wydłużone struktury typu hairpin (spinka), które preferencyjnie
konfiskują specyficzne białka wiążące się z dwuniciowym RNA. W efekcie uniemożliwiają wiązanie się
tych białek do innych, swoistych miejsc w cząsteczkach RNA, również zawierających powtórzenia CUG, co
może zaburzać ich funkcje. Takie białka zostały wyizolowane i wykazano ich ko lokalizację z wydłużonymi
transkryptami w postaci agregatów w jądrze komórkowym.

17

Genetyka 2012

Hipotezę o zaburzaniu funkcji innych genów w obecności ekspansji popiera obserwacja zahamowania
eksportu zmutowanych tran skryptów DMPK z jądra komórkowego do cytoplazmy. Kumulacja takich
zmutowanych tran skryptów może wpływać negatywnie na eksport tran skryptów innych genów.
Stabilna struktura typu hairpin powstaje tylko w przypadku wystarczająco długich ciągów powtórzeń, czyli
zawierających patogenną liczbę motywów trójnukleotydowych. U osób zdrowych struktura hairpin albo nie
powstaje wcale albo tworzy się mniej stabilna bądź krótsza. Wpływa to na zdolność takiej struktury do
wiązania specyficznych białek: im dłuższa tym więcej białek może skonfiskować.

PATOGENEZA TREDS INDUKOWANA PRZEZ RNA

Ciągi powtórzeń tri nukleotydowych ulegające ekspansjom z patologicznym efektem klinicznym
zlokalizowane w regionach genów, które nie ulegają translacji, prowadzą do wniosku, że czynnikiem
wywołującym chorobę (DMD, BMD, zespół drżenia i ataksji związanego z łamliwym chromosomem X) nie
może być wadliwie funkcjonujące białko, gdyż pozostaje ono normalne.
Tworzenie przez patologiczne, wydłużone ciągi powtórzeń struktury „spinki do włosów” pozwoliło na
wysunięcie hipotezy, że struktura ta inicjuje proces patogenezy.
Struktura RNA tego samego typu może współuczestniczyć w patogenezie innych chorób tej grupy, również
tych, w których genach ciągi powtórzeń ulegają translacji do zmutowanych białek. Zmutowane transkrypty
uważane za komórkowych „oprawców” indukują proces patogenezy, a ich „ofiarami” są ine RNA
zawierające takie same lecz krótsze sekwencje powtarzające się, które mają problem z pełnie niem swej
normalnej funkcji w komórce.
Struktury typu spinki, występują w transkryptach zmutowanych genów, powodujących dystrofię
miotoniczną typu A (DMD), HD i jedną z ataksji rdzeniowo – móżdżkowych, są fragmentowane przez
enzym Dicer, a te fragmenty mogą wchodzić w szlak interferencji RNA i degradować transkrypty
zawierające długie sekwencje komplementarne.
Sekwencje powtórzone mogą więc uczestniczyć w zjawisku interferencji RNA co jest całkowicie nowym
przykładem aktywności komórkowej maszynerii interferencji RNA.
Naukowcy z Uniwersytetu Florydy opisali (w P.A.N.S. ze stycznia 2008 r.) udaną próbę wyleczenia z
miotonicznej dystrofii mięśniowej myszy. Chorym na dystrofię gryzoniom wstrzyknięto domięśniowo białko
Mbln na nośniku wirusowym. Po 23 tygodniach myszy całkowicie odzyskały władzę w mięśniach. Ponieważ
większość chorych na dystrofię ludzi umiera na serce z powodu jego osłabienia, planuje się podanie białka
Mbln wprost do krwioobiegu aby na zastrzyku zyskały wszystkie mięśnie.

CHOROBA HUNTINGTONA

(PLĄSAWICA HUNTINGTONA = CHOROBA ŚW. WITA)

•

pierwsza ludzka choroba genetyczna dziedziczona autosomalnie dominująco

•

choroba której nie determinuje żaden czynnik poza genetycznym (przekleństwo Terezjasza)

•

występuje w niej antycypacja objawów klinicznych

•

penetracja objawów zależna jest od wieku

•

imprinting genomowy wpływa na czas pojawienia się choroby

•

w patogenezie choroby realizują się wszystkie znane hipotezy indukowania TREDs: nabycie nowej
funkcji, utrata funkcji, a także udział RNA

•

żaden chory nigdy nie został wyleczony

Pląsawica Huntingtona (opisana przez lekarza z Ohio G. Huntingtona w 1872 roku dla pewnej rodziny z
Long Island w stanie Nowy Jork) nazywana też chorobą Huntingtona (HD) lub tańcem św. Wita jest
dziedziczną chorobą autosomalną dominującą (dziedziczność 50%) prowadzącą do zniedołężnienia i
otępienia w średnim wieku (35-40 lat). Chorzy na HD mają zwielokrotnioną sekwencję trójki nukleotydów
CAG w obrębie genu huntigtyna, co prowadzi do powstania zmienionej postaci białka huntigtyny
zawierającej kilkadziesiąt powtórzeń glutaminy. Zmutowane białko huntigtyny jest toksyczne dla
najważniejszych Komorek nerwowych OUN. Nie pobudza również genów kodujących wytwarzanie
niezbędnych czynników wzrostu neuronów. Większość pacjentów umiera z powodu powikłań sercowo –
naczyniowych i płucnych (wskutek unieruchomienia w łóżku) lub z powodu urazów głowy, podczas
częstych upadków.
Typowym objawem choroby jest występowanie mimowolnych ruchów pląsowiczych przypominających
taniec (ustających w czasie snu), które początkowo obejmują tylko ograniczone grupy mięśni, a później

18

Genetyka 2012

prowadzą do stałego niepokoju ruchowego chorego. Jest to wynik uszkodzenia komórek nerwowych w
ośrodkach mózgu ogrywających ważna rolę w kontroli ruchów i napięcia mięśni a mianowicie w jądrze
ogoniastym i w skorupie oraz uszkodzenie neuronów gałki bladej. Atrofia dotyczy również kory mózgowej.
W 90% przypadków choroba rozpoczyna się pomiędzy 35 i 40 rokiem życia, pozostałe 10% przypadków to
tzw. forma młodzieńcza z której objawy są ostrzejsze i pojawiają się przed 20. rokiem życia.

W

YKŁAD

5

RUCHOME ELEMENTY GENETYCZNE

Genomy większości gatunków są zasypane wędrującymi kawałkami DNA, znanymi jako elementy
transpozycyjne (transposible elements TE), elementy ruchome (mobile elements) lub „skaczące geny”.
Stanowią one kwintesencję „samolubnych” (pasożytniczych) elementów wewnątrz komórki. Mają tendencję
indukowania mutacji w genomie gospodarza i stanowią dla niego obciążenie związane z ich utrzymaniem co
skutkuje konfliktem interesów.

Pierwszym genetykiem, który docenił dynamikę genomu, była Barbara McClintock (nagroda Nobla 1983).
W 1947 roku podczas badań nad krzyżowaniem kukurydzy w Cold Spring Harbor Labolatory, McClintock
zaobserwowała dziwne sposoby dziedziczenia barwników warstwy aleuronowej ziarniaków kukurydzy,
których nie można było wytłumaczyć za pomocą standardowych reguł. Doszła do wniosku, że kilka genów
nie miało stałych miejsc na chromosomach. Wydawały się one „skakać” z miejsca na miejsce, oraz
występować gdzie indziej u rodziców i gdzie indziej u potomstwa. Stresy środowiskowe, na przykład ciepło,
powodowały częstsze przemieszczanie się tych genów.

SKACZĄCE GENY

Wpływ mutacji i rewersji na kolor ziarniaków kukurydzy

•

dziki typ ziarniaka ma aktywny locus C, który powoduje syntezę purpurowego pigmentu

•

locus C jest zmutowany, co uniemożliwia syntezę pigmentu i powoduje, że ziarniaki są bezbarwne

•

wskutek rewersji mutacji w genie C została przywrócona synteza pigmentu. Ponieważ rewersja ta
dotyczy tylko niektórych komórek, zabarwienie ziarniaka nie jest jednolite, ale składa się z bardzo
licznych plam. Ich liczba koresponduje z liczbą komórek w których zaszła rewersja w genie C

Molekularny mechanizm mutacji i rewersji i zabarwienia ziarniaków kukurydzy

•

dziki typ kukurydzy ma nieprzerwany, aktywny locus C (blue), który powoduje syntezę
purpurowego barwnika.

•

element Ds (red) jest insertowany do genu C inaktywując go i uniemożliwiając syntezę barwnika
ziarniaków, przez co są one bezbarwne

•

Ac (green) jest obecny w genomie tak jak Ds. Obecność Ac umożliwia Ds „wyskoczyć”
(wytranspozonować się) z genu C, powodując jego rewersję do formy dzikiej. To „wyskoczenie” ma
miejsce w bardzo licznych komórkach, co umożliwia im syntezę pigmentu. Te grupy
pigmentowanych komórek są odpowiedzialne za powstanie purpurowych plam na ziarniaku.

Elementy Ac „Activator” i Ds „Dissociation” zostały dokładnie zbadane przez Ninę Fedoroff i
współpracowników. Ac ma długość 4500 par zasad, jest oflankowany przez krótkie odwrócone powtórzenia
i zawiera transpozonowy gen. Różne formy Ds pochodzą z Ac jako efekt delecji w Ac. Ds jest „skaczącym
genem”, ale nie ma genu transpozonowego, Ac zawiera gen transpozycyjny i jest autonomicznym
transpozonem. Posiadanie lub brak genu transpozonowego odróżnia Ac i Ds i wyjaśnia dlaczego Ds jest
niezdolny do transpozycji sam z siebie. Ac może transpozonować sam i inaktywować geny bez pomocy za
strony innych elementów. Ds może transpozonować („skakać”), ale tylko z pomocą Ac.

Schemat struktury elementów transpozycyjnych Ac i Ds.
Ac 4500 par zasad zawiera transpozonowy gen (purple) i dwa odwrócone końcowe powtórzenia (blue).

•

Ds-a brakuje regionu o długości 194 par zasad wydeletowanego z genu transpozonowego. Jest
prawie identyczny z Ac

•

Ds-b ma wydeletowany duzo większy segment z Ac

19

Genetyka 2012

•

Ds-c nie wykazuje żadnego podobieństwa do Ac z wyjątkiem końcowych, odwróconych powtórzeń.

Mutacja powodująca powstanie bezbarwnych ziarniaków jest bardzo niestabilna. Rewertuje ona z szybkością
dużo większą, niż moglibyśmy oczekiwać w przypadku zwykłej mutacji.
Ruchome elementy u eukariotów i prokariotów można podzielić na trzy kategorie, zależne od mechanizmu
ich transpozycji:

•

transpozony DNA, które przenoszą się replikatywnie ( oryginalny transpozon powstaje na miejscu ,
a jego nowa kopia pojawia się w innym miejscu w genomie = transpozycja replikacyjna),
powszechna u prokariotów

•

transpozony DNA, które przenoszą się konserwatywnie (oryginalny transpozon przenosi się na nowe
miejsce w procesie wycięcia i wklejania = transpozycja konserwatywna), występują u prokariotów.

•

retroelementy, które przenoszą się za pośrednictwem kopii RNA (retrotranspozycja)
rozpowszechnione u eukariotów. W odróżnieniu od retrowirusów retrotranspozony nie istnieją poza
komórkami, nie są więc infekcyjne. Odkryto je u drożdży, Drosophila i u kilku ssaków.

Pochodzenie transpozonów nadal nie jest jasne, ale uważa się, że wiele z nich to pozostałość wirusów,
których geny zostały na stałe wbudowane do genomu ich gospodarza na drodze odwrotnej transkrypcji.
Niezależnie od sposobu „skakania” potrafią wywierać znaczny wpływ na organizm, w którym się znajdują.
Elementy transpozycyjne są przekazywane pionowo z pokolenia na pokolenie. Jak to udowodniona podczas
analizy genomu człowieka, potrafią tez skakać poziomo między gatunkami (geny bakterii w genomie
ludzkim).
Sugestie, że transpozon mógł mieć jednoznacznie pozytywny wpływ na ewolucję człowieka, zostały
przedstawiaone przez C. Samuelson z University of Michigan. U wielu ssaków trzustka wydziela amylazę,
enzym, który trawi skrobię w pokarmie. U ludzi amylaza wydzielana jest także w ślinie, co prawdopodobnie
zwiększa liczbę pokarmów, które mogą być przez nas spożywane. Samuelson wykazała, że być może
transpozon umożliwił podwójną ekspresję przez zmianę regulacji genu kodującego enzym.
Niektórzy biolodzy spekulują nawet, że transpozony odgrywają znamienną rolę w pochodzeniu gatunków.
Uważa się, że transpozony mogą być częściowo odpowiedzialne za przerywany wzór ewolucji obserwowany
przez paleontologów badających skamieniałości kopalne. Uważa się, że organizmy, które znajdują się w
niedogodnych warunkach środowiska, mogą podlegać stresowi, który przyspiesza tempo skakania genów.
Może to zwiększać częstość mutacji i przyspieszać ewolucję.
Daje to dodatkową przesłankę dla uznania ich za czynniki zmian ewolucyjnych. Zmiany, które powodują
ruchome elementy genetyczne to nagłe, znaczne zmiany w fenotypie w krótkim czasie, czyli makromutacje.
Daje to w efekcie znacznie większe przyspieszenie procesów ewolucyjnych, niż ma to miejsce dla
stopniowego, powolnego nagromadzenia się mutacji punktowych podlegających działaniu selekcji
darwinowskiej.
Odkrycie, że organizacja genomu jest płynna, to jedno z największych osiągnięć genetyki molekularnej, tym
bardziej godne uwagi, że rearanżacje sekwencji DNA zachodzą bardzo rzadko (10

-8

/ pokolenie bakterii). W

dużym stopniu postęp naszej wiedzy na ten temat wynika z doświadczeń łączących precyzję genetyki
molekularnej z wysoce wybiórczymi narzędziami klasycznej analizy genetycznej, które pozwoliły na
obserwację tych rzadkich zdarzeń.

