1

3. Biochemia - budowa białek

Hierarchiczna budowa komórki

komórka

struktury
subkomórkowe

makrocząsteczki

podjednostki
monomeryczne

Aminokwasy – podstawowe jednostki budulcowe białek

Struktura aminokwasu

grupa aminowa

grupa karboksylowa

Aminokwasy są stereoizomerami

Wszystkie aminokwasy wchodzące w skład bialek

są w konfiguracji L

2

Aminokwasy łączą się za pomocą wiązania peptydowego

Aminokwasy

Aminokwasy o niepolarnych, alifatycznych grupach bocznych

glicyna alanina walina

leucyna metionina izoleucyna

Niepolarne, aromatyczne grupy boczne

fenyloalanina tyrozyna tryptofan

Polarne, nienaładowane grupy boczne

seryna treonina cysteina

prolina asparagina glutamina

Dodatnio naładowane grupy boczne

lizyna arginina histydyna

3

Ujemnie naładowane grupy boczne

kwas asparaginowy kwas glutaminowy

cysteina + cysteina

→

→

→

→

cystyna

grupy tiolowe

mostek
disiarczkowy

Absorpcja w ultrafiolecie (280 nm): określanie stężenia białek

Miareczkowanie aminokwasu (kwasu glutaminowego)

Aminokwasy łączą się tworząc wiązanie peptydowe

N-koniec C-koniec

Peptyd zawiera N-koniec i C-koniec

Peptyd to polimer składający się z aminokwasów.

4

Aspartame (Nutrasweet®): słodzik

Właściwości niektórych białek:
masa cząsteczkowa 10 000 - 3 000 000;
ilość aminokwasów: 100 - 27 000.

Koniugaty białek

Struktura białek

pierwszorzędowa drugorzędowa trzeciorzędowa

czwartorzędowa

Struktura pierwszorzędowa: sekwencja aminokwasowa.
Struktura drugorzędowa: struktura łańcucha polipeptydowego (

α

αα

α

-helisa,

ββββ

- harmonijka).

Struktura trzeciorzędowa: ułożenie całego łańcucha polipeptydowego.
Struktura czwartorzędowa: ułożenie kilku łańcuchów polipeptydowych.

Rozdzielanie białek - chromatografia kolumnowa

roztwór

faza stała

eluent

Chromatografia jonowymienna

ładunek dodatni

ładunek ujemny

perełki z
ujemnymi
ładunkami

5

Chromatografia sita molekularnego

porowate
perełki

Chromatografia powinowactwa

białko

ligand

ligand związany

z polimerem

Elektroforeza: rozdział białek w żelu poliakrylamidowym

Detergent:
siarczan dodecylu sodu (SDS) powoduje
denaturację białek.

Elektroforeza: każde białko wędruje w postaci osobnego prążka

Elektroforeza: oznaczenie względnej masy cząsteczkowej

nieznane
białko

Log Mcz

względna migracja

6

Sekwencja aminokwasowa
insuliny wołowej

mostki disiarczkowe

Sekwencjonowanie białek: Frederic Sanger określił sekwencję insuliny

Sekwencjowanie łańcucha polipetydowego

identyfikacja aminokwasu
N-końcowego

degradacja Edmana:
pozwala identyfikować
kolejne aminokwasy od
N-końca

Degradacja Edmana pozwala na określenie sekwencji aminokwasowej

Łańcuchy polipeptydowe trzeba podzielić na mniejsze fragmenty

Strategia sekwencjonowania białek

7

Sekwencja białka pokrywa się z sekwencją DNA

białko

DNA (gen)

Spektometria masowa białek:

Matrix-Assisted Desorption/Ionization Mass Spectrometry (MALDI)

pole elektryczne

kapilara próbka

próżnia

próbka

matryca

białko

detektor

jony najlżejsze
docieraja jako pierwsze

próba białka
poddana jonizacji

źródło
jonów

laser uruchamia zegar

MALDI-TOF (Time Of Flight)

Małe peptydy można syntezować chemicznie

R. Bruce Merrifiled otrzymał peptydy na nierozpuszczalnej matrycy
za pomocą 9-fluorenometoksykarbonylo- pochodnych aminokwasów)

Struktura białek

Łańcuch peptydowy: karbonylowy atom tlenu
i amidowy atom azotu tworzą mały dipol.

