Kierunki rozwoju chemii analitycznej
oznaczanie coraz ni\
szych stÄ™\
eń
w próbkach o zło\
onej matrycy
Walidacja metod analitycznych
przy bardzo małej objętości próbki
Raport z walidacji
Małgorzata Jakubowska
Problem:
Katedra Chemii Analitycznej WIMiC AGH
kontrola i zapewnienie jakości uzyskiwanych wyników
Przykłady rozrzutu wyników analitycznych obserwowane
Elementy systemów jakości
w porównaniach międzylaboratoryjnych na przestrzeni
stosowanie odpowiedniej atestowanych metod
kilkunastu lat
analitycznych (walidacja metod) Liczba
Materiał Pierwiastek Rozstęp wyników Rok
laboratoriów
prowadzenie analiz w profesjonalny sposób (laboratoria
Ag 4
µ
0,006  0,1 µg/g
µ
µ
Olej opałowy 1973
akredytowane)
Hg 4
0,005  0,4 µg/g
µ
µ
µ
Węgiel K 8 1974
µ
20  22000 µg/g
µ
µ
stosowanie wzorców i materiałów odniesienia o znanym
Mleko w Cd 8 1,10  1660 ng/g
składzie i czystości
Co 18
proszku 0,004  51,5 µg/g 1980
µ
µ
µ
Cr 16
IAEA A-11
µ
µ
µ
systematyczna kontrola uzyskiwanych wyników pomiarów. 0,016  1160 µg/g
Mleko w Ni 4 22,1  500 ng/g
proszku Pb 4 43  300 ng/g 1987
IAEA A-11
Cr 43
0,038  11,6 µg/g
µ
µ
µ
Liście tytoniu
Cs 17
0,117  11,6 µg/g
µ
µ
µ
typu Oriental 1992
Na 43
48,2  8083 µg/g
µ
µ
µ
CTA-OTL-1
Pb 40
0,051  19,5 µg/g
µ
µ
µ
Ilustracja pojęć:
Wnioski
zasada pomiaru,
rozstęp wyników dostarczonych przez laboratoria
metoda
uczestniczące w porównaniach międzylaboratoryjnych
analityczna oraz
często sięga kilku rzędów wielkości
postępowanie
za tak znaczny rozrzut wyników odpowiedzialne są błędy analityczne
analityczne.
1
Podczas wykonywania walidacji nale\
y:
Walidacja metod analitycznych
określić, które parametry charakteryzujące metodę
(według ISO)
powinny być wyznaczone
to proces ustalania parametrów charakteryzujących
wyznaczyć wartości tych parametrów
sprawność działania i ograniczeń metody oraz sprawdzenie
na tej podstawie określić czy metoda spełnia stawiane jej
jej przydatności do określonych celów.
wymagania zwiÄ…zane z zamierzonym zastosowaniem
wyników analitycznych.
W efekcie wykonania walidacji mo\
na uzyskać pewność, \
e
proces analizy przebiega w sposób rzetelny i precyzyjnie
oraz daje wiarygodne wyniki.
WalidacjÄ™ wykonujemy gdy:
Warunki uzyskania wiarygodnych wyników walidacji:
opracowywana jest nowa metoda analityczna
stosowanie substancji porównawczych i pomocniczych o
odpowiedniej, znanej czystości (certyfikowane)
prowadzone są próby rozszerzenia zakresu stosowalności
znanej metody analitycznej (np. do oznaczania znanego
stosowanie sprawdzonej aparatury
analitu do próbek o innej matrycy)
wykonanie badań przez personel o odpowiednich
kontrola jakości stosowanej metody wykazała zmienność jej
kwalifikacjach
parametrów w czasie
dokumentowanie ka\
dego etapu procesu walidacyjnego.
dana metoda analityczna ma być wykorzystywana w innym
laboratorium
przeprowadza się porównanie danej metody z inną metoda
odniesienia.
Proces walidacji składa się zazwyczaj z następujących etapów:
Parametry brane pod uwagÄ™ podczas walidacji:
określenie przeznaczenia metody analitycznej i jej zakresu,
specyficzność/selektywność
definicja testowanych parametrów analitycznych oraz
kryteria akceptacji, precyzja (powtarzalność i odtwarzalność)
opracowanie planu eksperymentów walidacyjnych,
dokładność
sprecyzowanie charakterystyki sprzętu,
zakres metody
przygotowanie wzorców oraz odczynników,
liniowość
eksperymenty walidacyjne z ewentualną korektą parametrów
metody,
granica wykrywalności
obliczenia, interpretacja wyników,
granica oznaczalności
sprawdzenie kryteriów akceptacji,
elastyczność.
opracowanie standardowej procedury operacyjnej dla
badanej metodyki,
określenie kryteriów rewalidacji,
sporzÄ…dzenie raportu.