RETROTRANSPOZONY

LINE (long interpresed nuclear elements = długie rozproszone elementy jądrowe) – zawierają gen odwrotnej
transkryptazy, prawdopodobnie biorący udział w procesie transpozycji. Przykładem może być ludzki
element LINE-1 o długości 6,1 kb (6000 p.z.), występujący w liczbie 3500 kopii elementów pełnej długości i
kilkuset tysięcy kopii niepełnej długości (razem około 15% całego ludzkiego genomu). Samokopiowanie się
jest – jak się wydaje – jego jedyną funkcją. Swoje kopie LINE -1 „rozsyła” po całym genomie.
SINE (short interpresed nuclear elements = krótkie rozproszone geny jądrowe) – ulegają transpozycji
„pożyczając” odwrotną transkryptazę syntezowaną przez inne retroelementy (nie mają genu odwrotnej
transkryptazy). Najbardziej rozpowszechnionym elementem SINE w ludzkim genomie jest Alu (milion
kopii, 10% genomu). Typowa sekwencja Alu przypomina prawdziwy gen kodujący 7SL RNA (rybosom), od
którego pochodzi.

Związek pomiędzy strukturą genu 7SL RNA a sekwensjami Alu u naczelnych
Regiony homologii sekwencji pomiędzy genem 7SL RNA a elementem Alu

20

Genetyka 2012

•

Nietranskrybowany region 5’ wzmacniający transpozycję za pomocą polimerazy RNA III

•

Elementy promotorowe dla polimerazy RNA III

•

Obszar kodujący domenę 7SL RNA odpowiedzialna za rozpoznawanie sygnału i translokację.

Sekwencja Alu składa się z dwóch podobnych, lecz nie identycznych „monomerów” przedzielonych
łącznikiem bogatym w pary reszty adeniny. Na końcu elementu Alu znajduje się również sekwencja poli-A o
różnej długości.

Pierwszy element Alu mógł powstać poprzez przypadkową odwrotną transkrypcję cząsteczki 7SL RNA i
włączanie kopii DNA do genomu. Alu ma wewnętrzny promotor (w „pośrodku” sekwencji), podlega
aktywnej transkrypcji, funkcja jego RNA wytwarzanego w dużej ilości nie jest znana, ale stwarza liczne
okazje do namnażania elementu. Alu występują tylko u naczelnych (oprócz orangutanów).

KLINICZNE IMPLIKACJE SPOWODOWANE PRZEZ ALU

W 1991 roku Fransis S. Collins i jego współpracownicy wykryli u pacjenta mutację wywołującą
nerwiakowłókniakowatość, chorobę powodującą powstanie nowotworu. Gen, który normalnie reguluje
wzrost komórek, został zinaktywowany przez wbudowanie często występującego elementu genetycznego
zwanego Alu.
W lipcu 2005 roku zespół Ereva Y. Levanono poinformował o odkryciu dotyczącym edytowania A w I
(adenozynę w inozynę), w którym sekwencja RNA ulega zmianom w bardzo specyficznych regionach.
Edytowanie transkryptów RNA metodą A w I u ludzi jest o dwa rzędy wielkości powszechniejsze niż się
początkowo wydawało. W przewarzającej części edytowanie zachodzi w sekwencjach Alu, a szczególnie
intensywnie w mózgu. Nieprawidłowy przebieg tego edytowania wiązany jest z całą gamą schorzeń, w tym
padaczką i depresją.

GENETYCZNA RÓŻNORODNOŚĆ CZŁOWIEKA

Genetyczną różnorodność człowieka, można opisać korzystając z polimorfizmów powszechnych we
wszystkich ludzkich populacjach, ale z określoną częstością. Bardzo użytecznym polimorfizmem dla
zbadania ludzkiej, genetycznej różnorodności jest sekwencja Alu. Alu od czasu do czasu ulega replikacji, a
nowopowstałe kopie losowo wbudowują się w pierwotnym lub innym chromosomie, nie występując –
zazwyczaj – na funkcjonowanie pobliskich genów.
Każde takie włączenie sekwencji Alu do genomu jest niepowtarzalne. Tak więc jeśli u dwóch osób
sekwencja Alu występuje dokładnie w tym samym miejscu w genomie to znaczy, że miały one wspólnego
przodka po którym odziedziczyły ten konkretny odcinek DNA.
Badania dowiodły, że żaden polimorfizm nie pozwala sam w sobie na odróżnienie wszystkich członków
jakiejkolwiek grupy ludzkiej od wszystkich członków innej grupy. Dopiero analiza setek polimorfizmów
daje możliwość pogrupowania ludzi z różnych regionów geograficznych według profili genetycznych. I tak
60 polimorfizmów Alu wystarcza, aby z dokładnością 90% określić, z którego kontynentu pochodzi dana
osoba. Uzyskanie pewności bliskiej 100% wymaga zastosowania około 100 Alu.
Analiza profilu genetycznego różnych ludzkich populacji pozwoliła odpowiedzieć twierdząco na pytanie:
czy na podstawie informacji genetycznej można wyróżnić grupy ludzi o wspólnym dziedzictwie i przypisać
do nich konkretne osoby. Jednocześnie zaprzeczono ścisłej korelacji między tak uzyskanymi grupami a
wyodrębnionymi a priori (uprzednio) rasami.
Potwierdzono choć z zastrzeżeniami, że podział na rasy ze względu na podobieństwo genetyczne może być
wykorzystany w praktycznym leczeniu chorób u członków poszczególnych grup i stosowaniu środków
farmakologicznych. Medyczne implikacje genetycznego zróżnicowania związanego z rasą są jednak kwestią
dyskusyjną.

GENETYCZNI INTRYGANCI

•

gen nakrapiania Dt (dotted) z kukurydzy (elementy Ac/Ds)

•

element P u Drosophila

•

michael jordan

•

mariner

•

gipsy

21

Genetyka 2012

•

gen koloru płatków Anthirrium majus (lwia paszcza)

•

gen pomarszczonych nasion grochu Pisum sativum

•

sleeping beauty (śpiąca królewna)

Mariner (żeglarz) – retrotranspozon DNA 1250 p.z. odkryty w gatunków Drosophila , a obecnie u wielu
zwierząt i u człowieka
Gipsy (cygan) – retrotranspozon Ty3/gipsy u drożdży i Drosophila
Element P – transpozon DNA u Drosophila melonogaster przeniesiony poziomo z Dr. Willistoni.
Skaczący gen (transpozon) – został wyizolowany z glonu Volvox (toczek) w Washington University os St.
Louis. Nazwano go Michael Jordan. Gen ten przeskakuje pomiędzy chromosomami komórek kolonii po
zadziałaniu niska temperaturą. Obecnie Jordan używany jest jako znacznik do izolacji innych genów.
Sleeping beauty (śpiąca królewna) – ruchomy element genetyczny w łososiu, wprowadzony in vitro do
hodowli ludzkich komórek, gdzie wykazuje zdolność wycinania się i wklejania, intensywnie się tym samym
namnażając. Odkrywca sleeping beauty (1997) Zoltan Ivics „wskrzesił” też inny transpozon
Harbinger3_DR, od dawna nieistniejący prekursor przynajmniej dwóch współczesnych ludzkich genów
(HARBI 1 i NAIF 1).
Harbinger3_DR (w stanie szczątkowym u człowieka) przetrwał i nadal działa w innych organizmach na
przykład w Danio rerio (Danio pręgowane), wykazując niezwykłą specyficzność procesu wstawiania swoich
kopii w genomie, zawsze w regionie zawierającym pewną konkretną sekwencje DNA.

Dzięki użyciu specjalnych sekwencji docelowych udało się naprowadzić transpozon na konkretne docelowe
miejsce integracji. Sleeping Beauty za mniej więcej 5 lat (według Ivicsa) będzie gotowy do przeprowadzenia
klinicznej próby terapii genowej (dane z końca 2008 roku). Oprócz skierowania transpozonu do konkretnego
celu (z dala od ważnych genów), do opanowania pozostał problem ich przenoszenia się wewnątrz ludzkiego
genomu.

W lutym 2009 roku Adras Nagy z Mount Sinai Hospital w Toronto (Kanada) ogłosił, że znalazł inne
rozwiązanie dla przekształcenia dorosłych komórek w komórki, które funkcjonalnie nie różnią się od
macierzystych komórek (ES) pozyskiwanych z ludzkich zarodków.
Wraz ze współpracownikiem wprowadził cztery niezbędne geny do ludzkich i mysich komórek za pomocą
transpozonu. Wektor ten nie spowoduje żadnych zmian nowotworowych (co zagrażało komórce ze strony
nośników wirusowych) i może zostać łatwo usunięty za pomocą enzymu transpozazy.
Komórki dojrzałe przekształciły się w pluripotentne po 20 dniach i zachowały swoje funkcje nawet po
usunięciu czterech wprowadzonych genów. Wydajność w zaprezentowanej metodzie była znacznie wyższa
niż w japońskiej a uzyskany ekwiwalent komórek ES nie budził kontrowersji etycznych.

W

YKŁAD

6

REGULACJA EKSPRESJI GENÓW U EUCARYOTA

Regulacja ekspresji genów u Eucaryota nie jest w pełni poznana i nie istnieje jej jeden główny model. U
Eucaryota nie występują operony, a regulacja ekspresji genów może zachodzić na różnych etapach.

Regulacja Ekspresji genu eukaryotycznego

•

sterowanie szybkością i wydajnością transkrypcji – enhancery i silencery

•

alternatywne wycinanie intronów

•

obróbka potranskrypcyjna – splicing, edyting

•

amplifikacja genu dla produkcji dużej liczby niektórych cząsteczek mRNA (450 kopii rDNA na 1
komórkę)

•

sterowanie stabilnością mRNA (czasem funkcjonowania mRNA, a więc liczbą zsyntezowanych
cząsteczek białka)

Do genetycznych przełączników należą enhacery i czynniki transkrypcyjne białka, które wiążą się z DNA w
zależności od jego sekwencji, rozpoznając między innymi sekwencje wzmacniające. Połączenie czynnik
transkrypcyjny – enhacer przesądza o włączeniu lub wyłączeniu genu. Jedna z nich polega na trudności w

22

Genetyka 2012

zlokalizowaniu ludzkich enhacerów w bezmiarze niekodujących regionów DNA. poszukuje się sekwencji,
które są stabilne w ewolucji, co odróżnia je od prawdziwych molekularnych śmieci.

W 2008 roku zespoły badawcze między innymi z J. Craig Venter Institute w Rockville w Meryland USA
znalazły 5000 wspólnych dla ludzi i rekinów obszarów w niekodującym DNA, leżącym głównie w pobliżu
genów, które wydają się być enhacerami. Ludzi i rekiny dzieli 500 milionów lat ewolucji.

Regulacja funkcji genu u Eucaryota

•

regulacja na poziomie matrycy DNA

−

regulacja poprzez zmianę struktury chromatyny

−

regulacja na drodze metylacji i demetylacji DNA

•

regulacja na poziomie transkrypcji

•

regulacja na poziomie translacji

•

regulacja poprzez hormony

•

regulacja morfogenezy

•

transformacja nowotworowa

•

regulacja przez interferony

•

regulacja przez stres

•

regulacja neuro-immuno-endokrynna

INTERFERONY

Są to glikoproteiny, które można w zasadzie uznać za hormony peptydowe. Wyróżnia się IFN alfa
produkowany przez leukocyty, IFN beta produkowany przez fibroblasty i IFN gamma produkowany przez
limfocyty T. Mają działanie cytostatyczne i antywirusowe. Mają zdolność hamowania wzrostu komórek i
podziałów komórkowych.


Po zbadaniu genomów różnych organizmów w tym człowieka, poczyniono dwie zadziwiające obserwacje –
po pierwsze stwierdzono brak wyraźnej zależności między liczbą genów kodujących białka w danym
gatunku a stopniem jego złożoności (liczba genów ryżu przewyższa liczbę genów człowieka, a muszka
owocowa ma ich mniej niż robaki obłe). Drugim był wniosek, że ilość niekodującego DNA zdaje się
odpowiadać skali złożoności organizmu (u człowieka sekwencje kodujące to około 2%, a reszta to
niekodujący DNA). W ostatnich latach uwaga licznych badaczy skupiła się na badaniu sekwencji
kodujących jedynie RNA (a nie białka) zlokalizowanych zarówno w obrębie genów jak i między nimi.
Sekwencje te zaliczane były w dotychczasowej terminologii do molekularnych śmieci, nieistotnych w
przekazywaniu informacji genetycznej. Ponowne nimi zainteresowanie wynika z co najmniej dwóch
powodów. Pierwszym jest ewolucyjna stabilność. Dlaczego ewolucja miałaby konserwować coś co jest
zbędne? Musi być jakaś przyczyna dla której w każdej ludzkiej komórce znajdują się 3 miliardy
nonsensownych par zasad. Drugi powód to opisanie zjawisk które są niewytłumaczalne w ramach
obowiązującego dogmatu przechowywania i przekazywania informacji genetycznej, czyli z genów na białka.

UKRYTE GENY

Już pod koniec XX wieku sugerowano, że jest wysoce prawdopodobne istnienie dużego zbioru genów, które
ewidentnie są funkcjonalne, choć nie kodują żadnych białek. Geny te są odpowiedzialne jedynie za
powstanie RNA. Wyniki szeregu doświadczeń, które potwierdziły istnienie takich „ukrytych”
niekonwencjonalnych genów wymogły dokonania korekty pojęcia „gen”. Proponuje się używania zamiast
terminu „gen” pojęcia „jednostka transkrypcyjna”, która oznacza odcinek DNA przepisywany na RNA.

