Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 4

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

1

Ćwiczenie 4

Temat: KWAS ASKORBINOWY

Część teoretyczna

Kwas L- askorbinowy jak również kwas L- dehydroaskorbinowy są związkami biologicznie

czynnymi, wykazują aktywność witaminy C. Pod względem chemicznym kwas L- askorbinowy jest
laktonem endiolu kwasu 2- okso- L- gulonowego. W organizmie człowieka brakuje aktywności
ostatniego enzymu szlaku syntezy kwasu askorbinowego czyli dehydrogenazy kwasu L-
gulonowego. Awitaminoza wywołana niskim spożyciem witaminy C jest obecnie bardzo rzadka i
występuje najczęściej u alkoholików, osób palących tytoń, ludzi starszych i źle odżywianych.
Zapotrzebowanie dzienne organizmu człowieka na witaminę C jest o jeden, dwa rzędy wielkości
większe niż na inne witaminy i wynosi od 50- 100 mg.

Kwas askorbinowy występuje naturalnie w wielu owocach i warzywach. Syntetyczny kwas

askorbinowy jest klasyfikowany jako bezpieczny (GRAS - generally recognized as safe) dodatek do
żywności. Dodaje się go do wielu produktów żywnościowych, w których związek ten ma spełniać
wielorakie funkcje (tabela 1).

Tabela 1. Funkcje kwasu askorbinowego (naturalnie obecnego lub wprowadzanego) w żywności

funkcja

produkt żywnościowy

niezbędny składnik pokarmowy

soki i napoje owocowe, płatki śniadaniowe

antyoksydant (kontrola jełczenia oksydacyjnego i/lub

ciemnienia enzymatycznego)

jabłka, brzoskwinie, morele, ziemniaki, kalafior,

grzyby, oliwki, orzechy, pomidory, masło orzechowe,

frytki, napoje owocowe

antyoksydant (palmitynian askorbylu)

oleje roślinne (współdziała z tokoferolami, BHA,

BHT)

hamowanie korozji puszek

napoje bezalkoholowe

zachowanie smaku, zapachu, koloru

wina

zapobieganie powstawania czarnych plam

krewetki

hamowanie powstawania nitrozoamin

bekon

przyspieszanie powstawanie koloru mięsa

peklowanego

bekon, szynka, kiełbasa

polepszacz mąki

mąka pszenna stosowana do pieczenia

stabilizowanie koloru w mięsie pakowanym

świeża wieprzowina

Kwas askorbinowy występujący naturalnie to kwas L- askorbinowy. Znane są cztery

stereoizomery kwasu askorbinowego (rys.1). Kwas D- askorbinowy posiada 1/10 aktywności kwasu
L- askorbinowego, natomiast kwas izoaskorbinowy (erytorbowy) wykazuje jedynie 1/20
aktywności witaminowej kwasu L- askorbinowego.

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 4

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

2

kwas L- askorbinowy kwas D- askorbinowy

kwas D- izoaskorbinowy kwas L- izoaskorbinowy
(D- erytorbowy) (L- erytorbowy)

Rysunek 1.

Charakter kwasowy kwasowi askorbinowemu nadaje wodór grupy hydroksylowej przy węglu

3 (tabela 2).

Tabela 2. Chemiczne i fizyczne właściwości kwasu askorbinowego

związek o silnych właściwościach redukujących, antyoksydant

masa cząsteczkowa: 176

rozpuszczalność w wodzie: 33% w/v w 25

o

C

słaby kwas: pK

a1

= 4,2; pK

a2

= 11,8

Wybrane funkcje kwasu askorbinowego, stosowanego jako dodatek do żywności:

1. Zmiatacz tlenu. Żywność butelkowana lub puszkowana zawiera często trochę tlenu

cząsteczkowego, którego obecność zwykle jest niepożądana (tlen może powodować
jełczenie, utratę barwy). Dodatek kwasu askorbinowego może spowodować usunięcie tego
tlenu (rys. 2)

2. Zmiatacz wolnych rodników. Jon askorbinianowy jest zmiataczem wolnych rodników.

Silnie redukujące właściwości decydują o reaktywności wobec O

2

-•

, H

2

O

2,

•

OH, rodników

nadtlenkowych i tlenu singletowego. Może też reagować z rodnikiem tokoferylowym i
innymi rodnikami fenylowymi (rys. 3). Kwas askorbinowy działa synergistycznie z
witaminą E i innymi fenolowymi antyoksydantami, takimi jak BHA lub BHT.