2
Przeprowadzenie procesu walidacji wymaga zastosowania:
Specyficzność/selektywność:
specyficzność - jedynie analit jest z
ródłem niezakłóconego
ślepych próbek ( w tym tak\
e ślepych próbek
sygnału analitycznego, zaś interferencje nie występują
odczynnikowych)
selektywność - zdolność jednoznacznego określenia
roztworów wzorcowych (roztworów kalibracyjnych, próbek
substancji analizowanej w obecności składników, które
testowych)
mogą być zawarte w próbce, np. substancji pomocniczych,
próbek ze znaną ilością dodanego analitu (wzbogaconych
zanieczyszczeń, itd.
w analit)
badanie prowadzimy dla próbki zawierającej testowany
powtórzeń pomiaru
składnik (test pozytywny) i próbki nie zawierającej
analizowanej substancji (test negatywny).
analizy statystycznej zbiorów wyników.
W przypadku, gdy nie jest mo\
liwe udowodnienie specyficzności/selektywności
danej metody analitycznej, nale\
y zastosować kombinację dwu lub więcej
metod analitycznych by osiągnąć odpowiedni poziom pewności; muszą to być
metody niezale\
ne, dobrze scharakteryzowane.
Precyzja:
Powtarzalność :
stopień zgodności między pojedynczymi wynikami analizy
wyra\
a precyzję oznaczeń wykonanych w krótkim odstępie
(rozrzut wyników), gdy dana procedura jest stosowana dla
czasu, przez tego samego analityka i w tych samych
wielokrotnie powtarzanych, niezale\
nych oznaczeń
warunkach (te same odczynniki, ten sam sprzęt)
jednorodnej próbki
nale\
y wykonać minimum 6 powtórzeń dla poziomu
najczęściej miarą precyzji jest odchylenie standardowe S,
stÄ™\
enia 100% lub po trzy powtórzenia dla ka\
dego z
względne odchylenie standardowe RSD lub współczynnik
minimum trzech poziomów stę\
eń w zakresie metody
zmienności CV
(zalecane 50  150% nominalnego stÄ™\
enia)
obejmuje dwa pojęcia: powtarzalność i odtwarzalność.
wyznacza się wartość średnią, przedział ufności,
odchylenie standardowe, względne odchylenie
Kryteria akceptacji
standardowe oraz współczynnik zmienności uzyskanych
CV wyników zawartości składnika głównego nie powinno być
wyników.
większe ni\
3%
CV wyników oznaczania zawartości składników na poziomie
śladowym nie powinno być większe ni\
15%.
Dokładność:
Odtwarzalność:
zgodność między wartością rzeczywistą (zawartością,
pozwala ocenić, czy metoda prowadzi do tych samych
stÄ™\
eniem) a wartością będącą wynikiem analizy
rezultatów w ró\
nych laboratoriach z ró\
nymi analitykami,
miarą dokładności metody analitycznej jest wielkość jej
na innym sprzęcie i w innych warunkach, z zachowaniem
błędu systematycznego
parametrów wymaganych w opisie metody
metoda niedokładna mo\
e być obarczona błędem
badania sÄ… prowadzone analogicznie jak w przypadku
systematycznym stałym (niezale\
nym od poziomu
powtarzalności
zawartości oznaczanego składnika) i zmiennym (zale\
nym
wyznacza się wartość średnią, przedział ufności, odchylenie od stę\
enia oznaczanego składnika)
standardowe, względne odchylenie standardowe oraz
powinna być oszacowana na podstawie minimum 9
współczynnik zmienności uzyskanych wyników.
wyników oznaczeń dla minimum trzech ró\
nych poziomów
stÄ™\
eń z badanego zakresu (np. trzykrotne oznaczenie dla
trzech poziomów)
najczęściej wynik przedstawia się jako błąd bezwzględny
lub względny.