Sekwencje transkrypcyjne:

geny kodujące białko = konwencjonalne; normalne; prawdziwe; białkowe

geny ukryte = nie kodujące białka; niekonwencjonalne

Jednak już dziś wiemy, że RNA produkowany na bazie „ukrytych niekodujących genów” pełni funkcję
kontrolną jako mikroRNA, przełącznik RNA, cenzoruje także strukturę chromosomów oraz nadzoruje

23

Genetyka 2012

modyfikacje na poziomie informacji epigenetycznej zawartej w genomie. Analogowy RNA, który zwija się
w złożone struktury – jak robią to białka – jest też niezbędny dla działania enzymów chroniących
chromosomy. Towarzyszy także białkom sygnałowym transportowanym na zewnątrz komórki. Pozwala to
na sformułowanie tezy, że istnieje możliwość równoległego przekazywania informacji genetycznej pod
postacią cząsteczek samego RNA. Tym samym pogląd o małym (lub żadnym) znaczeniu intronów może
zostać uznany jako jedna z największych pomyłek w biologii molekularnej.

NOWA FORMA REGULACJI EKSPRESJI GENÓW BAZUJĄCA NA RNA

RYBOPRZEŁĄCZNIKI

Ryboprzełaczniki to fragmenty liderowej części mRNA nieopisującej budowy białka, które mogą regulować
ekspresję kodowanego przez siebie białka, decydując, czy niesiona przez nie informacja zostanie
wykorzystana do translacji, czy też zostanie zniszczona, zanim dotrze do rybosomu. Decyzja zapada (w
ciągu kilku sekund) na podstawie oceny zapotrzebowania komórki na białko, której dokonują dzięki
zdolności wiązania docelowego metabolitu i reagowania na to zmianą struktury przestrzennej.
Znane ryboprzełączniki zawierają dwa moduły (domeny): aptamerowy i ekspresyjny. Aptamer (aptamus w
znaczeniu pasujący, dopasowany) służy jako złożony receptor, rozpoznający konkretny, niskocząsteczkowy
metabolit. Jest to silnie konserwowana przez ewolucję część mRNA, której struktura jest wspólna dla
rybpoprzełączników pochodzących z organizmów bardzo ewolucyjnie odległych. Moduł ekspresyjny (lub
platforma ekspresyjna) zawiera sekwencje zmieniające swoją strukturę przestrzenną (struktura spinki do
włosów) i wpływające przez to na ekspresję informacji genetycznej (decydując o losie mRNA). Niekiedy
między aptamerem a platformą ekspresyjną znajdują się sekwencje, które na krótko zatrzymują polimerazę
RNA podczas transkrypcji genu. W tym czasie aptamer sprawdza obecność metabolitu i stosownie zmienia
strukturę modułu ekspresyjnego.
Znane ryboprzełączniki tworzą 12 klas, z których tylko jedną znaleziono u organizmów wielokomórkowych,
a pozostałe, jak się wydaje – występują wyłącznie u bakterii. Są one reliktami świata RNA i wspierają tezę o
nim, jako o pierwszym etapie powstawania życia na Ziemi. Samonadzorowanie się transkryptów niektórych
genów odświeżyło fascynację rybozynami, stanowiąc jednocześnie inspirację do ich wykorzystania w
ramach między innymi terapii genowej. Przełączniki RNA są bardzo starymi konserwowanymi przez
ewolucję sekwencjami. Znaleziono je (zespół Breakera) w międzygenowym DNA we wszystkich obecnie
wyróżnionych pięciu królestwach organizmów żywych. Świadczy to o tym, że istniały już u ostatniego
wspólnego przodka a więc wkrótce po rozpoczęciu się ewolucji.

WYCISZANIE – NEGATYWNA REGULACJIA EKSPRESJI GENÓW

GENETYCZNY NOKAUT

Techniką „odwrotną” do transgenizacji jest „nokaut” („knockout”). Polega ona na precyzyjnym wycięciu
określonego genu, bez naruszania pozostałych. W żargonie genetyków metoda ta nazwana jest metodą
„zepsuj i zobacz co się stanie”.
Nokaut wyłącza dany gen w całym organizmie od najwcześniejszych momentów jego istnienia. Ponieważ
zdecydowana większość (wszystkie?) genów jest wykorzystywana wiele razy i dotyczy różnych funkcji
organizmu. Transgeniczna mysz ze znokautowanym genem w jednej trzeciej przypadków obumiera we
wczesnym stadium zarodka. Technika nokautu stworzona przez Mario Cappechiego wykorzystuje
mechanizm rekombinacji homologicznej w somatycznych komórkach tzw. zarodkowych komórkach
pierwotnych (ES = Embrionic Stem Cells – macierzyste komórki zarodkowe) pozyskiwanych z embrionów
mysich.
Nokautowanie oryginalnego genu polega na skonstruowaniu sztucznego odcinka DNA i podmienieniu za
jego pomocą interesującego nas genu w zarodkowych komórkach pierwotnych. Sztuczny DNA ma jedynie
końce do złudzenia przypominające oryginalny gen, ale jego środek jest genetycznie pusty. Jeśli zajdzie
homologiczna rekombinacja między genem pochodzącym od jednego z rodziców a sztucznym genem
(„atrapą”), to po zmieszaniu zarodkowych komórek macierzystych ze znokautowanym genem z komórkami
niezmienionymi powstanie zarodek ze znokautowanym genem. Mysz, która rozwinie się z takiego zarodka
będzie transgeniczna myszą ze znokautowanym genem, precyzyjnie „wyciętym”.

24

Genetyka 2012

CELOWANE WYŁĄCZANIE GENU

GENE TARGETING (=KNOCKOUT) ROZBICIE GENU

Technikę tę stosuje się w badaniach, których celem jest wyłączenie funkcji endogennego genu. procedurą
rozbicia genu inaczej knockout genowy, stosuje się w połączeniu z metodą genetycznej modyfikacji
komórek ES. DNA badanego genu po wstawieniu do niego fragmentu obcej sekwencji jest wprowadzane do
komórek ES. Odpowiednio dobrane metody selekcji pozwalają na wprowadzenie do blastocysty tylko tych
komórek ES w których doszło do zastąpienia endogennego genu przez zmutowany trans gen na drodze
homologicznej rekombinacji. Komórki w których miała miejsce niehomologiczna rekombinacja nie są
użyteczne w dalszej procedurze. Osobniki otrzymane tą techniką są chimerami genetycznymi.
Znokautowane myszy homozygotyczne uzyskuje się w wyniku odpowiednio dobranych krzyżówek
genetycznych.
Nobel za stworzenie techniki nokautu genowego („gene targeting”) czyli celowanie genowego w myśl
zasady „zepsuj i zobacz co się stanie”.
Zastosowane techniki transgenizacji i nokautu zaowocowało ważnymi odkryciami w immunologii i
onkologii. Słynna transgeniczna mysz z Harvardu została nawet opatentowana. Jest to homozygota z
uszkodzeniem genu kodującym białko p53 (Tp53). Gen p53 (Tp53) pełni funkcję „strażnika genomu” nie
dopuszczając do ontogenezy. Jego uszkodzenie, jak dowiodła transgeniczna mysz, powoduje rozwój
licznych nowotworów.

Na początku 2007 roku uruchomiono KOMP – Knockout Mouse Project do zbadania mysich genów,
realizowany przez amerykańsko-europejskie konsorcjum, które stworzy zarodki myszy każdy z wyłączonym
(znokautowanym) jednym określonym genem. Z zarodków zostaną wyprowadzone linie zarodkowych
komórek macierzystych dla celów biomedycznych. Projekt pozwoli określić funkcję wszystkich genów
(około 20 tysięcy) myszy domowej Mus musculus wykorzystywanej w laboratoriach.

RNAi

W 1990 roku Jorgensen (Univesity of Arizona) i Mol (University Amsterdam) wprowadzili do komórek
fioletowo kwitnących petunii dodatkowe kopie genu warunkującego barwę kwiatów celem
zintensyfikowania ich barwy. Otrzymano petunie z białymi plamami na płatkach, niekiedy tak dużymi, że
kwiaty wyglądały jak albinosy. Badacze wywnioskowali, że dodatkowe kopie genu zahamowały ekspresję
genów determinujących barwę płatków, także genów determinujących barwę płatków, także genów
naturalnie występujących w komórce. Zjawisko to – czyli hamowanie jednocześnie aktywności trans genów
i genów własnych nazwano kosupresją. Zjawisko kosupresji wykryto u grzybów, muszki owocowej,
tytoniu, nicienia, glonów, a także ssaków. Przełomowym doświadczeniem, które pomogło w rozwiązaniu
zagadki kosupresji był eksperyment na nicieniu wykonany w 1998 roku w Carnegie Institution of
Washongton i University of Massachusetts Medical -School. Do komórek nicienia wprowadzono zarówno
jedno- jak i dwuniciowy RNA produkowany z genu unc-22, istotnemu w funkcjonowaniu mięśni.
Jednoniciowe RNA – zarówno sensowne jak i antysensowne wywarło niewielki wpływ na nicienia (co
obserwowano już wcześniej, ale nie potrafiono wytłumaczyć). Obecność nawet kilku cząsteczek
dwunicieniowego RNA powodowała – zarówno u robaków jaki i w ich potomstwie – niekontrolowane
drgawki, świadczące o tym, że zakłócona jest ekspresja genu unc-22. Taki sam efekt – wyciszenia
aktywności genu – otrzymano zarówno dla genów reporterowych (czyli takich, których aktywność po
wprowadzeniu do komórki można łatwo sprawdzić) jak i genów kodujących białka mięśniowe,
decydujących o płodności i żywotności organizmu. Fire i Mello nazwali wykryte zjawisko interferencją
RNA, aby podkreślić kluczową rolę dwuniciowego RNA w cenzurowaniu aktywności genów.
Na terenie komórki podwójny może być tylko DNA. RNA jest zawsze jednoniciowy, chyba, że pochodzi od
wirusa lub innego „wroga”, którego trzeba zniszczyć. Dwuniciowy RNA (dsRNA) zawsze niepokoi
komórkę. Musi istnieć specjalna sekwencja, która uniemożliwia przekształcenie jednoniciowego RNA
(ssRNA) w dsRNA. Wyciszanie tej sekwencji prowadzi do kosupresji (wyciszania potranskrypcyjnego
PTGS).
Mechanizm cenzury genów powstał prawdopodobnie około miliarda lat temu, już wtedy zabezpieczając
organizmy przed wirusami i ruchomymi elementami genetycznymi. Interferencja RNA zachodzi także w
komórkach człowieka i innych ssaków. Sposób działania RNAi w komórkach ssaków opisali na podstawie
swoich prac m. in. Thomas Tuschl, Zamore, Hennon.

25

Genetyka 2012

Na podstawie ich prac można założyć, że RNAi działa w następujący sposób: wewnątrz komórki
dwuniciowy RNA, pochodzący z ruchomych, samokopiujących się elementów genetycznych, wirusów lub
nieprawidłowych genów, napotyka na enzym Dicer, który w procesie hydrolizy tnie RNA na fragmenty
zwane siRNA czyli małe interferujące RNA (lub mikro-RNA) o długości 22 nukleotydów. Enzym tnie każdą
z dwóch nici RNA w innym miejscu (asymetrycznie) dlatego powstający z niego siRNA ma na każdym
końcu dwa wystające nukleotydy. Nici siRNA zostają rozplątane, a następnie jedna z nich jest przyłączana
do kompleksu białkowego. Powstaje w ten sposób tzw. kompleks wyciszający indukowany przez RNA
(RISC).
RISC wyłapuje następnie cząsteczki mRNA, ale tylko te – spośród tysięcy które na niego wpadają – które są
idealnie (lub prawie idealnie) komplementarne do sekwencji siRNA. Takie komplementarne do siRNA
mRNA jest następnie cięte przez enzym Slicer na dwie części. Kompleks RISC uwalnia obydwa fragmenty,
które nie są już zdolne do pokierowania syntezą białka, powracają do formy gotowej do dalszego działania
czyli do wychwytywania dwuniciowego RNA pochodzącego od „wroga” do identyfikacji groźnych mRNA.
Jeśli natomiast dwie nici czyli mRNA i siRNA są tylko częściowo komplementarne, wtedy RISC pozostaje
złączony z mRNA, rybosom jest unieruchomiony na mRNA i białko także nie powstaje.

W

YKŁAD

7

GENY STERUJĄCE ROZWOJEM

Funkcją genów sterujących rozwojem jest genetyczna kontrola morfogenezy

GENY PROGRAMU ROZWOJU

•

geny polarności jaja (egg polarity genes)

•

geny segmentacji I,II,III

I – geny przerwy (gap genes)
II - geny parzystości, reguła par (pair rule genes)
III – geny polarności segmentów (segment polarity genes)

•

geny homeotyczne (homeobox genes)

Geny programu rozwoju mają charakter kompleksowy i hierarchiczny układ. Rolę nadrzędną w tej hierarchii
odgrywają geny odpowiedzialne za wyznaczenie podstawowych osi formującego się zarodka, a mianowicie
oś przednio-tylną oraz grzbieto-brzuszną. Geny te rozpoczynają swoje działanie jeszcze przed
zapłodnieniem.
Ulegają one transkrypcji w komórkach odżywczych znajdujących sie w jajniku, a powstały mRNA
transportowany jest do oocytu i tam magazynowany na jego biegunach. Dzięki temu jajo jeszcze przed
zapłodnieniem ma wyznaczoną polarność. Geny za to odpowiedzialne nazywają się genami polarności jaja.
Kolejną grupą genów są geny odpowiedzialne za produkcje białek regulatorowych orientujących zarodek
wzdłuż osi przednio-tylnej oraz zgodnie z symetrią grzbietowo-brzuszną. Są to geny dla morfogenów.
Morfogeny pełnią rolę czynników transkrypcyjnych i dzięki nim poszczególne struktury zarodka powstają w
odpowiednich dla nich miejscach. Uruchamiają więc one procesy kształtotwórcze.
Morfogeny – są to białka pełniące różnorodne funkcje biochemiczne mogące przekazywać informację
pozycyjną.