Generalna większość wiązań peptydowych występuje
w konfiguracji trans.

8

Wiązanie peptydowe ma charaktery wiązania podwójengo
i nie może się obracać.

wiązania peptydowe

Drugorzędowa struktura białek : helisa

α

αα

α

Drugorzędowa struktura białek : helisa

α

αα

α

Helisa

α

αα

α

: zawsze prawoskrętna

lewoskrętna prawoskrętna

Dipol helisy

α

αα

α

Drugorzędowa struktura białek : harmonijka

ββββ

antyrównoległa

równoległa

Wiązania wodorowe między sąsiednimi
segmentami łańcuchów polipeptydowych

9

Drugorzędowa struktura białek : skręt

ββββ

Łączą końce 2 antyrównoległych segmentów

ββββ

-harmonijek

typI

typ II

Gly

helisa

α

αα

α

harmonijka

ββββ

skręt

ββββ

Prawdopodobieństwo udziału aminokwasów w danej strkuturze

Struktura drugorzędowa i właściwości białek fibrylarnych

Helisa

α

αα

α

: keratyna, składnik włosów i paznokci

Powstawanie loków

Kolagen: składnik ścięgien i chrząstek

Potrójna spirala: lewoskrętna, 3 reszty aminokwasowe na jeden obrót.
35% Gly, 11% Ala, 21% Pro i HyPro

To nie jest helisa

α

αα

α

!

reszty glicyny

10

Struktura włókien kolagenu

Kolagen (M.cz. 300 000 da)

Włókno kolagenu:
długość: 3000 A
średnica: 15 A

Gly-Xaa-Pro lub Gly-Xaa-HyPro

U ssaków wystepuje 30 rodzajów kolagenu.

Struktura kolagenu

łańcuchy

włókienka
kolagenu

włókna
kolagenu

cząsteczki kolagenu
(potrójne helisy)

Sieciowanie cząsteczek kolagenu: Lys, HyLys lub His

łańcuch
polipetydowy

łańcuch
polipetydowy

Lys bez grupy

εεεε

-aminowej

(norleucyna)

HyLys

dehydroksylizynonorleucyna

Kolagen: białko strukturalne, występujące w największej ilości
(do 50% suchej masy). Istnieje 12 rodzajów kolagenu.
Kolageny są syntezowane przez fibroblasty i komórki nabłonka
w postaci prokolagenów.

Prokolageny mają dodatkowe 150 aminokwasów na N-końcu
i 250 aminokwasów na C-końcu. Dodatkowe domeny stabilizują
kolagen w czasie tworzenia potrójnej helisy.

Włókna kolagenu tworzą się w retikulum endoplazmatycznym
i w aparacie Golgiego. W aparcie Golgiego następuje modyfikacja
prolin i lizyn oraz O-glikozylacja.

Modyfikacja prolin i lizyn:
- hydroksylacja prolin
- hydroksylacja lizyn
- oksydacja lizyn (do aldehydów, tworzą następnie mostki

sieciujące łańcuchy)

oddziałuje z typem I i II

?

XII

chrząstki

300 nm

XI

chrząstki

150 nm, C-koniec

globularny

X

chrząstki,

przeważnie z typem II

200 nm, N-koniec

globularny

IX

komórki śródbłonka

?

VIII

śródbłonek

450 nm, dimer

VII

tkanki śródmiąższowe,

przeważnie z typem I

150 nm, N i C-

koniec globularny

VI

tkanki śródmiąższowe,

przeważnie z typem I

390 nm,N-koniec

globularny

V

błony podstawowe

390 nm, C-koniec

globularny

IV

skóra, mięśnie

300 x 67 nm

III

chrząstki, ciała szkliste

często z typem I

300 x 67 nm

II

skóra, ścięgna, kości

300 x 67 nm

I

lokalizacja

struktura

typ

Rodzaje kolagenów

11

Fibroblast produkujący kolagen na warstwie kolagenu

Injekcje kolagenu w celu upiększającym

przed po

Struktury genów kodujących prokolagen typu II (chrząstki, ciała szkliste)

i prokolagen typu I (skóra, ścięgna kości)

Oba geny zawierają 52 eksony, z tym że niektóre eksony mogą
być połączone.

Osteogenesis imperfecta
(wrodzona łamliwość kości)
jest wynikiem mutacji
w obrębie genów kodujących
prokolageny.

