Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 4
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
1
Ćwiczenie 4
Temat: KWAS ASKORBINOWY
Część teoretyczna
Kwas L- askorbinowy jak również kwas L- dehydroaskorbinowy są związkami biologicznie
czynnymi, wykazują aktywność witaminy C. Pod względem chemicznym kwas L- askorbinowy jest
laktonem endiolu kwasu 2- okso- L- gulonowego. W organizmie człowieka brakuje aktywności
ostatniego enzymu szlaku syntezy kwasu askorbinowego czyli dehydrogenazy kwasu L-
gulonowego. Awitaminoza wywołana niskim spożyciem witaminy C jest obecnie bardzo rzadka i
występuje najczęściej u alkoholików, osób palących tytoń, ludzi starszych i źle odżywianych.
Zapotrzebowanie dzienne organizmu człowieka na witaminę C jest o jeden, dwa rzędy wielkości
większe niż na inne witaminy i wynosi od 50- 100 mg.
Kwas askorbinowy występuje naturalnie w wielu owocach i warzywach. Syntetyczny kwas
askorbinowy jest klasyfikowany jako bezpieczny (GRAS - generally recognized as safe) dodatek do
żywności. Dodaje się go do wielu produktów żywnościowych, w których związek ten ma spełniać
wielorakie funkcje (tabela 1).
Tabela 1. Funkcje kwasu askorbinowego (naturalnie obecnego lub wprowadzanego) w żywności
funkcja
produkt żywnościowy
niezbędny składnik pokarmowy
soki i napoje owocowe, płatki śniadaniowe
antyoksydant (kontrola jełczenia oksydacyjnego i/lub
ciemnienia enzymatycznego)
jabłka, brzoskwinie, morele, ziemniaki, kalafior,
grzyby, oliwki, orzechy, pomidory, masło orzechowe,
frytki, napoje owocowe
antyoksydant (palmitynian askorbylu)
oleje roślinne (współdziała z tokoferolami, BHA,
BHT)
hamowanie korozji puszek
napoje bezalkoholowe
zachowanie smaku, zapachu, koloru
wina
zapobieganie powstawania czarnych plam
krewetki
hamowanie powstawania nitrozoamin
bekon
przyspieszanie powstawanie koloru mięsa
peklowanego
bekon, szynka, kiełbasa
polepszacz mąki
mąka pszenna stosowana do pieczenia
stabilizowanie koloru w mięsie pakowanym
świeża wieprzowina
Kwas askorbinowy występujący naturalnie to kwas L- askorbinowy. Znane są cztery
stereoizomery kwasu askorbinowego (rys.1). Kwas D- askorbinowy posiada 1/10 aktywności kwasu
L- askorbinowego, natomiast kwas izoaskorbinowy (erytorbowy) wykazuje jedynie 1/20
aktywności witaminowej kwasu L- askorbinowego.
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 4
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
2
kwas L- askorbinowy kwas D- askorbinowy
kwas D- izoaskorbinowy kwas L- izoaskorbinowy
(D- erytorbowy) (L- erytorbowy)
Rysunek 1.
Charakter kwasowy kwasowi askorbinowemu nadaje wodór grupy hydroksylowej przy węglu
3 (tabela 2).
Tabela 2. Chemiczne i fizyczne właściwości kwasu askorbinowego
związek o silnych właściwościach redukujących, antyoksydant
masa cząsteczkowa: 176
rozpuszczalność w wodzie: 33% w/v w 25
o
C
słaby kwas: pK
a1
= 4,2; pK
a2
= 11,8
Wybrane funkcje kwasu askorbinowego, stosowanego jako dodatek do żywności:
1. Zmiatacz tlenu. Żywność butelkowana lub puszkowana zawiera często trochę tlenu
cząsteczkowego, którego obecność zwykle jest niepożądana (tlen może powodować
jełczenie, utratę barwy). Dodatek kwasu askorbinowego może spowodować usunięcie tego
tlenu (rys. 2)
2. Zmiatacz wolnych rodników. Jon askorbinianowy jest zmiataczem wolnych rodników.
Silnie redukujące właściwości decydują o reaktywności wobec O
2
-•
, H
2
O
2,
•
OH, rodników
nadtlenkowych i tlenu singletowego. Może też reagować z rodnikiem tokoferylowym i
innymi rodnikami fenylowymi (rys. 3). Kwas askorbinowy działa synergistycznie z
witaminą E i innymi fenolowymi antyoksydantami, takimi jak BHA lub BHT.