Najniższe piętro w hierarchii genów regulatorowych sterujących rozwojem zarodka stanowią geny
homeotyczne. Stanowią one strukturalny i funkcjonalny, sprzężony system o liniowym uporządkowaniu na
chromosomie. Liniowy układ tych genów ściśle odzwierciedla liniowy układ warunkowanych przez nie
segmentów na osi ciała.

Nagrodę Nobla z fizjologii i medycyny w 1995 roku przyznano trojgu uczonym Niemce Christiane
nuesslein-Volhard i Maerykanom Ericowi F. Wieschausowi oraz Edwardowi B. Lewisowi. W komunikacie
dla prasy przedstawiającym laureatów napisano, ze nagrodzono ich za odkrycia dotyczące kontroli
genetycznej wczesnego rozwoju zarodka oraz, iż troje uczonych odtworzyło nowa drogę, która powinna
przyczynić się do wyjaśnienia zagadki powstawania wad wrodzonych u człowieka.

26

Genetyka 2012

KASKADA CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH

Hierarchiczna Struktura informacji genetycznej

Rozwój Drosophila melanogaster od wczesnego zarodka do postaci dorosłej.
Choć Drosophila pod niektórymi względami jest dość niezwykła w swej organizacji embrionalnej, to jednak
mechanizmy genetyczne za pomocą których definiuje swój plan budowy ciała są podobne do odpowiednich
mechanizmów u innych organizmów z człowiekiem włącznie, dzięki czemu nastąpił znaczący postęp badań
nad niektórymi aspektami ludzkiego rozwoju, będących poza możliwościami analizy naukowej przed
odkryciem procesów zachodzących w rozwijającym się zarodku Drosophila melanogaster.
Zarodek Drosophila stanowi syncytium czyli cytoplazmę z wieloma jadrami. Liczba jąder wrasta od 128 w
1.25 godziny życia zarodka do 1500 jąder w 2 godziny. Jadra wędrują do peryferyjnej części zarodka i po
kolejnych 30 minutach zaczynają tworzyć komórki (wymiary 2,5 godzinnego zarodka to 500 µm długości i
170 µm średnicy), które stanowią warstwę blastodermy. Zanim zostanie ukończone jej tworzenie pojawia się
informacja o podstawowych osiach zarodka: osi przednio-tylnej i osi grzbietowo brzusznej.

Informacja zawarta jest w gradientach stężenia białek, które ustalają się w syncytium. Białka te podlegają
translacji z cząsteczek mRNA, które przedostają się do zarodka z komórek matczynych i dlatego geny je
kodujące nazwano genami matczynymi. W ustalaniu osi przednio-tylnej zaangażowane są białka Bicoid,
Hunchback, Nanos i Caudal. mRNA kodujące Bicoid i Nanos jest wprowadzane do dwóch końców
niezapłodnionego jaja. Koniec, w którym stężenie białka Bicoid będzie największe będzie przednim końcem
jaja, a na końcu tylnym największe będzie stężenie białka Nanos.
Skierowanie mRNA bicoid i mRNA nanos do konkretnego końca niezapłodnionego jaja jest możliwe dzięki
zdefiniowaniu pozycji jaja w komórce jajowej. mRNA hunchback i mRNA caudal zostają równomiernie
rozmieszczone w cytoplazmie i dla ich białek gradient tworzy się w wyniku działania białek Bicoid i Nanos.
Na samym skraju przednim i tylnym akumuluje się białko Torso, również produkty matczynego genu torso.
Gradient białka Dorsal wyznacza oś grzbietowo-brzuszną. Po ustaleniu się gradientów każde miejsce w
syncytium ma własną charakterystykę chemiczną. Gradienty są pierwszym stadium tworzenia się wzoru
segmentacji. Rozwój zarodka zmierza więc do wytworzenia młodej larwy z prawidłowym wzorem
segmentacji.
Białka Bicoid, Hunchback i Caudal sa czynnikami transkrypcyjnymi aktywującymi transkrypcję genów gap
(genów luki) w jądrach wewnątrz zarodka. Geny te uściślają poprzez swoje białkowe produkty pozycyjną
informację w zarodku. Względne stężenie produktów genów gap aktywuje transkrypcję genów parzystości
(pair rule genes), których białka pozostają w komórce, w której powstały i precyzyjniej definiują
segmentację ciała zarodka. Zarodek jest serią „pasków”, w których komórkach zachodzi ekspresja kolejnych
genów nazwanych genami polarności segmentów.

Po zakończeniu działania genów segmentacji wzór segmentacji jest wyraziście zdefiniowany. Tożsamość
poszczególnych segmentów określona jest przez kolejne geny tzw. geny homeotyczne (homeotic selector
genes). Ulegają one ekspresji w określonych segmentach w odpowiedzi na informację o położeniu
dostarczoną przez rozmieszczenie genów gap i parzystości. Produkty genów homeotycznych są czynnikami
transkrypcyjnymi włączającymi zestaw genów niezbędnych do różnicowania się danego segmentu.
Geny homeotyczne są najlepiej poznanym przykładem ewolucji genów przez duplikację. Drosophila ma
pojedynczy zestaw genów homeotycznych HOM-C składający się z 8 genów, które powstały wskutek
duplikacji genu istniejącego około 1 mld lat temu. Kręgowce mają cztery grupy genów HOX w których
można rozpoznać kopie grupy genów Drosophila. Mogły one powstać albo w wyniku duplikacji grupy
genów Drosophila albo wskutek duplikacji genomu.

GENY HOMEOTYCZNE

Główne geny homeotyczne (homeotic genes lub hommeotic selektor genes) występują w prawym ramieniu
trzeciego chromosomu w postaci dwóch kompleksów genów sprzężonych.
Kompleks Anennapedia (ANT-C) wyznacza różnice między segmentem głowowym a trzema segmentami
tułowia, natomiast kompleks bithorax (BX-C) różnice między segmentami tułowia a odwłoka. Oba
kompleksy zostały sklonowane i zbadano ich ekspresję. Rozpoczyna się ona bezpośrednio przed
celularyzacją blastodermy i początkowo jest dość rozległa, tworząc zachodzące na siebie strefy.
Geny homeotyczne Hox są utrzymywane w stanie wyciszenia. Po ustaniu wyciszenia przez czynniki
transkrypcyjne inicjują ten proces w komórkach embrionalnych przez białka należące do grupy Polycomb

27

Genetyka 2012

(PcG). Wykryto je u Drosophila melanogaster w 2002 roku, gdzie tworzą trzy kompleksy, a obecnie
zidentyfikowano też u kręgowców i roślin (2007 rok).
Wang (2004 rok) ze współpracownikami opracował model represji transkrypcji genu homeotycznego Ubx z
udziałem białek PcG. W wyciszaniu Ubx ma miejsce między innymi metyzacja lizyny K27 histonu H3 oraz
ubikwitynacja histonu H2A.
W komórkach ssaków białko PcG wyciszają alternatywne programy genetyczne które w danym typie
komórek nie mają być realizowane. Regulują one także proces różnicowania się komórek i zachowują
właściwości komórek macierzystych. Białka PCG uczestniczą też w inaktywacji chromosomu X u samic
ssaków i w imprintingu genomowym.

HOMEOBOKS

Wszystkie geny homeotyczne oraz większość innych uczestniczących w rozwoju (m. in. także geny
polarności jaja) zawierają charakterystyczną sekwencję 180 nukleotydów noszącą nazwę homeoboksu.
Koduje ona sześćdziesięcioaminokwasową domenę białkową nazwaną odpowiednio homeodomeną, złożoną
z trzech fragmentów o specjalnej strukturze (tzw. „helks-skręt-heliks”) umożliwiającej jej bezpośrednie
wiązanie ze specyficznymi sekwencjami DNA. Pełni ona rolę czynnika transkrypcyjnego. Inne geny
kierujące rozwojem zawierają takie sekwencje kodujące domeny zdolne do specyficznego wiązania się z
DNA (np. tzw. „palce cynkowe”)
Odkrycie sekwencji homeoboksu w genach kierujących rozwojem Drosophila melanogaster od razu
nasunęło przypuszczenia, że sekwencja ta może odgrywać rolę także u innych organizmów. Posługując się tą
sekwencją jako sondę do hybrydyzacji DNA banków genomowych różnych zwierząt, stwierdzono obecność
homeoboksu w genach wielu bardzo odległych od siebie ewolucyjnych grup m.in. u nicienia, u pierścienic,
jeżowców, prymitywnych stawonogów i kręgowców (w tym u żaby, kury, myszy i człowieka). W wielu
przypadkach wykazano że ekspresja genów z homeoboksem występuje już we wczesnym okresie
zarodkowym i ma specyficzną lokalizację, co wskazuje na ich udział w wyznaczaniu planu budowy
organizmu. Sekwencja homeoboksu występuje więc w genach kierujących rozwojem zarówno u zwierząt
bezkręgowych jak i u kręgowców.
Geny zawierające homeoboks zostały dość dobrze zbadane u człowieka i u myszy u których nazwano je
genami Hox. U obu tych gatunków zidentyfikowano już około 30 różnych genów Hox, które występują w 4
grupach sprzężeń jako kompleksy HOX.

W genomie człowieka wykryto 38 genów homeotycznych. Tworzą one 4 grupy genów, których loci znajdują
się na różnych chromosomach:

•

grupa HOX-1 w chromosomie 7

•

grupa HOX-2 w chromosomie 17

•

grupa HOX-3 w chromosomie 12

•

grupa HOX-4 w chromosomie 2

Geny zajmujące tę samą pozycję w różnych kompleksach są bardziej do siebie podobne niż geny
sąsiadujące w jednym kompleksie. Homologia tych genów dotyczy głównie sekwencji, która koduje
homeodomenę, a zwłaszcza jej fragment składający się z 12 aminokwasów, biorących bezpośredni udział w
wiązaniu homeodomeny z DNA.

Geny usytuowane najbliżej końca 5' decydują o rozmieszczeniu narządów położonych najbardziej ku tyłowi.
Zwłaszcza przednia (w kierunku od głowy do ogona) granica ekspresji poszczególnych genów Hox w
układzie nerwowym oraz w odcinkach sklerotomu (zaczątki kręgów) zarodka myszy jest bardzo wyraźna i
odpowiada kolejności tych genów w chromosomie.

Na podstawie dotychczasowych danych można sprecyzować następujące wnioski:

•

przednia granica ekspresji genu (na przednio-tylnej osi ciała) zależy od jego pozycji w kompleksie

•

geny wykazujące ekspresję w tym samym regionie pochodzą z tej samej podrodziny

•

prototyp sekwencji homeoboksu wywodzi się od przodka żyjącego przed rozdzieleniem się królestw
roślin, zwierząt i grzybów, czyli jeszcze przed ewolucją organizmów wielokomórkowych (600-1000
mln lat temu).

Ponieważ we wszystkich przypadkach chodzi o geny wyznaczające dalsze losy komórek, można stąd
wysunąć wniosek, że rozwój wielokomórkowca jest regulowany za pomocą modyfikacji mechanizmów
które decydują o losach komórek także u jednokomórkowców. Jednak tylko u zwierząt geny z sekwencją

28

Genetyka 2012

homeoboksu występują w formie kompleksu genów sprzężonych, których kolejność ułożenia w
chromosomie koreluje z wzorem ich ekspresji komórkowej wzdłuż osi przednio-tylnej organizmu
(kolinearność).
Współliniowa ekspresja genów Hox odpowiada sekwencji czasowej. Włączanie każdego z genów Hox
włącza następny gen w układzie liniowym. Ponieważ ewolucyjny rozwój zwierząt polegał na wydłużaniu
tylnego końca (a nie części głowowej), więc geny Hox powtarzają pradawną sekwencję ewolucyjna zgodnie
ze słynnym sformułowaniem Ernsta Haeckla: „ontogeneza powtarza filogenezę”. Rozwój zarodka zachodzi
w tej samej kolejności co ewolucja jego przodków.

Podobieństwo między genami Hox jest tak duże, że można znokautowac gen w muszce, zastąpić go
odpowiednim ludzkim genem i wyhodować normalną muszkę. Technikę tę nazwano genetycznym
ratunkiem. Ludzkie geny Hox mogą też uratować swój muszy odpowiednik jak to ma miejsce w genach Otx
i Emx oraz genie wytworzenia oczu.

Gen eyeless (bezoki) jest tak nazwany ponieważ muchom które go nie mają, brakuje oczu. Po usunięciu
eyeless i zastąpieniu go odpowiednikiem pochodzącym z myszy, u muchy powstają całkiem normalne oczy.
Jest to szczególnie niezwykłe ponieważ owady mają oczy złożone, a ssaki proste. Gen zdaje się mówić
„utwórz oko takie, jakie byś zwykle stworzył” a inne konstrukcje określają jaki typ jest odpowiedni dla
gatunku.

Istnienie tak wielkiego podobieństwa w rozwoju zarodkowym odkrytego przez genetyków molekularnych
bardzo dobrze koresponduje z zapisem paleontologicznym, w którym prawie wszystkie zwierzęta pojawiają
się nagle, jakby już gotowe ok. 545 mln lat temu w najstarszym kambrze (eksplozja kambryjska). Fakty te
wspierają ogłoszony już w 1835 (1822) roku i uważany wówczas za metafizykę pogląd francuskiego
przyrodnika Etienne'a Geoffroya Saint-Hilaire'a:

„Filozoficznie mówiąc musimy stwierdzić ze jedno istnieje tylko zwierzę, mniej lub bardziej głęboko
zmodyfikowane w każdej ze swych części”. Wyśmiewany przez 175 lat pogląd o jedności wśród zwierząt
potwierdziło odkrycie genów homeotycznych, ostatecznie dezawuując pogląd o niezależnym
wyewoluowaniu królestwa kręgowców i bezkręgowców.