3
Szacowanie dokładności metody :
Dokładność mo\
e być przedstawiona jako procent
przez analizę próbki o znanym stę\
eniu (np. certyfikowany odzysku, który oblicza się wg wzoru:
materiał odniesienia) i porównanie wyników uzyskanych
xi
walidowaną metodą z wartością prawdziwą
*100%, gdzie
µ
przez porównanie wyników uzyskanych walidowaną metodą
z wynikami otrzymanymi metodą odniesienia, której xi  oznaczona ilość analitu w badanej próbce,
dokładność jest znana
µ- znana ilość analitu w badanej próbce
przez dodanie znanej ilości analitu do badanego produktu, a
następnie jego oznaczenie sprawdzaną metodą.
Kryteria akceptacji
Odzysk powinien wynosić 95  105% w przypadku składnika
głównego i 80  120% dla składników na poziomie śladowym
(wartości te zale\
ą między innymi od stę\
enia analitu w
badanej próbie i metody badania).
Liniowość:
Precyzja i dokładność metod analitycznych zdolność do uzyskiwania wyników pomiaru analitycznego
wprost proporcjonalnych do stÄ™\
enia (zawartości) substancji
oznaczanej w próbce, w określonym zakresie  zgodnie z
wyznaczonym równaniem matematycznym y = ax+b
zale\
ność między obu zmiennymi charakteryzuje
współczynnik korelacji r
liniowość wykazuje się przez analizę próbek o stę\
eniach
analitu, obejmujÄ…cych deklarowany zakres stÄ™\
eń metody
nale\
y wykonać badanie minimum 5-ciu serii wzorców (3-6
powtórzeń), których stę\
enia obejmujÄ… 80-120% stÄ™\
enia
a) metoda dokładna i precyzyjna spodziewanego w próbce.
b) metoda precyzyjna ale mało dokładna
c) metoda mało precyzyjna ale dokładna Kryterium akceptacji:
d) metoda mało dokładna i mało precyzyjna
w przypadku oznaczania substancji głównej współczynnik r
powinien być większy od 0,995, w przypadku oznaczania
śladów powinien być większy od 0,98.
Granica wykrywalności (DL)
Liniowość:
jest to najmniejsza ilość (stę\
enie) badanej substancji w
próbce, które mo\
e być wykryta, lecz niekoniecznie
0,30
oznaczona z odpowiednią dokładnością.
y = 0,0085x + 0,00235
0,25
Granica oznaczalności (QL)
r = 0,99662
jest to najmniejsza ilość (stę\
enie) badanej substancji w
0,20
próbce, jaka mo\
e być ilościowo oznaczona z odpowiednią
precyzją i dokładnością.
0,15
0,10
3.3* S 10* S
DL = QL =
0,05
b b
0,00
0 20 40 60 80 100 120
S  odchylenie standardowe ślepej próby
x,odwa\
ka badanej próbki [mg]
b  nachylenie prostej kalibracji
4
y,zmierzony sygnał
Zakres:
Elastyczność (stabilność metody):
przedział między minimalną i maksymalną zawartością
badanie elastyczności metody powinno udowodnić
(stÄ™\
eniem) substancji aktywnej w badanej próbie, w
niezawodność analizy po wprowadzeniu niewielkich
którym metoda analityczna ma odpowiednią liniowość,
celowych zmian parametrów metody
dokładność i precyzję.
jeśli pomiar jest wra\
liwy na zmianę warunków
analitycznych, warunki te powinny być odpowiednio
Minimalny zakres stosowania metody analitycznej powinien
kontrolowane lub dokładnie opisane w procedurze.
wynosić (kryteria akceptacji):
dla zawartości substancji głównej  od 80% do 120%
deklarowanej ilości analitu w badanej próbie
w przypadku oznaczania substancji na poziomie
śladowym zakres powinien wynosić od 10% do 120%
maksymalnej dopuszczalnej zawartości tej substancji
określonej w specyfikacji.
Raport z walidacji metod analitycznych (wykonany po
zakończeniu prac laboratoryjnych) powinien zawierać:
przedmiot i zakres walidacji
rodzaj oznaczanych związków i matrycy
opis metody
kryteria akceptacji
stosowane odczynniki, substancje porównawcze i wzorce
Raport walidacyjny
opis aparatury (producent, typ)
względy bezpieczeństwa
parametry pomiaru
opis przeprowadzonego eksperymentu
postępowanie statystyczne i obliczenia
reprezentatywne wykresy
kryteria rewalidacji
podsumowanie i wnioski.