Objawy: samoistne złamania,
deformacja kości, niski wzrost,
zaburzone ząbkowanie,
błękitne twardówki.

Synteza prokolagenu może być
obniżona, lub powstający kolagen
może mieć nieprawidłową
strukturę.

Przyczyną wrodzonej łamliwości kości może być utrata eksonów
w genie kodującym prokolagen.

Istnieją typy wrodzonej łamliwości kości.
Typy I i IV dają łagodniejsze objawy niż typ II,
który powoduje śmierć w okresie niemowlęcym.

12

Integra









: dwuwarstowy system regeneracji skóry po oparzeniach

Składa się z 2 warstw: zewnętrzna to silikon, który chroni ranę.
Wewnętrzna warstwa to mieszanina bydlęcego
kolagenu i glikozaminoglikanów (siarczanu-6-chondroityny)
z chrząstki rekina.

Wewnętrzna warstwa umożliwia regenerację skóry działając
jak „rusztowanie”, podczas gdy zewnętrzna warstwa zabezpiecza
przed zakażeniem.

Glikozaminoglikany wchodzą w skład macierzy zewnątrzkomórkowej

Glikozaminoglikan powtarzająca się ilość disacharydów

jednostka

w łańcuchu

kwas hialuronowy

4-siarczan chondroityny

siarczan keratanu

służy jako smar w stawach
nadaje konsystencję oku
wchodzi w skład ścięgien

wchodzi w skład chrząstek
i ścięgien

wchodzi w skład kości,
a także rogów,kopyt i paznokci

Jak działa Integra









Dzień 0: oczyszczenie rany

Dzień 1: usunięcie martwej tkanki

Dzień 1: przyłożenie Integry

Dzień 14: utworzyła się naturalna skóra

Dzień 21: usunięcie silikonu

Dzień 21+: przeszczep naskórka

Dzień 25+: całkowita regeneracja skóry

autoprzeszczep skóry Integra









13

4-hydroksyprolina jest niezbędnym składnikiem kolagenu

Różnice w konformacji między proliną i 4-hydrokysproliną

4-hydroksyprolina powstaje w wyniku
działania hydroksylazy prolinowej

Askorbinian (witamina C) jest konieczny do hydroksylacji

reszt proliny w kolagenie

zawiera Fe

2+

Enzym zawierający Fe

3+

jest nieaktywny.

Askorbinian redukuje
Fe

3+

, czyli działa jako

antyutleniacz.

Kwas askorbinowy (witamina C) jest niezbędnym elementem
ludzkiej diety. Tylko człowiek, małpy, świnki morskie i niektóre
nietoperze nie potrafią syntezować witaminy C.

Brak witaminy C powoduje szkorbut.

szkorbut

wypadanie
zębów

blada
skóra

zapadnięte
oczy

James Lind, szkocki lekarz, wykazał w 1753,
że sok z cytryny leczy szkorbut

H.M.S. Salisbury

Kapitan James Cook korzystał z badań Linda

H.M.S. Resolution

H.M.S. Discovery

H.M.S. Endeavour

Biosynteza kwasu askorbinowego u roślin

14

Albert Szent-Gyorgyi wyizolował witaminę C z papryki w roku 1928

Odkrył też witaminę PP i wykazał, że ATP jest niezbędnym źródłem energii w mięśniach.
Nobel 1937.

Zawartość witaminy C w różnych owocach i roślinach

acerola

czarma
porzeczka

guava

papryka

owoce warzywa

zawartość
witaminy C
(mg/100g)

Acerola (Malpighia punicifolia; wiśnia z Barbados):

najwyższa zawartość witaminy C wśród roślin

Fibroina: składnik jedwabiu i nici pajęczych

antyrównoległe
harmonijki

ββββ

fibroina produkowana przez pająka

Białka w różnych konformacjach różnią się wielkością

Albumina (M.cz. 64 500): 585 reszt aminokwasowych

Mioglobina: pierwsze białko o znanej strukturze

15

Hem, obecny w mioglobinie, hemoglobinie, cytochromie

Pierścień protoporfirymowy
oraz jon żelazawy (6 wiązań koordynacyjnych)
W hemoglobinie i mioglobinie
jedno z prostopadłych wiązań koordynacyjnych
jest wykorzystane przez atom N histydyny.
Drugie może byc wykorzystane przez tlen.