Właściwości genów kompleksu HOM/HOX

•

kontrolują specyfikę regionalna wzdłuż osi przód-tył

•

mutacje tych genów powodują transformacje homeotyczne (u człowieka znane jako wady wrodzone)

•

kodują czynniki transkrypcyjne z grupy homeodomen

•

są mapowane jako pojedynczy kompleks (u Drosophila). U większości kręgowców są cztery kopie
(u danio siedem)

•

ulegają ekspresji według charakterystycznego wzoru, o ostrej przedniej granicy ekspresji każdego
genu

•

występuje kolinearność kolejności ułożenia genów w chromosomie i kolejności ich aktywacji
przestrzennej wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka. Kolejność ułożenia genów jest ewolucyjnie
konserwatywna

•

dominacja tylna jest mechanizmem regulacyjnym działania genów w obrębie kompleksu HOM

•

aktywność genów jest regulowana przez kwas retinowy.

MUTACJE GENÓW HOMEOTYCZNYCH

„HOMEO” znaczy w języku greckim podobny. Geny homeotyczne to geny mające zdolność upodobniania
w wersji zmutowanej wyglądu jednego segmentu ciała do innego. Mutacje w Antennapedia na przykład
mogą powodować powstawanie rzędów brzusznych ząbków epidermalnych na głowach larw. Innym efektem
tej mutacji bywa powstawanie nóg zamiast czułków u dorosłej muszki.

29

Genetyka 2012

W

YKŁAD

8

EPIGENETYCZNA REGULACJA EKSPRESJI GENÓW

BIOCHEMICZNA MASZYNA DO PRZEKAZYWANIA INFORMACJI GENETYCZNEJ

1.

Informacja z kodu genetycznego (stabilna)

•

geny kodujące białka

•

niekodujący DNA (aktywne RNA)

2.

Informacja epigenetyczna (podlega ciągłym zmianom)

•

metylowanie DNA (imprinting)

•

kod histonowy (chemiczne modyfikacje histonów)

•

stan chromatyny (stopnie kondensacji, konformacja, granica wolna od histonów)

Kod epigenetyczny zawarty z chemicznych oznaczeniach niezapisanych w układzie nukleotydów DNA ma
ogromny wpływ na zdrowie i wygląd organizmu. Tłumaczy on, dlaczego niektóre choroby genetyczne
„przeskakują” pokolenie lub dotykają tylko jedno z bliźniąt jednojajowych, może wyjaśnić jak to możliwe,
że pewne genu są włączone w komórkach nowotworowych a w innych nie, mimo, że nie różnią się one
żadną mutacją.
Zmiany w kodzie epigenetycznym – epimutacje – choć nie zmieniają sekwencji DNA są w niektórych
przypadkach przekazywane potomstwu. Epimutacje odgrywają zasadniczą rolę w procesach wzrostu i
starzenia się organizmu. Liczne choroby w mniejszym lub większym stopniu determinowane genetycznie jak
np. cukrzyca, schizofrenia, choroba afektywna dwubiegunowa, są także najprawdopodobniej przekazywane
epigenetycznie.

DZIEDZICZENIE PONAD GENOMEM

W Duke Univesrity (Durham, Północna Karolina USA) przeprowadzono w lecie 2003 roku eksperyment,
który wykazał ścisły związek między grupami metylowymi i transpozonami.
Ciężarne myszy agouti o szarobrązowym umaszczeniu (genotyp CCAABB) karmione były normalnym
pokarmem. Około 60% ich potomstwa miało żółtą sierść (heterozygoty A

Y

a, letalne w stanie

homozygotycznym A

Y

A

Y

)

Z myszy o genotypie CCAABB (typ dziki) warunkującym szarobrązowe albo rudawoszare ubarwienie
sierści, nie mogą urodzić się myszy o sierści żółtej, które żyją tylko jako heterozygoty A

Y

a (homozygoty

A

Y

A

Y

są letalne).

Inna grupa przyszłych matek – myszy karmiona była paszą wzbogaconą w witaminę B

12

, kwas foliowy i

inne źródła grup metylowych. Około 60% potomstwa miało umaszczenie brunatne przy genotypie Ccaabb.
Myszy o genotypie Ccaabb są zawsze albinosami, gdyż obecność alleli aa hamuje powstanie barwy sierści.
Myszy o sierści brunatnej mają genotyp A_b_ccD_E_.
Myszy o identycznym genie warunkującym zabarwienie sierści agouti mogą być żółte lub brązowe.
Decyduje o tym liczba grup metylowych przenoszonych przez retrotranspozon, który wbudował się w gen
determinujący barwę sierści. Wolne grupy metylowe z pokarmu dołączyły się do różnych genów
wpływających na kolor umaszczenia.
Możliwość dziedziczenia epimutacji została wykryta na czołowym obecnie modelu badań epigenetycznych a
mianowicie myszach AVY (Agouti Viable Yellow).
Przypadki dziedziczenia cech nabytych u myszy udokumentował Prof. Joseph H. Nordeau (Institute for
Systems Biology, Seattle USA). Prześledził ponad 100 różnych cech biochemicznych, fizjologicznych i
behawioralnych, na które ma wpływ epigenetyczna regulacja ekspresji genów. W niektórych wypadkach
zaobserwował przekazywanie zmian w tych cechach nawet przez cztery pokolenia.
W 1999 roku genetycy z University of Sydney w Australii wykryli, że wzór metylacji genu
odpowiedzialnego za kolor sierści myszy AVY jest przechowywany w żeńskich komórkach rozrodczych i
przekazywany potomstwu tak jakby to była mutacja w sekwencji DNA.
Efekt potęgowania się cechy otyłości z pokolenia na pokolenie także obserwowano u myszy AVY.
Domniemuje się, że efekt coraz grubszego potomstwa może zależeć od wzoru metylacji w podwzgórzu,
części mózgu regulującej łaknienie.
Pierwszymi, na swiecie badaniami przedstawiającymi molekularne podstawy dziedziczenia cechy nabytej i
to niezależnie od DNA są badania zespołu kierowanego przez Odeda Rechaviego Z Uniwersytetu

30

Genetyka 2012

Medycznego Columbia w Nowym Jorku („Cell” z grudnia 2011 roku). Badania prowadzone były na nicieniu
Caeborhabditis elegant. Nicień ten walczy z patogenami za pomocą siRNA, które dezaktywują mRNA
powstałe z atakujących go wirusów. Zwalczanie wirusa odbywa się na drodze interferencji RNA (RNAi) za
pomocą cząsteczek viRNA (virus interfering) jak nazwał cząsteczki siRNA dr Rechavi. Odporność na wirusa
była obserwowana w ponad 100 następujących po sobie generacjach, a przekazana została w formie małych,
wyciszających wirusa nośników viRNA działających niezależnie od genomu. W organizmach
niezainfekowanych interferencja RNA nie zachodzi, gdyż nicienie potomne z niezainfekowanej linii nie
miały zdolności wykształcenia odporności na wirusa.

GENETYCZNA DETERMINACJA PRAWIDŁOWEGO ROZWOJU SSAKÓW

Partenogeneza, czyli rozwój niezapłodnionego jaja bez udziału plemnika, jest to szeroko rozpowszechniona
w świecie zwierząt. Zjawisko to, zachodzące spontanicznie lub wywołane sztucznie, prowadzi zwykle do
normalnego rozwoju osobniczego. Jednakże u ssaków nie udało się uzyskać normalnych osobników
urodzonych w wyniku partenogenezy: wprawdzie łatwo pobudzić jajo do podziałów i rozwoju różnymi
czynnikami, jak: szok elektryczny, termiczny lub chemiczny. Jednak zarodki takie nie przeżywają dłużej niż
do połowy okresu płodowego. Przyczynę tych niepowodzeń wyjaśniły badania, polegające na
mikrochirurgicznej wymianie przedjądrzy w zapłodnionym jaju myszy.
Po wniknięciu plemnika do komórki jajowej, jego jądro przekształca się w przedjądrze (pronucleus) męskie,
a jednocześnie z chromosomów jaja powstaje przedjądrze (pronucleus) żeńskie, przy czym przez pewien
czas oba przedjądrza można od siebie odróżnić. W tym stadium usuwano mikropipetką jedno z przedjądrzy a
na to miejsce wprowadzono przedjadrze męskie lub żeńskie uzyskanej od innej zygoty. Tak operowane
zarodki przenoszono do macicy zastępczych matek i analizowano ich rozwój. Wyniki tych doświadczeń były
jednoznaczne: tylko zarodki zawierające zarówno przedjądrze żeńskie jak i męskie rozwijały się normalnie,
pozostałe zamierały zwykle po kilku podziałach. Jeżeli jednak udało im się przeżyć nieco dłużej, to
wykazywały charakterystyczne różnice.
Zarodki gynogenetyczne, czyli powstałe z obu przedjądrzy żeńskich, charakteryzowały się niedorozwojem
struktur pozazarodkowych (trofoblastu), co prawdopodobnie wtórnie powoduje śmierć płodu z powodu
niedożywienia.
Zarodki androgenetyczne, czyli otrzymane z jaj o obu przedjądrzach męskich, miały dobrze rozwinięty
trofoblast, ale upośledzone struktury właściwego zarodka.
Wyniki te świadczyły wyraźnie o tym, że do normalnego rozwoju zarodka ssaka konieczna jest obecność
zarówno genomu żeńskiego, jak i męskiego, z tego wynika z kolei, że genomy rodzicielskie nie są
równowartościowe, lecz muszą być w jakiś sposób naznaczone czy napiętnowane. Zjawisko to określa się,
jako imprinting genomu rodzicielskiego.

IMPRINTING GENOMOWY

Na podstawie dotychczasowych danych można przyjąć, że różnice w genomach rodzicielskich powstają w
czasie gametogenezy jako specyficzne dla linie płciowej modyfikacje DNA w pewnych określonych
odcinkach chromosomów.
Imprinting ten jest przekazywany przez gamety do zygoty, gdzie utrzymuje się przez cały okres rozwoju
zarodkowego, a prawdopodobnie nawet do końca życia, ale tylko w komórkach somatycznych.
Natomiast w komórkach linii płciowej imprinting odziedziczony po rodzicach zostaje w którymś momencie
wymazany, a wprowadzony nowy, którego specyfika zależy od płci.
Molekularny mechanizm imprintingu związany jest z matylacją DNA. Gen podlegający piętnowaniu jest
silnie metylowany, chromatyna ulega znacznemu skondensowaniu i staje się nieaktywna transkrypcyjnie.
Imprinting genomowy jest zatem jednym z mechanizmów regulujących ekspresję genów odpowiedzialnych
nie tylko za rozwój zarodka, ale także za tempo jego postnatalnego wzrostu.

Metylacja wprowadzonego genu w kolejnych pokoleniach myszy transgenicznych zmienia się zależnie od
tego czy został on przekazany przez ojca czy przez matkę (osobniki transgeniczne zaznaczone czarnymi
symbolami. Na elektroforogamie DNA trawionego enzymem restrykcyjnym Hpall sekwencja genu
przekazywana przez ojca jest nie etylowana i występuje w innej frakcji (3,9) niż sekwencja etylowana
przekazywana przez matkę (wg. Hawlett i współpracownicy, 1989 zmodyfikowane).

31

Genetyka 2012

Metylacja DNA należy do epigenetycznych modyfikacji, które wpływają na funkcje komórki przez zmianę
ekspresji związaną z kowalencyjnym przyłączeniem grupy metylowej, katalizowanym przez
metylotransferazę DNA (DNMT) do piątego węgla cytozyny w obrębie sekwencji CpG (wyspy CpG).
W większości wypadków metylacja wysp CpG jest uwarunkowana genetycznie, rzadko zdarza się by była
zdarzeniem losowym związanym z błędem metylazy. Przypadkowe metylacje, które nie zostaną usunięte
przez demetylazę DNA, powodują epigenetyczne zmiany w ekspresji metylowanych genów, stanowiące
obok mutacji w protonkogenach i genach supresorowych jedną z najczęstszych przyczyn powstawania
zespołów chorobowych i nowotworów. W wielu typach nowotworów wykryto nieprawidłowo metylowane
geny supresorowe. Metylacja stanowi obok acetylacji histonów jeden z głównych mechanizmów sterowania
(włączanie i wyłączanie) aktywnością genów.

MOLEKULARNY MECHANIZM ZEZWALAJĄCY NA EKSPRESJĘ GENU

Znaczenie metylacji DNA nie ogranicza się tylko do zachowania i dziedziczenia tkankowej specyficznej
ekspresji genów. Metylacja odgrywa ważną rolę jeszcze przynajmniej w dwóch innych procesach
związanych z regulacją ekspresji genów:

•

dławieniu samolubnego DNA, zwłaszcza transpozonów

•

inaktywacji chromosomu X u ssaków

METYLACJA DNA

(Twyman 1998)

Transpozony i inne sekwencje powtarzające się w wielu genomach są hipermetylowane, prawdopodobnie w
celu zahamowania ekspresji genów związanych z transpozycją, takich jak gen kodujący transpozazę.
Zapobiega to transpozycji ruchomych elementów genetycznych oraz hamuje rekombinację między
sekwencjami powtarzającymi się. Znacznie zmniejsza to prawdopodobieństwo powstania w genomie
uszkodzeń na skutek rearanżacji DNA. Namnażanie się sekwencji transpozonów, które przemieszczając się
w genomie mogą uszkadzać inne geny, przyspiesza jeszcze proces transformacji nowotworowej. Tak więc
metylacja służy do zdławienia skutków działania samolubnego DNA.