3. Kontrola ciemnienia enzymatycznego. Kwas askorbinowy jest związkiem hamującym
proces ciemnienia enzymatycznego. Redukuje chinony powstałe na skutek aktywności
enzymatycznej polifenolooksydazy do wyjściowych fenoli (rys. 4).
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 4
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
3
Rysunek 2.
TOH + LOO
•
→ LOOH + TO
•
AH
-
+ TO
•
→ A
•
+ TOH
2 A
•
+ H
+
→ AH
-
+ DHA
(TOH- tokoferol, LOO
•
- rodnik nadtlenkowy, TO
•
- rodnik tokoferylowy, AH
—
jon askorbinianowy, A
•
- rodnik
askorbylow, DHA- kwas dehydroaskorbinowy)
Rysunek 3.
Rysunek 4.
Stabilność kwasu askorbinowego
Kwas askorbinowy jest bardzo stabilnym laktonem. Stabilność tę traci w momencie utlenienia
do kwasu dehydroaskorbinowego. Kwas dehydroaskorbinowy łatwo ulega hydrolizie do kwasu
diketogulonowego, który nie posiada aktywności witaminy C. Dlatego też proces utlenienia kwasu
askorbinowego wpływa degradująco na ten związek.
Degradacja kwasu askorbinowego przebiega wieloma szlakami. Zidentyfikowano przemiany
tlenowe i beztlenowe (rys. 5 ). W przypadku obecności tlenu przeważa ścieżka tlenowa.
Czynnikami, które mogą wpływać na szybkość degradacji są: temperatura, stężenie soli i cukrów,
pH, stężenie tlenu, metale (szczególnie żelazo i miedź) oraz enzymy.
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 4
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
4
O
O
-
O
O
H
O
H
OH
O
O
O
O
H
O
H
OH
O
O
O
H
O
H
O
O
O
2
H
2
O
2
M
n+
ka
tal
iza
to
r/
O
2
H
+
O
2
H
2
O
2
AH
O
H
2
O
H
O
OH
H
H
O
H
O
O
H
O
O
H
O
H
O
H
H
O
H
O
O
H
O
O
H
O
O
OH
H
H
O
H
H
CO
2
różne produkty w zależności od pH
środowiska
O
O
OH
O
H
H
O
H
C
H
3
O
O
O
OH
O
H
O
H
OH
H
H
O
H
OH
O
O
H
droga
beztl
enow
a
O
H
O
O
H
H
H
O
H
H
CO
2
H
2
O
H
+
2H
2
O
O
O
H
O
O
O
H
H
H
H
anion kwasu askorbinowego
rodnik askorbylowy
kwas dehydroaskorbinowy
kwas 2,3- dioksogulonowy
forma 3,4 endiolowa
L-erytropentozuloza (L- ksylozon)
kwas furanowy
3-hydroksy 2-piron
5-metylo- 4-hydroksy- 3 -(2H) furanon
kwas 2-okso-L-gulonowy (forma enolowa)
3-deoksy-L-erytropentozuloza
furfural
kwas 2,5- dihydro-2-furanowy
O
2
O
OH
O
O
H
kwas szczawiowy
kwas L-treonowy
O
OH
OH
H
O
H
H
O
H
HO
2
Rysunek 5.
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 4
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
5
Część praktyczna
Odczynniki:
roztwory wodne kwasu askorbinowego: 0,5 mg/ cm
3
10 mg/ cm
3
kwas szczawiowy 0, 25 mol/ dm
3
2,6 dichloroindofenol
roztwór siarczanu miedziowego CuSO
4
∙5H
2
O: 5 g/ 50 cm
3
bufor glicynowy 0,1 mol/ dm
3
pH 2,0
bufor glicynowy 0,1 mol/ dm
3
pH 8,6
HCl 1 mol/ dm
3
Materiał roślinny: kapusta biała
1. SPORZĄDZANIE KRZYWEJ WZORCOWEJ
Do 4 kolbek Erlenmayerek wlać 9 cm
3
kwasu szczawiowego i 1 cm
3
HCl 1 mol/ dm
3
. Do
poszczególnych kolbek dodać kwas askorbinowy o stężeniu 0,5 mg/ cm
3
w ilości: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0
cm
3
. Tak przygotowane roztwory miareczkować natychmiast 2,6- dichloroindofenolem do
wystąpienia lekko różowego zabarwienia, utrzymującego się przez 30 sekund.