Raport walidacyjny Raport walidacyjny
2. Wybór optymalnych warunków pomiaru
1. Oznaczana metoda analityczna
badania jakie wykonano w celu określenia
ogólne informacje o metodzie i zastosowanej
optymalnych warunków pomiaru
aparaturze z podaniem jej typu
parametry podlegajÄ…ce modyfikacji
roztwory wzorcowe
wyniki osobno dla ka\
dego zmienianego parametru (w
rozwory badane
tabeli  wartość parametru, wyniki  np. 7 powtórzeń,
wykonanie pomiaru.
średnia, odchylenie standardowe)
wnioski.
5
Raport walidacyjny Raport walidacyjny
Przykład: Dobór optymalnego przepływu acetylenu (fragment 3. Zało\
enia walidacyjne
tabeli wyników)
3.1. Specyficzność/selektywność
opis pomiarów jakie nale\
y wykonać
Numer Średnia Odchylenie wymagane wzorce wraz z określeniem stę\
eń
Absorbancja
poziomu absorbancja standardowe
sposób obliczenia wyniku
0.051
kryterium akceptacji.
0.052
3.2. Powtarzalność
0.050
2
0.047 3.3. Precyzja pośrednia
0.049
3.4. Dokładność
0.076
3.5. Liniowość
0.077
3.6. Zakres metody
0.080
4
3.7. Granica oznaczalności.
0.077
0.078
Raport walidacyjny Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych Przykład. Badanie wpływu Na na wynik oznaczenia Ca
metodÄ… ASA.
4.1. Specyficzność/selektywność
Ró\
nica średnich
opis pomiarów jakie wykonano Stosunek
Åšrednia absorbancji wzorca bez Kryterium
stÄ™\
eń
absorbancja dodatku Na i wzorca z akceptacji
Na:Ca
lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem
dodatkiem Na
stÄ™\
eń
0:1 0.163 0.000
wyniki pomiarów
1:10 0.159 0.004
wyniki obliczeń
1:5 0.165 0.002
informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
0.006
1:2 0.168 0.005
1:1 0.169 0.006
10:1 0.186 0.023
Raport walidacyjny Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych Przykład. Badanie powtarzalności oznaczania Ca metodą
ASA.
4.2. Powtarzalność
StÄ™\
e
opis pomiarów jakie wykonano CV
nie A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A S
[%]
[mg/l]
lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem
1 0.067 0.068 0.071 0.070 0.069 0.071 0.070
stÄ™\
eń
wyniki pomiarów 2 0.110 0.107 0.110 0.107 0.109 0.110 0.109
wyniki obliczeń 3
informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
4
5
7.5
6
Raport walidacyjny Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych 4. Wyniki testów walidacyjnych
4.4. Dokładność
4.2. Precyzja pośrednia
opis pomiarów jakie wykonano
tak jak powtarzalność ale dwóch ró\
nych dniach lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem
stÄ™\
eń
wyniki pomiarów
obliczony wynik wraz z podaniem poziomu
niepewności
pozostałe wyniki obliczeń
informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
Raport walidacyjny Raport walidacyjny
Przykład. Badanie dokładności oznaczeania Ca metoda 4. Wyniki testów walidacyjnych
ASA.
4.5. Liniowość
StÄ™\
enie Średnia Średnie Stopień
Absorbancja
opis pomiarów jakie wykonano
[mg/l] absorbancja stÄ™\
enie odzysku [%]
0.134
lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem
0.132
stÄ™\
eń
0.133
2.5
wyniki pomiarów
0.132
0.133
wyniki obliczeń (współczynniki prostej kalibracji,
0.226
współczynnik korelacji)
0.228
wykres prostej kalibracji
0.224
4.5
0.225
informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
0.228
Prosta kalibracji: y=0.0485x+0.0075
Raport walidacyjny Raport walidacyjny
Przykład. Badanie liniowości oznaczania Ca metodą ASA. 4. Wyniki testów walidacyjnych
4.6. Zakres metody
StÄ™\
enie [mg/l] Åšrednia absorbancja
informacja jak obliczono zakres metody
0 0.000
uzyskany wynik (tj. zakres)
1 0.059
informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
2 0.109
3 0.154
4 0.203
5 0.250
7.5 0.368
7
Raport walidacyjny Raport walidacyjny
4. Wyniki testów walidacyjnych 5. Wnioski końcowe
4.7. Granica oznaczalności informacja czy walidacja została zakończona
wynikiem pozytywnym i metoda mo\
e być
informacja jak obliczono granicę oznaczalności
stosowana.
uzyskany wynik (tj. DL)
informacja czy spełnione kryterium akceptacji.
KONIEC RAPORTU
Wykonał: xxx
Dziękuję za uwagę!
8