TAORIA MARY LYON

(hipoteza powstawania chromatyny i jej związek z chromosomami X)

W około 90% jąder w pełni dojrzałych komórek kobiety, np. w komórkach skóry, nabłonka jamy ustnej,
stwierdzono obecność grudki chromatyny (ciałko Barra, chromatyna płciowa). Jest to jeden z dwóch
chromosomów X, który pozostaje skondensowany. Mężczyźni mają tylko jeden chromosom X i nie może on
być zablokowany genetycznie (nie transkrybować) poprzez kondensację, bo zawiera geny kodujące istotne
dla komórki białka, w tym enzymatyczne. Jednocześnie mimo to, że mężczyźni mają tylko jeden chromosom
X, żyją i rozwijają się normalnie. Aktywność transkrypcyjna każdego genu zlokalizowanego w chromosomie
X u mężczyzn jest więc porównywalna z aktywnością transkrypcyjną dwóch genów warunkujących
powstanie jednej cechy, zlokalizowanych na dwóch chromosomach X u kobiet.
Zablokowanie transkrypcji na jednym z chromosomów X u kobiet poprzez kondensację jest formą regulacji
zapobiegającej nadmiernej ekspresji genów w tych chromosomach.
W komórkach zarodka żeńskiego człowieka około 16 dnia życia płodowego dochodzi do unieczynnienia
jednego z chromosomów X. Chromosom tez staje się heterochromatynowy i uwidacznia się w okresie
interfazy w postaci grudki chromatyny płciowej. Ponieważ komórki potomne żeńskie posiadają jeden
chromosom X od ojca i jeden od matki, to w części komórek zarodka żeńskiego losowo ulega inaktywacji
chromosom X pochodzenia matczynego, a w części chromosom X pochodzenia ojcowskiego.
Niekodujący gen Xist produkuje aktywny RNA, który pokrywa przeznaczony do wyłączenia chromosom.
Drugi chromosom X (który pozostanie aktywny) produkuje antysensowny RNA działający jak antidotum i
chroniący go przed działaniem produktu genu Xlist. Reakcja łańcuchowa postępuje wzdłuż całego
„zbędnego” chromosomu mocno metylując DNA.
Histony gubią grupy acetylowe, co jest konieczne, gdyż grupy te zwykle aktywują pobliskie geny, a
chromatyna w miejscach gdzie one występują jest „otwarta na współpracę” i umożliwia odczytywanie DNA.
Zamiast grup acetylowych podoczepiane są w różnych miejscach ogonów histonowych grupy metylowe. Na
histonach występują też grupy fosforanowe i peptyd ubikwityna. Chromatyna „wyłączonego” chromosomu
staje się zwartą i niedostępną masą pokrytą RNA. Spośród wielu genów ulegających inaktywacji w

32

Genetyka 2012

chromosomie X pewna, bardzo niewielka część pozostaje jednak aktywna. Są to geny posiadające mniej lub
bardziej homologiczne odpowiedniki w chromosomie Y, tzw. geny pseudoautosomalne.

DOWODY POTWIERDZAJĄCE SŁUSZNOŚĆ HIPOTEZY LYON

Każdy nieczynny chromosom X może być widoczny w postaci grudki chromatynowej. U osób z kariotypem
49, XXXXY obecne są trzy grudki chromatyny.
W chromosomie płci X zawarte są między innymi geny odpowiedzialne za syntezę dehydrogenazy glukozo-
6-fosforanowej. Homozygotyczna kobieta powinna teoretycznie wytwarzać dwa razy więcej tego enzymu
niż mężczyzna posiadający jeden chromosom X. Produkowanie takich samych ilości enzymu u obojga płci
dowodzi inaktywacji jednego chromosomu X. (kompensacja dawki)
U kobiet posiadających dwie populacje czynnych chromosomów, pochodzących od ojca – X-paternal (Xpat)
i od matki – X-maternal (Xmat) nie ujawniają się cechy recesywne sprzężone z chromosomem X.
Unieczynnieniu ulega losowo tylko jeden z chromosomów X pochodzący albo od ojca albo od matki. W
organizmie kobiety tworzy się zatem swoista mozaika Xmat i Xpat.

Pojawienie się tylko u heterozygotycznych kotek łaciatego czarno-biało-żółtego futra (z rodziców jednolicie
zabarwionych: matka o ciemnym, ojciec o jasnym futerku) świadczy to o losowej inaktywacji chromosomu
X i nazywa się efektem wariegacji albo fenotypowej mozaikowatości.

Mechanizm kompensacyjny nie dotyczy jednak komórek rozrodczych, bowiem w oocytach w trakcie
profazy mejotycznej następuje reaktywacja nieczynnego poprzednio chromosomu X. Co więcej, wydaje się,
że aktywność obu chromosomów X jest niezbędna do normalnego przebiegu oogenezy. Brak jednego
chromosomu X u kobiet z zespołem Turnera (X0) powoduje bezpłodność, natomiast u myszy X0 znaczne
skrócenie okresu rozrodczego wskutek zamierania oocytów. U osobników płci męskiej obecność drugiego
chromosomu X uniemożliwia normalny przebieg spermatogenezy, powodując zamieranie spermatogoniów
wkrótce po urodzeniu, dlatego mężczyźni z zespołem Klinefeltera (XXY) są niepłodni.

W

YKŁAD

9

ANALIZA GENETYCZNA

Klasyczna analiza genetyczna polega na krzyżowaniu osobników i obserwacji badanych cech w potomstwie.
Obecnie celem analizy genetycznej jest nie tylko wyróżnienie odrębnych genów i ustalenie ich efektów
fenotypowych, ale także ustalenie ich pozycji w chromosomach danego organizmu, czyli konstrukcja map
chromosomowych.

ANALIZA GENETYCZNA ORGANIZMÓW EUKARIOTYCZNYCH

DZIEDZICZENIE TYPU PISUM (PRAWA MENDLA)

Prawo czystości gamet
Geny wniesione przez oboje rodziców pozostają w mieszańcu w stanie niezmienionym i podczas tworzenia
gamet przez tego mieszańca przechodzą do nich pojedynczo. Allele genów wykluczają się wzajemnie w
gametach.
Prawo niezależnej segregacji
Geny niesprzężone należące do par nieallelicznych dziedziczą się niezależnie.

W pierwszym okresie rozwoju genetyki, po roku 1900, nazwanym mendelizmem, obserwacje Mendla
poczynione na grochu zostały rozszerzone na inne organizmy roślinne i zwierzęce, z człowiekiem włącznie.
W wyniku tych badań potwierdzone zostały zasadnicze koncepcje Mendla, a jednocześnie uległy one
istotnym uzupełnieniom i modyfikacjom.

ZAGADNIENIA MENDELIZMU

•

Niepełna dominacja

•

Kodominacja

33

Genetyka 2012

•

Allele wielokrotne

•

Plejotropia

•

Epistaza

•

Hipostaza

•

Współdziałanie genów

•

Geny letalne

•

Penetracja

•

Ekspresywność

•

Geny modyfikatory

•

Geny kumulatywne

•

Transgresja

•

Heterozja

MENDEL – TWÓRCA PODSTAW GENETYKI

Wnioski jakie Mendel wyciągnął ze swoich prac, są następujące:

•

zygota ma podwójna dawkę czynnika (tj. genu) warunkującego dana cechę, natomiast gamety są
„czyste”: przenoszą tylko jeden z dwu czynników determinujących cechy przeciwstawne.

•

jeden z pary czynników warunkujących cechy przeciwstawne jest dominujący, drugi zaś recesywny:
w obecności allelu dominującego nie wpływa on na fenotyp.

•

pary czynników warunkujących różne cechy organizmu wykazują niezależną segregację.

Żadne z tych twierdzeń nie jest zupełnie ścisłe. Może być więcej niż dwa typy przeciwstawnych czynników
czyli alleli.
U roślin występuje zjawisko zwane poliploidalnością. Polega ono na tym, że zygoty mają liczbę
chromosomów zwielokrotnioną: nie 2n, tylko 4n, 6n lub więcej. W gametach roślin poliploidalnych liczba
chromosomów wynosi 2n, 3n itd. A więc gamety nie są „czyste” – mogą przenosić dwa, trzy lub więcej alleli
danego genu.
Dominowanie jednego genu allelicznego nad drugim nie musi być całkowite (np. różowe kwiaty
heterozygotycznych roślin wyżlinu)
Geny niealleliczne zlokalizowane w tych samych chromosomach często nie wykazują niezależnej segregacji.
Znane są również inne zjawiska niezgodne z prawami Mendla (np. dziedziczenie cytoplazmatyczne).
Zainteresowani zjawiskami dziedziczności hodowcy zwierząt zakładali, że jeżeli jakiejś cechy nie widać u
danego zwierzęcia, to nie pojawi się ona również w jego potomstwie. Prace Mendla obaliły ten pogląd i
pozwoliły na wyjaśnienie dlaczego potomstwo pod niektórymi względami może być podobne nie do
rodziców, lecz do jednego z dziadków.
Wprawdzie nie wszystkie geny segregują się niezależnie od siebie, ale cechy uwarunkowane przez różne
geny mogą przejawiać się niezależnie od siebie. Zjawiska niezgodne z prawami Mendla nie są jednak
zaprzeczeniem tych praw, lecz ich rozszerzeniem i uściśleniem.
Niezależnie od tego, ile typów alleli danego genu występuje w populacji, osobniki diploidalne mają tylko
parę tych alleli, a gamety wytwarzane przez te osobniki tylko jeden allel. Właśnie takie zachowanie alleli
stało się podstawą dla potwierdzonej później hipotezy, że geny są zlokalizowane w chromosomach.
Głównym osiągnięciem Mendla było wykazanie istnienia jednostek („związków”) dziedziczności, które
zgodnie z określonymi regułami są przekazywane za pośrednictwem gamet z pokolenia na pokolenie.
Odkrycie to stworzyło racjonalne podstawy genetyce, nauce o dziedziczności.

Wyraźne odchylenia od mendlowskich stosunków rozszczepień obserwuje się u trisomików. Jako przykład
może może posłużyć Poinsettia, trisomik odkryty u Datura przez Blakeslee.
Obserwował on dziedziczenie barwy kwiatów tego trisomika. Gen P warunkuje purpurowe zabarwienie
kwiatów, a jego recesywny allel p zabarwienie białe. Poinsettia o purpurowej barwie kwiatów może mieć
trzy rożne genotypy: PPP, PPp, Ppp. Gamety powstające u trisomika (przy założeniu losowego rozchodzenia
się chromosomów w triwalencie) będą dwojakiego rodzaju: gamety haploidalne o n chromosomach oraz
gamety o n+1 chromosomach. Przy samozapyleniu funkcjonalne są gamety o n chromosomach oraz komórki
jajowe o n+1 chromosomach. Ziarna pyłku z n+1 chromosomami nie są funkcjonalne.
Poinsettia o genotypie Ppp wytworzy cztery rodzaje gamet z których po samozapyleniu otrzymamy
potomstwo diploidalne 2n o segregacji barwy kwiatów zbliżonej do 1:1 oraz potomstwo trisomiczne
(Poinsettia) 2n+1 o segregacji kwiatów purpurowych do białych 7:2.

34

Genetyka 2012

U Datura stramonium znane są oprócz diploidów o genotypie Pp i purpurowych kwiatach – autotetraploidy z
podwójną liczbą chromosomów w heterozygocie PPpp.
W wyniku samozapylenia otrzymujemy segregację barwy kwiatów w stosunku 35 roślin o purpurowych
kwiatach (warunkowanych przez allel P) i 1 roślinę o białych kwiatach (warunkowanych przez allel p).
Autotetraploidy mają cztery homologiczne zespoły chromosomów. Wytwarzają w mejozie tetrawalenty.
Przy założeniu, że cztery homologiczne chromosomy tetrawalentu są rozdzielane losowo parami do
powstających gamet, to autotetraploid o genotypie PPpp będzie wytwarzał trzy rodzaje gamet w
następujących stosunkach liczbowych - 1PP:4Pp:1pp
Skład genotypowy takiej rośliny po samozapłodnieniu jest zgodny ze wzorem (1PP+4Pp+1pp)2 czyli
1PPPP, 8PPPp, 18Pppp, 1pppp.
Przy całkowitej dominacji stosunek fenotypowy wynosi 35 roślin z cechą dominującą i 1 roślina z cechą
ustępującą (35:1).
Prawdopodobieństwo pojawienia się osobnika homozygotycznego względem allela recesywnego obniża się

u autotetraploidów w porównaniu z diploidami z do .

Przy dwóch jednocześnie segregujących genach, częstość homozygotycznych osobników w stosunku do obu

genów wynosi u autotetraploida

podczas gdy u diploidu

Tak więc stosunki liczbowe fenotypów w potomstwie autotetraploidalnym heterozygot są zupełnie inne niż
wynika z praw Mendla ustalonych dla diploidów. Każdy gen występuje w zygocie w liczbie czterech alleli a
w gamecie dwóch alleli, co jest niezgodne z pierwszym prawem Mendla.
Heterozygoty w stosunku do jednej pary alleli mogą być trzech różnych typów (Pppp, PPpp, PPPp) a każda z
nich wytwarzana inne rodzaje gamet i w innym stosunku liczbowym. To także jest odstępstwem od
pierwszego prawa Mendla.

GENETYKA CECH ILOŚCIOWYCH

Oparta jest na twierdzeniu, że dziedziczenie różnic ilościowych zależy od genów podlegających tym samym
prawom i mających te same właściwości ogólne, co geny, których właściwości i przekazywanie ujawnia się
w różnicach jakościowych. Opiera się więc na prawach Mendla i jest rozwinięciem genetyki Mendla.
Przy badaniu dziedziczenia cech ilościowych, stosowanie zwykłych metod genetyki mendlowskiej zawodzi,
gdyż w potomstwie osobników różniących się cechą ilościową najczęściej w F

2

nie możemy wyróżnić

odrębnych klas osobników, a zmienność w F

2

ma charakter ciągły.

