Tworzenie wiązania peptydowego w roztworze oraz
synteza na fazie stałej



Agnieszka Kwapisiewicz

AMINOKWASY
PEPTYDY
BIAŁKA

Tworzenie wiązania peptydowego

METODY TWORZENIA WIĄZANIA PEPTYDOWEGO:

ü

Metoda karbodiimidowa (DCC)

§

Metoda azydkowa

ü

Metoda bezwodnikowa

ü

Metoda aktywnego estru

§

Metoda aktywnego amidu

§

Metoda izocyjanianowa

§

Metoda fosfoazowa

§

Metoda ynaminowa

§

Metoda chlorku kwasowego

§

Wbudowanie grupy aminoacylowej

§

Synteza peptydów poprzez N- karboksybezwodniki (NCA)

§

Sprzęganie w reakcji redoks

ü

Synteza na fazie stałej

WIĄZANIE
PEPTYDOWE



Już w 1902 r. Emil Fisher zauważył, że białka zawierają stosunkowo mało wolnych grup
aminowych i karboksylowych. Na tej podstawie zasugerował, że łączenie się aminokwasów
to reakcja kondensacji z udziałem grupy karboksylowej jednego z nich oraz grupy aminowej
kolejnego; w rezultacie powstaje wiązanie amidowe. Nazwane jest ono wiązaniem
peptydowym.

WIĄZANIE PEPTYDOWE

SYNTEZA PEPTYDÓW

METODA KARBODIIMIDOWA DCC

Dicykloheksylokarbodiimid (DCC)

O-acyloizomocznik

dicykloheksylomoczn
ik

1-hydroksybenzotriazol
(HOBT)

N -
hydroksysukcynoimid

METODA MIESZANYCH BEZWODNIKÓW

chloromrówczan izobutylu

THF

-5 do -15 C

BEZWODNIK

Dicykloheksylokarbodiimi
d (DCC)

dicykloheksylomoczn
ik

Bogate w energię estry
tlenowe –estry
aktywowane

O-acyloizomocznik

METODA NA NOŚNIKU STAŁYM

W metodzie tej blokuje się grupę α-aminową aminokwasu, który ma
znaleźć się na końcu C docelowego peptydu, a grupę α-
karboksylową tego aminokwasu łączy się z nierozpuszczalnym
nośnikiem polimerowym; zwykle w tej roli stosowany jest
polistyren, czyli poli (fenyloeten)

Całkowicie nowe podejście syntezy peptydów
opracował Merrifield w 1960r. Chodzi o syntezę
na nośniku stałym (SPPS- ang. solid-phase peptide
synthesis).Za to osiągnięcie Merrifieldowi
przyznano w 1984 r. Nagrodę Nobla z chemii.

POLISTYREN

Najczęściej stosowanym nośnikiem stałym jest kopolimer styrenu i
diwinylobenzenu. Diwinylobenzen zapewnia usieciowanie polimeru,
czyli mostki między łańcuchami. Stopień usieciowania można
kontrolować poprzez zmianę ilości diwinylobenzenu biorącego udział
w procesie polimeryzacji. Do syntezy peptydów stosuje się
polimer luźno usieciowany (1-2%), tak aby rozpuszczalniki i substraty
mogły swobodnie wnikać do wnętrza perełek wykonanych z takiego
materiału. Rozpuszczalnik stanowi około 90% objętości spęczniałych
perełek, a zatem synteza zachodzi praktycznie w
roztworze, mimo, że łańcuch peptydowy jest przez cały czas połączony z
nośnikiem.

METODA NA NOŚNIKU STAŁYM SPPS

DCC

O-acyloizomocznik

Jednym z najszerzej
stosowanych linkerów jest
alkohol 4-
alkoksybenzylowy,
połączona z nim żywica
tzw.”ŻywicaWanga”

ZALETY SYNTEZY PEPTYDÓW NA
NOŚNIKU STAŁYM

Ø

Łatwość pozbycia się wszystkich produktów ubocznych kolejnych reakcji – przez

proste przemywanie żywicy polistyrenowej na sączku

Ø

Rosnący łańcuch jest przez cały czas przyczepiony do stałego nośnika i nie trzeba

go wyodrębniać

Ø

W metodzie tej nie pojawia się problem słabej rozpuszczalności peptydów, często

utrudniający syntezę w roztworze; peptyd jest przecież przyczepiony do nośnika

Ø

SPPS jest procesem stosunkowo prostym. Procedura została w pełni

zautomatyzowana i obecnie można po prostu kupić urządzenie, które wykonuje całą tę
pracę.