Badanie struktury białek: krystalografia rentgenowska

źródło promieni
rentgenowskich

kryształ

wiązka promieni
rentgenowskich

promienie
rozproszone

detektor

Badanie struktury białek: krystalografia rentgenowska

3 zasady:

1. Elektrony powodują rozproszenie promieni rentgenowskich.

Amplituda fali rozproszonej przez dany atom jest proporcjonalna
do liczby jego elektronów.

2. Fale rozproszone nakładają się.

Każdy atom bierze udział w rozpraszaniu promieni.

Fale rozproszone w wyniku nakładamia się mogą ulegać
wzmocnieniu lub wygaszeniu, w zależności od tego,
czy znajdują się w jednakowej, czy tez różnej fazie.

3. Sposób nakładania się fal zalezy od rozkładu przestrzennego atomów.

Badanie trójwymiarowej struktury białek:
dyfrakcja promieni rentgenowskich

Wycinek mapy gęstości elektronowej mioglobiny

Magnetyczny rezonans jądrowy

energia

natężęnie pola magnetyczego

rozdzielenie
energii (

∆∆∆∆

E)

przejście między
stanami spinowymi
daje linię NMR

napromieniowanie

16

Biologicznie ważne jądra atomów dające sygnał NMR

jądro

występowanie izotopu
w przyrodzie
(% wagowy w puli
pierwiastka)

Magnetyczny rezonans jądrowy: alkohol etylowy

intensywność

przesunięcie chemiczne (ppm)

jądro znajdujące się w różnych
środowiskach zmienia stany
przy różniących się siłach pól

Magnetyczny rezonans jądrowy: 55-aminokwasowy peptyd

Jadrowy efekt Overhausera identyfikuje pary protonów znajdujące
się w bliskim sąsiedztwie

Struktura określona na podstawie obliczeń uzyskanych z widma NMR

Zestaw 25 struktur złożonych z 28-aminokwasowej
domeny palca cynkowego

przeciętne ułożenie
szkieletu białka

17

Magnetyczny rezonans jądrowy

Trójwymiarowa struktura niektórych małych białek

Udział rodzajów struktur w różnych białkach

Niektóre często występujące połączenia struktur

Niektóre często występujące połączenia struktur

Połączenia harmonijek w strukturze składającej sie wyłącznie z harmonijek

ββββ

skrzyżowane (nigdy niespotykane)

typowe

Struktura baryłki

ββββ

- wiele harmonijek

ββββ

przeciwciało

18

Duże motywy strukturalne powstają z małych motywów

Struktury wyłącznie

α

αα

α

Struktury wyłącznie

ββββ

Struktury

α

αα

α

/

ββββ

(

α

αα

α

i

ββββ

są wymieszane)

Struktury

α

αα

α

+

ββββ

(

α

αα

α

i

ββββ

są rozdzielone)

Struktura czwartorzędowa:
opisuje, z ilu podjednostek składa się białko

Deoksyhemoglobina (cztery podjednostki)

19

Max Perutz i John Kendrew określili strukturę hemoglobiny w roku 1959

Denaturacja białek

temperatura [°C] chlorowodorek guanidyny [M]

Symulacja fałdowania białka

Priony - białka, które mogą powodować nieprawidłowe fałdowanie

innych białek

Wycinek mózgu pacjenta zmarłego na chorobę Creutzfelda-Jakoba
(gąbczaste zwyrodnienie mózgu)

Białko PrP

C

: normalny składnik mózgu

Białko PrP

Sc

: zmieniona konformacja, przyczyna choroby

PrP

C

dimer PrP

Sc

druga podjednostka

zmiana konformacji:

Priony

20

Białka opiekuńcze (szaperony) nadzorują prawidłowe fałdowanie

Rola białek opiekuńczych w fałdowaniu białek

03. Biochemia - białka

Tematy do zapamiętania

1. Aminokwasy: struktura i funkcja.
2. Aminokwasy: alifatyczne, polarne, zasadowe, kwaśne.
3. Wiązanie peptydowe.
4. Białka: struktura pierwszo-, drugo-, trzecio- i czwartorzędowa.
5. Chomatografia i elektroforeza.
6. Drugorzędowa struktura białek: helisa

α

αα

α

i harmonijka

ββββ

.

7. Keratyna: struktura i funkcja.
8. Kolagen: struktura i funkcja.
9. Rola witaminy C.