Metody badań stosowane w genetyce ilościowej różnią się jednak pod dwoma względami od metod
używanych w genetyce mendlowskiej:

•

w cechach ilościowych nie można obserwować mendlowskich stosunków liczbowych, a co za tym
idzie pojedyncze osobniki nie stanowią źródła informacji. Jednostkami przydatnymi do badań są
dopiero populacje

•

natura badanych różnic ilościowych wymaga dokonywania pomiarów, a nie wyłącznie
klasyfikowania osobników

Podstawowe teorie statystyczne dotyczące ciągłej zmienności genetycznej opracowane zostały blisko 40 lat
temu przez Rolanda A. Fishera, Sewalla Wrighta i J.B.S. Haldane’a. Na ich podstawie można przewidywać
przebieg procesów genetycznych w modelowych populacjach, w których geny działają w określony sposób.

MAPOWANIE QTL (QUANTITATIVE TRAIT LOCI)

Wzrost jest cechą determinowaną przez około 100 genów nawzajem kontrolujących swoje działanie.
Proporcjonalnie do wzrostu powiększa się też masa ciała. W 2007 roku – po rozszyfrowaniu genomu psa
domowego (udomowionego przez człowieka prawie 15 tysięcy lat temu) – rozpoczęto poszukiwania genów,
od których zależy wielkość ciała (osiem zespołów badawczych z 8 renomowanych ośrodków z USA i
Wielkiej Brytanii). Pies doskonale nadawał się do tych badań ze względu na zdumiewającą różnorodność
wielkości ciała i innych cech fenotypowych (ponad 330 ras).
Przebadano DNA 3241 psów należących do 143 ras. Stwierdzono, że głównym genem determinującym
wzrost i masę ciała jest insulinopodobny czynnik wzrostu I (IGF-1) na chromosomie 15. Ogromne
zróżnicowanie wielkości i masy ciała psów zależy od sekwencji regulatorowej QTL (Quantitative Trait Loci)
kontrolującej aktywność genu IGF-1. Sekwencja ta jest obecna w genomie małych psów, a brak jej u psów
dużych ras. Działanie QTL hamuje wiec aktywność genu IGF-1. Opisane wyniki (NATURE z 06/04/2007)
mają jednak wyjątek. Wykryto mianowicie aktywna sekwencje QTL u rottweilerów, które są dużymi psami.

35

Genetyka 2012

Wskazuje to, że „czynnik wzrostu” może byś regulowany przez jeszcze inną (inne) sekwencje dotychczas
nie wykrytą. Nieznana jest też odpowiedź na pytanie czy sekwencja regulatorowa QTL powstała w wyniku
mutacji u małych ras, czy też została „zgubiona” (zanikła) podczas krzyżowania dużych psów między sobą.
Gen IGF-1 reguluje najprawdopodobniej wielkość ciała nie tylko u psów, wpływ ponadto na prawidłowe
funkcjonowanie serca, stawów i procesów metabolicznych, a także transformację nowotworową (np. w raku
okrężnicy).
Gen IGF-1 odziedziczony po matce wymaga imprintowania. Zanik piętna imprintingu sprzyja transformacji
nowotworowej.
Gen IGF-1 ma działanie plejotropowe.

EPIGENETYCZNA REGULACJA QTL

sekwencja DNA

stan chromatyny

cecha fenotypowa

sekwencjaDNA

TRANSPOZYCJA

Transpozon Drosophila melanogaster (wywilżny karłówki zwanej muszką owocową) nazwano elementem P
(od paternal=ojcowski). Zauważono, że potomstwo samców pewnych populacji z samicami innych populacji
miało liczne zaburzenia genetyczne: mutacje, pęknięte chromosomy i wady rozwojowe. Ponieważ
stwierdzono, ze odpowiedzialne za to mechanizmy pochodzą wyłącznie od ojca, czynnik o tym decydujący
nazwano właśnie elementem P. jest to transpozon o krótkich, odwróconych, powtarzających się
sekwencjach, nie wbudowujący się łatwo do chromosomów innych gatunków. Ponieważ transpozon może
przeskakiwać na nowe chromosomy, jak i tworzyć liczne kopie, nie podlega on dziedziczeniu zgodnie z
prawami mendla. Podczas zwykłej produkcji gamet interesujący gen pojawia się u połowy gamet i jest
przekazywany połowie potomstwa.

REWERSJA PRZY UDZIALE RNA

Dzikie formy Arabidopsis thaliana (rzodkiewnika pospolitego) wytwarzają normalne kwiaty o
niezrośniętych płatkach, które u mutantów są zrośnięte. Badania tych mutantów przez Susan Lolle i Roberta
Pruitt dowiodły, że przyczyną ich powstania jest mutacja obu kopii genu HOTHEAD różniąca się od kopii
prawidłowej jedną para zasad. U kilku procent potomstwa mutantów jedna z kopii genu HOTHEAD ulega
spontanicznej rewersji do formy dzikiej przez precyzyjną naprawę mutacji punktowej, co do chwili
ogłoszenia wyników badań (NATURE 2005) znane było wyłącznie u bakterii, gdzie zdarzało się
sporadycznie w szybko rozwijających się komórkach.
W poszukiwaniu odpowiedzi na pytanie: jak doszło do tej rewersji Lolle i Pruitt wykluczyli wszelkie znane i
możliwe wytłumaczenia jak: krzyżowanie się z formą dziką, szczególnie wysokie tempo mutacji genu
HOTHEAD lub obecność innej, ukrytej kopii genu. Analiza sekwencji genomu mutantów i rewertantów
wykazała też, że u mutantów występują inne – poza mutacja w genie HOTHEAD – zmiany, które są
następnie „naprawiane” u reweransów, ale nie według sekwencji rodziców, a sekwencji dalszych przodków.
Wykryte zjawisko „przeskakiwania” pokolenia lub nawet kilku pokoleń podczas przekazywania informacji
genetycznej, a więc korzystanie z jakiejś zapasowej kopii genomu przodków, narusza podstawowe prawa
dziedziczenia sformułowane przez Mendla w 1865 roku.
Odziedziczone po dalszych przodkach „awaryjne” archiwum genetyczne jest zabezpieczeniem przed
niesprzyjającymi warunkami, umożliwiającym dostęp do genów, nieobecnych u rodziców w wersji dzikiej.
Sugeruje się, że tą zapasową matrycą jest dwuniciowy RNA, co jest tym bardziej prawdopodobne, że u wielu
organizmów (rzodkiewnik, ryż, mysz, człowiek) wykazano transkrypcję nadspodziewanej ilości RNA o
sekwencji komplementarnej do tej, która umożliwia prawidłową translację.
Dziedziczenie informacji genetycznej za pomocą RNA niezależnie od sekwencji DNA organizmu
przypomina inną niezwykłą właściwość RNA nazwaną rekodowaniem. Zjawisko to polega na zmianie
fragmentu cząsteczki RNA transkrybowanej z DNA, co powoduje powstanie innego białka niż wynikałoby
to z sekwencji genu. Rekodowanie ściśle zależy od trójwymiarowej struktury RNA i pojawiających się form
węzła lub pętli, a nie od sekwencji RNA (co dowiódł genetyk Robert Renan dla białka układu nerwowego).
Niewyjaśnione przypadki spontanicznej rewersji znane są także w chorobach genetycznych człowieka.
Przykładem może być zaburzenie o nazwie rzekome raki kolczystokomórkowe Ferguson-Smith (MSSE).

36

Genetyka 2012

Histologicznie są to wyraźnie zróżnicowane łuskowate nabłoniaki, w dużej liczbie, ze zdolnością do
samoistnego gojenia się po wielu miesiącach, z pozostawieniem blizn.
Choroba jest jednogenowa z dziedziczeniem autosomalnym dominującym. Wywodzi się ze Szkocji, a
obecnie występuje u ponad 100 potomków w 11 rodzinach na całym świecie. Z wywiadów genetycznych
wiadomo, że w rodzinach tych występowały osoby klinicznie „zdrowe”, których potomkowie znowu
wykazywali objawy choroby. Miało więc miejsce przeskakiwanie pokoleń, podobnie jak to obserwowano u
rzodkiewnika.

DZIEDZICZENIE PRZY UDZIALE RNA

W Narodowym Instytucie Zdrowia i Badań Medycznych (INSERM) we Francji skonstruowano mysz z
mutacją w genie o nazwie Kit, którego ekspresja dała cętkowany na biało ogon. Potomstwo myszy z mutacją
w genie Kit odziedziczyło cętkowaną sierść, ale nie odziedziczyło mutacji w genie Kit, w którym cecha ta
była zakodowana. Białe cętki pojawiły się także w następnych pokoleniach, mino nieobecności genu Kit.
Autorzy badań uważają za wysoce prawdopodobne, że to przeniesienie cechy z pokolenia na pokolenie
odbyło się za pomocą RNA. Jest to pierwszy udokumentowany fakt udziału RNA w dziedziczeniu (maj
2006).

W

YKŁAD

10

LOKALIZACJA GENÓW W CHROMOSOMACH

Pod koniec XIX i na początku XX wieku wykonano doświadczenia, które wykazały, że geny muszą
znajdować się na terenie jądra komórkowego. Doświadczenia takie prowadzone były na zapłodnionych
jajach jeżowców oraz na jednokomórkowym glonie Acetobularia.
Odkrycie procesu mejozy pozwoliło na postawie hipotezy, że geny występują w chromosomach. Sugerowała
to analogia między zachowaniem się chromosomów i alleli w czasie podziałów mejotycznych
poprzedzających wytwarzanie gamet.

CHROMOSOMOWA TEORIA DZIEDZICZNOŚCI

Waltera Suttona, Theodora Boveri

Bezpośrednich dowodów o lokalizacji genów w chromosomach dostarczyły badania Thomasa H. Morgana i
jego współpracowników wykonane w latach 1909-1914 na Drosophila melanogaster.
Na podstawie dziedziczenia się cechy białej barwy oczu Drosophila, Morgan odkrył dziedziczenie sprzężone
z płcią. Dziedziczenie cechy białej barwy oczu u Drosophila daje się w pełni wytłumaczyć założeniem, że
gen determinujący tę barwę oczu zlokalizowany jest w chromosomie X.

Drosophila

Człowiek

XX

♀

♀

XY

♂

♂

XXX

supersamica

trisomia X ♀

XXY

samica

zespół Klinefeltera
♂

X0

sterylny ♂

zespól Turnera ♀

Y

ginie

ginie

Gdy osobniki F

1

są fenotypowo dzikie, wtedy mówimy, że test komplementacji jest pozytywny, co oznacza,

że badane mutanty powstały w wyniku dwóch mutacji nieallelicznych.
Jeżeli zaś mieszańce F

1

powstałe ze skrzyżowania ze sobą dwóch mutantów, nadal posiadają barwę oczu

zmutowaną, to wynik testu komplementacji jest negatywny. Co oznacza, że badane mutanty powstały w
wyniku dwóch mutacji allelicznych.

37

Genetyka 2012

DZIEDZICZENIE HOLANDRYCZNE

(Enriques 1922)

Terminem tym obejmuje się dziedziczenie genów sprzężonych z chromosomem Y. Geny te przekazywane są
wyłącznie z ojca na syna przy systemie determinacji płci typu XX♀ - XY♂ i ujawniają swoje działanie
jedynie u osobników płci męskiej.
Wśród około 80 genów sprzężonych z chromosomem Y dwa nie dziedziczą się w sposób sprzężony z płcią,
ponieważ ulokowane są w regionie pseudoautosomalnym PAR (Pseudoatosomal Region). Są to gen SRY
(Sex Determining Region on the chromosome Y) oraz gen MIC2Y komórkowego antygenu
powierzchniowego na krwinkach czerwonych 12E7 (kontrolowany przez locus grupy krwi Y

g

położony poza

systemem koniugacyjnym PAR).
Nie są znane choroby genetyczne sprzężone z chromosomem Y. Badania tego chromosomu przekazywanego
w linii męskiej są pomocne w ustalaniu przodków i określaniu dróg ich migracji.

SPRZĘŻNIE GENÓW

Przy niezależnej segregacji genów A i B, zgodnie z drugim prawem Mendla, oba typy heterozygot powinny
wytwarzać cztery rodzaje gamet: AB, Ab, Ab, ab w stosunku 1:1:1:1.
Jeśli jednak geny leżące w jednym chromosomie dziedziczą się w sposób sprzężony, to heterozygota AB/ab
będzie wytwarzać wszystkie lub co najmniej większość gamet AB i ab, a heterozygota Ab/Ab powinna
odpowiednio wytwarzać jedynie lub w większości gamety Ab i AB.
Jeżeli mieszaniec F

1

powstaje z gamet AB x ab to występuje zjawisko przyciągania pomiędzy genami A i B

oraz a i b. To przyciąganie wyraża się wytwarzaniem przez mieszańca gamet w stosunku: nAB: 1Ab: 1aB:
nab.
Jeżeli mieszaniec F

1

powstaje z gamet Ab x aB to występuje zjawisko przyciągania pomiędzy genami A i b

oraz a i B. To przyciąganie wyraża się wytwarzaniem przez mieszańca gamet w stosunku: 1AB: nAb: naB:
1ab.

:

!
!

" :

!

#$% coupling – przyciąganie

:

!
!

" :

!

&'()% repulsion - odpychanie

Dwa geny leżące w tym samym chromosomie wykazują dziedziczenie sprzężone, niezgodne z drugim
prawem Mendla, twierdzącym, że allele dwóch genów dziedziczą się niezależnie. Przy tym założeniu
wartości procentowe rekombinacji między dwoma genami sprzężonymi mogą stanowić miarę odległości
położenia loci tych genów.

