Biochemia Żywności 

              BIOTECHNOLOGIA 

     Ćwiczenie 5i6 

 

 

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie  

 

      Katedra Biotechnologii Żywności 

 

1 

 

Ćwiczenie 6 

 

Temat: STARZENIE TKANEK ROŚLINNYCH.  

CIEMNIENIE ENZYMATYCZNE. 

 

Część praktyczna 

 
Odczynniki: 

  bufor octanowy 0,1 M , pH 5,3 
  bufor cytrynianowo- fosforanowy 0,1 M, pH 6,6 
 

roztwór benzydyny 0,2 % w buforze octanowym 0,1 M, pH 5,3 

 

roztwór kwasu askorbinowego w wodzie 0,2% 

  nadtlenek wodoru 0,3% 
  kwas chlorogenowy w buforze cytrynianowo- fosforanowym 0,1 M o pH 6,6 
 

etanol skażony 96 % 

  etanol 80 % - 100 cm

3

 

 

25 % węglan sodowy 

 

odczynnik Folina, rozcieńczony wodą destylowaną w stosunku 1:1 

  kwas kawowy 50 mg% w etanolu 96% 

 
 
Analizy: 
1. OZNACZENIE AKTYWNOŚCI PEROKSYDAZY METODĄ TESTU BENZYDYNOWO- 
ASKORBINOWEGO 

 

Odważyć  5  g  startej  marchwi  bezpośrednio  w  schłodzonym  moździerzu,  dodać  odrobinę 

piasku i ucierać z 5 cm

3

 buforu octanowego przez 2 min, po tym czasie dodać kolejne 5 cm

3

 buforu 

i  ucierać  jeszcze  3  min.  Dokładnie  roztartą  marchew  przenieść  do  naczyńka  wirówkowego 
ilościowo,  przemywając  moździerz  5  cm

3

  buforu  octanowego.  Wirować  przy  4,5  tys.  obrotów/ 

minutę  przez  10  min.  Supernatant  przesączyć  do  małych  kolbek  stożkowych.  Ekstrakt 
enzymatyczny do czasu przeprowadzenia analizy umieścić w lodówce. 

Do  oznaczenia  aktywności  peroksydazy  pobrać  2  cm

3

  ekstraktu  enzymatycznego  do 

probówki,  dodać  1  cm

3

  roztworu  benzydyny  i  1  cm

3

  kwasu  askorbinowego.  Próbkę  ogrzewać  w 

łaźni wodnej, w 30

o

C. Po chwili dodać 1 cm

3

 0,3% nadtlenku wodoru i włączyć stoper. Mieszając 

zawartość probówki (przez wstrząsanie) mierzyć czas potrzebny do zmiany zabarwienia mieszaniny 
reakcyjnej  na  kolor  niebieski.  W  tym  momencie  zatrzymać  stoper  i  odczytać  czas  (oznaczenie 
wykonać w dwóch powtórzeniach). 

Aktywność peroksydazy wyrazić w μg kwasu askorbinowego utlenionego/sek/100 g ś.m.. Jest 

to tzw. bezwzględna aktywność peroksydazy (suma aktywności peroksydaz). 

 
 

 
2. OZNACZENIE AKTYWNOŚCI POLIFENOLOOKSYDAZY  

 

Odważyć  5  g  startej  marchwi  bezpośrednio  w  schłodzonym  moździerzu,  dodać  odrobinę 

piasku  i  ucierać  z  5  cm

3

  buforu  cytrynianowo-  fosforanowego  przez  2  min,  po  tym  czasie  dodać 

kolejne 5  cm

3

  buforu i ucierać jeszcze 3 min. Dokładnie roztartą marchew przenieść do naczyńka 

wirówkowego  ilościowo,  przemywając  moździerz  5  cm

3

  buforu  cytrynianowo-  fosforanowego. 

Wirować  przy  4,5  tys.  obrotów/  minutę  przez  10  min.  Supernatant  przesączyć  do  małych  kolbek 
stożkowych. Ekstrakt enzymatyczny do czasu przeprowadzenia analizy umieścić w lodówce. 

Biochemia Żywności 

              BIOTECHNOLOGIA 

     Ćwiczenie 5i6 

 

 

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie  

 

      Katedra Biotechnologii Żywności 

 

2 

Do oznaczenia aktywności polifenolooksydazy pobrać 0,5 cm

3

 ekstraktu enzymatycznego do 

probówki, dodać 1,5 cm

3

 buforu cytrynianowo- fosforanowego i umieścić na chwilę w łaźni wodnej 

w  temperaturze  30

o

C.  Następnie  dodać  1  cm

3

  kwasu  chlorogenowego,  jednocześnie  włączając 

stoper. Zawartość probówki dokładnie wymieszać i mierzyć absorbancję mieszaniny dokładnie co 
15  sekund  przez  2  minuty  od  chwili  dodania  do  enzymu  substratu  przy  długości  fali  420  nm. 
Oznaczenie wykonać w dwóch powtórzeniach. 

Aktywność enzymu wyrazić w J/ 100 g ś.m., gdzie 1 J (jednostka) jest to przyrost absorbancji 

mierzonej przy długości fali 420 nm o 0,1 na minutę w temperaturze 30

o

C. 

 
3. OZNACZENIA ZAWARTOŚCI FENOLI ROZPUSZCZALNYCH (SUMY FENOLI) 

 

20  g  marchwi  startej  na  tarce  zalać  80  cm

3

  96%  etanolu  i  gotować  przez  15  min.  pod 

chłodnicą zwrotną. Po schłodzeniu próbkę homogenizować przez 3 min. Następnie wirować przez 
10 min przy 4 tys. obrotów na minutę. Supernatant zdekantować do kolby miarowej na 100 cm

3

 i 

dopełnić  do  kreski  80  %  etanolem.  Otrzymany  20%  ekstrakt  służy  do  oznaczenia  sumy  fenoli. 
Oznaczenie wykonać w dwóch powtórzeniach. 

5 cm

3

 ekstraktu etanolowego rozcieńczonego wodą destylowaną do stężenia 2% zadać 0,5 ml 

25%  węglanu  sodowego  i  0,25  ml  odczynnika  Folina.  Po  dodaniu  odczynnika  Folina  próbki 
natychmiast wymieszać. Po 15 minutach mierzyć absorbancję błękitnego kompleksu (wobec wody 
destylowanej) przy długości fali 760 nm. Zawartość fenoli obliczyć w oparciu o krzywą wzorcową i 
wyrazić w mg/ 100 g ś.m. 

 

Sporządzenie krzywej wzorcowej 

Roztwory wzorców sporządzić wg poniższej tabelki: 

 

 

kwas kawowy 3 mg % 

(cm

3

) 

woda (cm

3

) 

wzorzec (mg %) 

0 

5 

0 

0,2 

4,8 

0,12 

0,5 

4,5 

0,3 

1 

4 

0,6 

1,5 

3,5 

0,9 

 

 
Do  roztworów  wzorca  wprowadzić  0,5  cm

3

  25%  węglanu  sodowego  i  0,25  cm

3

  odczynnika 

Folina. Postępować jak z próbami właściwymi.