Sporządzić krzywą wzorcową: wykres zależności objętości barwnika zużytego do
miareczkowania do miligramów kwasu askorbinowego.
2. WPŁYW PH NA STABILNOŚĆ KWASU ASKORBINOWEGO
Przygotować dwa roztwory kwasu askorbinowego:
A: 1,0 mg/ cm
3
kwasu askorbinowego w buforze glicynowym 0,1 mol/ dm
3
pH 2,0
B: 1,0 mg/ cm
3
kwasu askorbinowego w buforze glicynowym 0,1 mol/ dm
3
pH 8,6
Roztwory mieszać na mieszadle magnetycznym przez 24h w temperaturze pokojowej.
Oznaczyć zawartość kwasu askorbinowego w roztworach A i B, posługując się procedurą opisaną
w pkt. 1 (uwaga: do oznaczenia pobierać 1 cm
3
roztworów A i B). Wyniki wyrazić w mg/ cm
3
roztworu.
3. WPŁYW TEMPERATURY, PH I JONÓW MIEDZI CU
2+
NA STABILNOŚĆ KWASU
ASKORBINOWEGO
Sporządzić po 10 cm
3
następujących roztworów:
a) kwas askorbinowy w buforze glicynowym pH 2,0
b) kwas askorbinowy w buforze glicynowym pH 8,6
c) kwas askorbinowy w buforze glicynowym pH 2,0 + CuSO
4
d) kwas askorbinowy w buforze glicynowym pH 8,6 + CuSO
4
W tym celu do probówek (plastikowe z nakrętką) wlać 1 cm
3
kwasu askorbinowego o stężeniu 10
mg/ cm
3
, 0,5 cm
3
CuSO
4
(roztwory c i d) i dopełnić odpowiednim buforem do objętości 10 cm
3
.
Dobrze wymieszać. Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej, gotować 15 minut, schłodzić.
Posługując się procedurą opisaną w punkcie 1, oznaczyć zawartość kwasu askorbinowego w 1 cm
3
każdego roztworu (uwaga: do oznaczenia pobierać 1 cm
3
roztworów a i b, 1- 2 cm
3
roztworów c i
d).
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 4
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
6
4. WPŁYW GOTOWANIA NA ZAWARTOŚĆ KWASU ASKORBINOWEGO W
KAPUŚCIE
a) zagotować 100 cm
3
wody destylowanej w zlewce na 250 cm
3
. Dodać 5 g pokrojonej,
surowej kapusty i gotować przez 15 minut. Po tym czasie kapustę wyciągnąć z wody,
schłodzić i osuszyć powierzchniowo bibułą. Schłodzić również wodę pozostałą po
gotowaniu i zmierzyć jej objętość.
b) 5 g pokrojonej surowej kapusty umieścić w moździerzu. Dodać 10 cm
3
kwasu
szczawiowego, szczyptę piasku i ucierać przez 3 minuty. Po tym czasie dodać kolejne 10
cm
3
kwasu szczawiowego i ponownie ucierać. Obliczyć całkowitą objętość ekstraktu,
przyjmując, że surowa i ugotowana kapusta zawiera 92% wody.
c) ekstrakt przefiltrować przez bibułę Whatmana do probówki.
d) przenieść 5 cm
3
przesączu do kolbki Erlenmeyerki na 50 cm
3
. Dodać 10 cm
3
kwasu
szczawiowego i 1 cm
3
HCl 1 mol/ dm
3
. Miareczkować 2,6- dichloroindofenolem, aby
określić zawartość kwasu askorbinowego. Oznaczenia wykonać w dwóch powtórzeniach.
Zawartość kwasu askorbinowego wyrazić w mg/ 100 g kapusty.
e) czynności opisane w pkt. b- d powtórzyć dla kapusty ugotowanej.
f) do kolbki Erlenmeyerki na 50 cm
3
przenieść 5- 20 cm
3
wody po gotowaniu. Dodać 10 cm
3
kwasu szczawiowego i 1 cm
3
HCl 1 mol/ dm
3
. Mareczkować 2,6- dichloroindofenolem.
Oznaczenie wykonać w 2 powtórzeniach. Obliczyć całkowitą zawartość kwasu
askorbinowego w wodzie po gotowaniu.
g) obliczyć jaki procent zawartości kwasu askorbinowego w surowej kapuście stanowi
zawartość tego związku w kapuście ugotowanej i w wodzie po gotowaniu.
Rysunek 6. Reakcja kwasu askorbinowego z 2,6 dichlorofenoloindofenolem