Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 5i6

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

1

Ćwiczenie 6

Temat: STARZENIE TKANEK ROŚLINNYCH.

CIEMNIENIE ENZYMATYCZNE.

Część praktyczna

Odczynniki:

bufor octanowy 0,1 M , pH 5,3
bufor cytrynianowo- fosforanowy 0,1 M, pH 6,6

roztwór benzydyny 0,2 % w buforze octanowym 0,1 M, pH 5,3

roztwór kwasu askorbinowego w wodzie 0,2%

nadtlenek wodoru 0,3%
kwas chlorogenowy w buforze cytrynianowo- fosforanowym 0,1 M o pH 6,6

etanol skażony 96 %

etanol 80 % - 100 cm

3

25 % węglan sodowy

odczynnik Folina, rozcieńczony wodą destylowaną w stosunku 1:1

kwas kawowy 50 mg% w etanolu 96%

Analizy:
1. OZNACZENIE AKTYWNOŚCI PEROKSYDAZY METODĄ TESTU BENZYDYNOWO-
ASKORBINOWEGO

Odważyć 5 g startej marchwi bezpośrednio w schłodzonym moździerzu, dodać odrobinę

piasku i ucierać z 5 cm

3

buforu octanowego przez 2 min, po tym czasie dodać kolejne 5 cm

3

buforu

i ucierać jeszcze 3 min. Dokładnie roztartą marchew przenieść do naczyńka wirówkowego
ilościowo, przemywając moździerz 5 cm

3

buforu octanowego. Wirować przy 4,5 tys. obrotów/

minutę przez 10 min. Supernatant przesączyć do małych kolbek stożkowych. Ekstrakt
enzymatyczny do czasu przeprowadzenia analizy umieścić w lodówce.

Do oznaczenia aktywności peroksydazy pobrać 2 cm

3

ekstraktu enzymatycznego do

probówki, dodać 1 cm

3

roztworu benzydyny i 1 cm

3

kwasu askorbinowego. Próbkę ogrzewać w

łaźni wodnej, w 30

o

C. Po chwili dodać 1 cm

3

0,3% nadtlenku wodoru i włączyć stoper. Mieszając

zawartość probówki (przez wstrząsanie) mierzyć czas potrzebny do zmiany zabarwienia mieszaniny
reakcyjnej na kolor niebieski. W tym momencie zatrzymać stoper i odczytać czas (oznaczenie
wykonać w dwóch powtórzeniach).

Aktywność peroksydazy wyrazić w μg kwasu askorbinowego utlenionego/sek/100 g ś.m.. Jest

to tzw. bezwzględna aktywność peroksydazy (suma aktywności peroksydaz).

2. OZNACZENIE AKTYWNOŚCI POLIFENOLOOKSYDAZY

Odważyć 5 g startej marchwi bezpośrednio w schłodzonym moździerzu, dodać odrobinę

piasku i ucierać z 5 cm

3

buforu cytrynianowo- fosforanowego przez 2 min, po tym czasie dodać

kolejne 5 cm

3

buforu i ucierać jeszcze 3 min. Dokładnie roztartą marchew przenieść do naczyńka

wirówkowego ilościowo, przemywając moździerz 5 cm

3

buforu cytrynianowo- fosforanowego.

Wirować przy 4,5 tys. obrotów/ minutę przez 10 min. Supernatant przesączyć do małych kolbek
stożkowych. Ekstrakt enzymatyczny do czasu przeprowadzenia analizy umieścić w lodówce.

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 5i6

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

2

Do oznaczenia aktywności polifenolooksydazy pobrać 0,5 cm

3

ekstraktu enzymatycznego do

probówki, dodać 1,5 cm

3

buforu cytrynianowo- fosforanowego i umieścić na chwilę w łaźni wodnej

w temperaturze 30

o

C. Następnie dodać 1 cm

3

kwasu chlorogenowego, jednocześnie włączając

stoper. Zawartość probówki dokładnie wymieszać i mierzyć absorbancję mieszaniny dokładnie co
15 sekund przez 2 minuty od chwili dodania do enzymu substratu przy długości fali 420 nm.
Oznaczenie wykonać w dwóch powtórzeniach.

Aktywność enzymu wyrazić w J/ 100 g ś.m., gdzie 1 J (jednostka) jest to przyrost absorbancji

mierzonej przy długości fali 420 nm o 0,1 na minutę w temperaturze 30

o

C.

3. OZNACZENIA ZAWARTOŚCI FENOLI ROZPUSZCZALNYCH (SUMY FENOLI)

20 g marchwi startej na tarce zalać 80 cm

3

96% etanolu i gotować przez 15 min. pod

chłodnicą zwrotną. Po schłodzeniu próbkę homogenizować przez 3 min. Następnie wirować przez
10 min przy 4 tys. obrotów na minutę. Supernatant zdekantować do kolby miarowej na 100 cm

3

i

dopełnić do kreski 80 % etanolem. Otrzymany 20% ekstrakt służy do oznaczenia sumy fenoli.
Oznaczenie wykonać w dwóch powtórzeniach.

5 cm

3

ekstraktu etanolowego rozcieńczonego wodą destylowaną do stężenia 2% zadać 0,5 ml

25% węglanu sodowego i 0,25 ml odczynnika Folina. Po dodaniu odczynnika Folina próbki
natychmiast wymieszać. Po 15 minutach mierzyć absorbancję błękitnego kompleksu (wobec wody
destylowanej) przy długości fali 760 nm. Zawartość fenoli obliczyć w oparciu o krzywą wzorcową i
wyrazić w mg/ 100 g ś.m.

Sporządzenie krzywej wzorcowej

Roztwory wzorców sporządzić wg poniższej tabelki:

kwas kawowy 3 mg %

(cm

3

)

woda (cm

3

)

wzorzec (mg %)

0

5

0

0,2

4,8

0,12

0,5

4,5

0,3

1

4

0,6

1,5

3,5

0,9

Do roztworów wzorca wprowadzić 0,5 cm

3

25% węglanu sodowego i 0,25 cm

3

odczynnika

Folina. Postępować jak z próbami właściwymi.