Zdjęcie przedstawia zestaw do prowadzenia syntezy peptydów na nośniku stałym

WADY SYNTEZY PEPTYDÓW NA NOŚNIKU
STAŁYM SPPS

Rosnący łańcuch peptydowy przez cały czas pozostaje połączony
ze stałym nośnikiem. Oznacza to, że jeśli z jakiegoś powodu
reakcja sprzęgania nie zachodzi do końca na pewnym etapie, to
w produkcie końcowym obecna jest pewna populacja
cząsteczek z brakującą resztą aminokwasową.

Pozbycie się takich produktów delecji może nastręczać wielu
trudności. Dlatego też powszechną praktyką jest

sprawdzanie na

każdym etapie kompletności reakcji sprzęgania

, tak aby w razie

potrzeby można ją było powtórzyć. W tym celu niewielką ilość
żywicy poddaje się testowi na obecność pozostałych wolnych grup
aminowych (reakcji ninhydrynowej).Jeśli także i powtórne
sprzęganie nie przebiega do końca, ułomny peptyd można na
trwałe zablokować, by zapobiec jego dalszemu wydłużaniu.

ZABEZPIECZANIE ŁAŃCUCHÓW
BOCZNYCH

Blokowanie
N α

Odblokowanie
Nα

Blokowanie
łańcucha
bocznego

Odblokowanie
łańcucha
bocznego

T –BOC
F moc

TFA
piperydyna

pochodne Bz
pochodne t-BU

HF
TFA

Tab.

Dwie główne strategie ochrony łańcuchów bocznych w metodzie SPPS

Skróty:

T-BOC – grupa t-butoksykarbonylowa
F moc- grupa fluorenylometoksykarboksylowa
TFA- kwas trifluorooctowy
Bz –ugrupowanie benzylowe; np.eter benzylowy w przypadku Thr
T-Bu - t-butanol np. sulfid dibutylowy w przypadku Cys
HF- ciekły fluorowodór

Treonina

Cysteina

Zasadniczą sprawą jest to, aby ochrona łańcucha bocznego przetrwała reakcje odblokowania
N- terminalnego aminokwasu

Odszczepienie, oczyszczenie i charakteryzowanie
produktu-peptydu

Odszczepianie peptydów od żywicy prowadzone jest zwykle z jednoczesnym usunięciem
osłon z grup funkcyjnych łańcuchów bocznych aminokwasów, np. z zastosowaniem
mieszaniny TFA/Fenol/H2O/TIPS (88:5:5:2). Reakcja, z zastosowaniem powyższej
mieszaniny, prowadzona jest przez 120 min w temperaturze pokojowej w atmosferze gazu
obojętnego (argonu). Po tym czasie żywica jest odsączana i przemywana dwukrotnie
niewielkimi ilościami TFA, a następnie z przesączu wytrącany jest peptyd za pomocą
zimnego Et2O. Wytrącony peptydy jest odsączany i po rozpuszczeniu w wodzie lub 20%
AcOH liofilizowany. Najczęściej używanym sposobem oczyszczania peptydu jest
preparatywna chromatografia HPLC w odwróconym układzie faz.

LITERATURA :

§

Shawn Doonan, Białka i peptydy, wyd. naukowe PWN , Warszawa 2008

§

H. D. Jakubke, H. Jeschkeit, Aminokwasy ,peptydy ,białka, wyd. naukowe

PWN, Warszawa 1982

§

J. McMurry, Chemia Organiczna, cz.4, wyd. naukowe PWN, Warszawa 2005

§

http://ewelina.adamska.w.interia.pl/3.pdf

§

http://www.ppc.univ.gda.pl/instrukcje/chembiol_cw1.pdf

§

http://en.wikipedia.org/wiki/Peptide_synthesis

Dziękuję za uwagę