KRZYŻÓWKA F. B. HUTTA

I – białe upierzenie drobiu
i – barwne upierzenie drobiu
F – (frizzle) cecha szurpatości
f – normalny allel upierzenia

Wnioski z krzyżówki F.B. Hutta

1.

pozorna niezgodność wyników obu krzyżówek testowych spowodowana jest sprzężeniem
genetycznym genów: determinujących białe lub barwne upierzenie drobiu i kodującym normalne lub
szurpate upierzenie drobiu

2.

zjawisko sprzężenia jest to tendencja rodzicielskich kombinacji genów do nierozdzielania się, co
wyraża się w stosunkowo rzadkim występowaniu nowych zrekombinowanych kombinacji genów

3.

geny wykazują sprzężenie dlatego, że znajdują się na tym samym chromosomie

4.

geny wykazują jednakowo silną tendencję do rekombinacji bez względu na to, czy układ alleli jest
taki, że oba dominanty znajdują się w jednym chromosomie, a oba recesywny w drugim, czy też, że
dominant i recesywny występują w każdym z homologicznych chromosomów

5.

dla poszczególnych par genów sprzężonych częstość rekombinacji jest uderzająco stała. Częstość
rekombinacji ustalona przy jakimś krzyżowaniu może być podstawą przewidywania stosunków
genotypowych i fenotypowych przy dalszych krzyżowaniach, dotyczących tych samych par genów.

38

Genetyka 2012

6.

crossing – over pomiędzy poszczególnymi parami genów sprzężonych zachodzi z całkowicie
określoną i stałą częstością. Procent powstałych rekombinantów (częstość c-o) służy do konstrukcji
map sprzężeń genetycznych.

U Drosophila gen y wywołuje żółte zabarwienie ciała, a jego allel dominujący y

+

zabarwienie szare typu

dzikiego. Gen ten dziedziczy się w sposób sprzężony z płcią, podobnie jak gen w. A więc geny w i y leżą na
chromosomie X. Gdy badamy dziedziczenie się tych dwóch genów jednocześnie to stwierdzamy, że
dziedziczą się one w sposób sprzężony, niezgodny z drugim prawem Mendla.

REKOMBINACJA

W modelu rekombinacji stworzonym przez Robina Hollidaya pęknięcia na obu niciach helis DNA
(chromatyd) są symetryczne.
Na podstawie danych doświadczalnych wywnioskowano jednak, że wymiana nici między cząsteczkami
DNA zachodzi asymetrycznie. Model Hollidaya (1964) został więc poprawiony i nazwany modelem
Aviemore lub modelem Meselsona-Raddinga (1975).
Rekombinacja homologiczna
Rekombinacja między dwiema homologicznymi, dwuniciowymi cząsteczkami DNA, mającymi rozległe
podobieństwo sekwencji nukleotydów.
Rekombinacja umiejscowiona (zlokalizowana)
Rekombinacja między dwiema dwuniciowymi cząsteczkami DNA, mającymi tylko krótkie obszary
podobieństwa sekwencji nukleotydowej (uczestniczy w integracji faga λ do genomu Escherichia coli).
Konwersja genu
Niewzajemna rekombinacja wewnątrzgenowa, w wyniku której powstają cztery haploidalne produkty
mejozy wykazujące nieoczekiwany (niezwykły) zwór segregacji.
Rekombinacja odgrywa podstawową rolę w ewolucji genomów eukariotycznych kontrolując w różny sposób
ich funkcję, kształt i ogólny stan. Wpływ rekombinacji na funkcjonowanie genomu znajduje swój wyraz w
ewolucji genów, w szczególności w kontekście rodzin genów powtórzonych tandemowo.
Stosunkowo niedawno wyłoniła się zupełnie inna funkcja rekombinacji polegająca na „czyszczeniu” genomu
z sekwencji niespełniających funkcji biologicznych (junkDNA), takich jak transpozony, czy niektóre
sekwencje międzygenowe. Funkcje rekombinacji w ewolucji genomów eukariotycznych można więc streścić
jako: POWIEL, USUŃ, ZMIEŃ, WYCZYŚĆ.

DZIEDZICZENIE POZAJĄDROWE

(pozachromosomowe, cytoplazmatyczne, niemendlowskie)

Przekazywanie informacji genetycznej z pokolenia na pokolenie przez materiał genetyczny zlokalizowany
poza chromosomami.
DNA u eukariontów występuje głównie w mitochondriach – mtDNA (mitochondrialny DNA) i w
chloroplastach – cpDNA (chloroplastowy DNA).
Nie powstają one nigdy de novo, lecz zawsze przez podział już istniejących organelli.
Mitochondria i chloroplasty posiadają własny, odrębny od jądrowego system transkrypcji oraz różny od
cytoplazmatycznego system translacji.

DZIEDZICZENIE MITOCHONDRIALNE

Powszechnie akceptuje się hipotezę, że mitochondria pochodzą od symbiotycznych bakterii, które przed
miliardami lat zasiedliły komórki będące dalekimi przodkami dzisiejszych komórek eukariotycznych.
Mitochondrialny genom zwierząt zawiera 13 genów kodujących białka, 22 geny tRNA i 2 geny rRNA
(łącznie 37 genów).
W obrębie genomu występuje też niekodujący region kontrolny z miejscami inicjacji replikacji i
transkrypcji. Brak w nim sekwencji przerywnikowych (spacer DNA) między genami i intronów w genach.
Większość sekwencji to sekwencje unikatowe czyli nie powtarzające się.
mtDNA zwierząt ma niewielkie rozmiary, co w połączeniu z konserwatywnym układem genów
dziedziczonym tylko w linii matczynej, bardzo ułatwia analizę genetyczną bez konieczności wcześniejszego
sekwencjonowania DNA.

39

Genetyka 2012

Genom mitochondrialny cechuje duże tempo mutacji. Liczbę przestawień synonimicznych szacuje się na
5,7x10

-8

podstawienia na pozycję na rok (w jądrowych genach białkowych tempo to jest około

dziesięciokrotnie mniejsze).
Wyjątkowo szybko ewoluuje niekodujący region kontrolny, w którym znajduje się pętla D (displacement D-
loop). Wpływ na wysokie tempo mutacji mają (prawdopodobnie) uboczne produkty metabolizmu
oddechowego, w którym mtDNA bierze udział, jak i mało efektywny system naprawy DNA.
Pętla D jest to pośrednia struktura tworzona w czasie rekombinacji homologicznej według modelu
Meselsona-Raddinga. Pętla D to pośredni stan powstający w czasie replikacji o mechanizmie
przemieszczającej się pętli.
mtDNA jest pojedynczym haplotypem dziedziczonym jednorodzicielsko, a więc przekazywanym przez
matkę na dziecko bez rekombinacji. To klonalne dziedziczenie bardzo ułatwia analizę danej linii genetycznej
zarówno w czasie jak i przestrzeni.

GENETYKA SAMOTNEJ MATKI

Geny mitochondrialne są u człowieka dziedziczone wyłącznie po matce, stąd używany zwrot „genetyka
samotnej matki”.
Plemnik wnika do komórki jajowej wraz ze wstawką i znajdującymi się w niej (20) 50-100 mitochondriami,
które jednak już w momencie zapłodnienia są znacznie genetycznie zwyrodniałe z powodu nagromadzonych
w nich mutacji. Po zapłodnieniu komórka jajowa rozpoznaje męskie mitochondria i pozbywa się ich,
pozostawiając własne w liczbie około 100 tysięcy. Wybiórcze niszczenie mitochondriów plemnika następuje
dzięki piętnu ubikwytynowemu. Ubikwytyna jest białkiem używanym przez wszystkie komórki organizmu
do oznakowania innych białek przeznaczonych do degradacji.

MUTACJE MITOCHONDRIALNEGO DNA

Mutacje w mitochondrialnym DNA (mtDNA) zachodzą znacznie częściej niż mutacje w DNA jądrowym.
Przyczyną tego jest brak w mitochondriach mechanizmów naprawy uszkodzeń DNA. Część mutacji w
mitochondrialnym DNA zachodzi w ciągu całego życia osobnika, a ich charakterystyczną cechą jest to, iż
mogą dotyczyć całych tkanek, pojedynczych komórek lub nawet poszczególnych cząsteczek mtDNA tej
samej komórki.
Mutacja heteroplazmatyczna to taka w wyniku której w tkankach zmutowany mitochondrialny DNA
występuje razem z jego normalną kopią.
Mutacja homoplazmatyczna to taka w wyniku której w tkankach zmutowany mitochondrialny DNA
występuje w każdej kopii danego genu.
Płody i dzieci rozwijające się z heteroplazmatycznego jaja będą miały odmienne nasilenie i rodzaj objawów
chorobowych zarówno względem matki jak i względem siebie. Płody i dzieci które zachorują z powodu
mutacji homoplazmatycznej, będą miały objawy i ich nasilenie podobne. Poważne mutacje
homoplazmatyczne są letalne dla płodu.
Mutacje w mitochondrialnym DNA polegające na substytucjach nukleotydów (głównie tranzycja) insercji
bądź delecji nukleotydów są przyczyną bardzo poważnych (w większości śmiertelnych) chorób
genetycznych człowieka.
Skutkiem tranzycji są takie choroby człowieka jak dziedziczna neuropatia nerwu wzrokowego inaczej zespół
Lebera (LHON) i neuropatia obwodowa mięśni połączenia z ataksją i barwnikowym zwyrodnieniem
siatkówki (NARP).

DZIECI TROJGA RODZICÓW

wg „Human Reproduction”

U kobiet w zaawansowanym wieku przyczyną niepłodności może być mała żywotność ich komórek
jajowych. Jedną z technik wspomaganego rozrodu jest transfer cytoplazmy pobranej z komórki jajowej
młodszej kobiety. Technikę taką stosowała (stosuje?) Klinika Leczenia Niepłodności im. Świętego Barnaby
w Stanie New Jersey w USA, gdzie urodziło się 17 takich genetycznie zmodyfikowanych dzieci mających
trojga rodziców. 13 innych dzieci otrzymanych ta metodą urodziło się w innych klinikach.
U dzieci genetycznie zmodyfikowanych z New Jersey dwoje miało zespół Turnera (fenotypowe kobiety z
jednym chromosomem X, bezpłodne, z niskim wzrostem, „płetwiastą” nienaturalnie szeroką szyją i
szeregiem innych nieprawidłowości), jedna ciąża została poroniona.

40

Genetyka 2012

ZAGADNIENIA DO EGZAMINU Z GENETYKI 2011/2012

MATERIAŁ Z WYKŁADU I Z ĆWICZEŃ

1.

Nośniki informacji genetycznej - budowa ludzkiego chromosomu, funkcje głównych elementów struktury,
YAC, HAC

2.

Molekularny zegar czasu życia komórki

3.

Komórki starzejące się i nieśmiertelne

4.

Cykl komórkowy

5.

Podziały komórkowe

6.

Replikacja DNA

7.

Replikacyjny model starzenia się komórki

8.

Centralny dogmat przepływu informacji genetycznej

9.

DNA kodujący, niekodujący i pozagenowy - składniki budujące te odcinki DNA, ich funkcja, dziedziczenie i
znaczenie

10.

Gen eukariotyczny - budowa, wielkość, liczba genów

11.

Introny; rodzaje, namnażanie, homing, funkcja

12.

Geny intronowe, ich pochodzenie, lokalizacja na niciach DNA, transkrypcja, znaczenie

13.

Pseudogeny - powstawanie i rola względem funkcjonalnych genów

14.

Samolubny DNA - charakterystyka sekwencji

15.

Poślizg replikacji i jego skutki

16.

Ekspansje trinukleotydowe i ich efekt kliniczny

17.

Transpozony DNA - rodzaje, sposoby transpozycji, praktyczne znaczenie Alu

18.

Regulacja ekspresji genu eukariotycznego

19.

Metody naturalne i techniki wyciszania genów Eukaryota. Nokaut genetyczny

20.

Los dwuniciowego RNA po wniknięciu do komórki

21.

Zastosowanie RNAi

22.

Geny programu rozwoju - pojęcie, cechy charakterystyczne, rodzaje genów, ich funkcja

23.

Homeobox, homeodomena - pojęcie, rola w rozwoju zarodka

24.

Kompleks genów HOM i kompleksy genów Hox

25.

Kod epigenetyczny i epimutacje

26.

Piętnowanie genomu

27.

Metylacja jako przyczyna imprintingu genomowego

28.

Imprinting genomowy człowieka - przykłady

29.

Teoria Lyon. Izodisomia jednorodzicielska. Heterodisomia jednorodzicielska.Udział genowych i
pozagenowych zasobów informacji w inaktywacji chromosomu X. Dowody popierające teorię Lyon

30.

Genetyczna determinacja cechy o zmienności nieciągłej

31.

Prawa Mendla. Przykłady dziedziczenia zgodnego z tymi prawami

32.

Przykłady pozornych odstępstw od praw Mendla i ich genetyczna interpretacja (mendelizm)

33.

Genetyczna determinacja cechy o zmienności ciągłej

34.

Charakterystyka genów kumulatywnych i ich dziedziczenie (przykłady)

35.

Praktyczne aspekty transgresji i heterozji

36.

Założenia teorii Th. Morgana i ich genetyczne konsekwencje

37.

Istota sprzężenia genetycznego

38.

Sprawdzanie alleliczności genów

39.

Crossing-over i rekombinacja genetyczna jako zjawiska generujące zmienność genetyczną

40.

Modele rekombinacji: model Hollidaya i model Meselsona-Raddinga

41.

Przykłady dziedziczenia genów sprzężonych

42.

Cechy związane z płcią

43.

Cechy zależne od płci

44.

Pojęcie mutacji i jej główne cechy

45.

Aberracje chromosomowe

46.

Mutacje chromosomowe liczbowe

47.

Mapy genetyczne Th. Morgana

48.

Konstrukcja mapy genetycznej u Eukaryota na przykładzie krzyżówki trzypunktowej

49.

Mitochondrialny genom człowieka

50.

Specyfika transmisji mitochondrialnego DNA

51.

Charakterystyka mutacji mtDNA

52.

Choroby wywołane mutacjami mtDNA

53.

Hetero- i homoplazmia - trudności w prognozowaniu dziedziczenia mtDNA

54.

Przykłady dziedziczenia pozajądrowego