3. Kontrola ciemnienia enzymatycznego. Kwas askorbinowy jest związkiem hamującym

proces ciemnienia enzymatycznego. Redukuje chinony powstałe na skutek aktywności
enzymatycznej polifenolooksydazy do wyjściowych fenoli (rys. 4).

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 4

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

3

Rysunek 2.




TOH + LOO

•

→ LOOH + TO

•

AH

-

+ TO

•

→ A

•

+ TOH

2 A

•

+ H

+

→ AH

-

+ DHA

(TOH- tokoferol, LOO

•

- rodnik nadtlenkowy, TO

•

- rodnik tokoferylowy, AH

—

jon askorbinianowy, A

•

- rodnik

askorbylow, DHA- kwas dehydroaskorbinowy)

Rysunek 3.

Rysunek 4.

Stabilność kwasu askorbinowego

Kwas askorbinowy jest bardzo stabilnym laktonem. Stabilność tę traci w momencie utlenienia

do kwasu dehydroaskorbinowego. Kwas dehydroaskorbinowy łatwo ulega hydrolizie do kwasu
diketogulonowego, który nie posiada aktywności witaminy C. Dlatego też proces utlenienia kwasu
askorbinowego wpływa degradująco na ten związek.

Degradacja kwasu askorbinowego przebiega wieloma szlakami. Zidentyfikowano przemiany

tlenowe i beztlenowe (rys. 5 ). W przypadku obecności tlenu przeważa ścieżka tlenowa.
Czynnikami, które mogą wpływać na szybkość degradacji są: temperatura, stężenie soli i cukrów,
pH, stężenie tlenu, metale (szczególnie żelazo i miedź) oraz enzymy.

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 4

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

4

O

O

-

O

O

H

O

H

OH

O

O

O

O

H

O

H

OH

O

O

O

H

O

H

O

O

O

2

H

2

O

2

M

n+

ka

tal

iza

to

r/

O

2

H

+

O

2

H

2

O

2

AH

O

H

2

O

H

O

OH

H

H

O

H

O

O

H

O

O

H

O

H

O

H

H

O

H

O

O

H

O

O

H

O

O

OH

H

H

O

H

H

CO

2

różne produkty w zależności od pH
środowiska

O

O

OH

O

H

H

O

H

C

H

3

O

O

O

OH

O

H

O

H

OH

H

H

O

H

OH

O

O

H

droga

beztl

enow

a

O

H

O

O

H

H

H

O

H

H

CO

2

H

2

O

H

+

2H

2

O

O

O

H

O

O

O

H

H

H

H

anion kwasu askorbinowego

rodnik askorbylowy

kwas dehydroaskorbinowy

kwas 2,3- dioksogulonowy

forma 3,4 endiolowa

L-erytropentozuloza (L- ksylozon)

kwas furanowy

3-hydroksy 2-piron

5-metylo- 4-hydroksy- 3 -(2H) furanon

kwas 2-okso-L-gulonowy (forma enolowa)

3-deoksy-L-erytropentozuloza

furfural

kwas 2,5- dihydro-2-furanowy

O

2

O

OH

O

O

H

kwas szczawiowy

kwas L-treonowy

O

OH

OH

H

O

H

H

O

H

HO

2

Rysunek 5.

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 4

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

5

Część praktyczna

Odczynniki:

roztwory wodne kwasu askorbinowego: 0,5 mg/ cm

3

10 mg/ cm

3

kwas szczawiowy 0, 25 mol/ dm

3

2,6 dichloroindofenol

roztwór siarczanu miedziowego CuSO

4

∙5H

2

O: 5 g/ 50 cm

3

bufor glicynowy 0,1 mol/ dm

3

pH 2,0

bufor glicynowy 0,1 mol/ dm

3

pH 8,6

HCl 1 mol/ dm

3

Materiał roślinny: kapusta biała


1. SPORZĄDZANIE KRZYWEJ WZORCOWEJ

Do 4 kolbek Erlenmayerek wlać 9 cm

3

kwasu szczawiowego i 1 cm

3

HCl 1 mol/ dm

3

. Do

poszczególnych kolbek dodać kwas askorbinowy o stężeniu 0,5 mg/ cm

3

w ilości: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0

cm

3

. Tak przygotowane roztwory miareczkować natychmiast 2,6- dichloroindofenolem do

wystąpienia lekko różowego zabarwienia, utrzymującego się przez 30 sekund.

Sporządzić krzywą wzorcową: wykres zależności objętości barwnika zużytego do

miareczkowania do miligramów kwasu askorbinowego.

2. WPŁYW PH NA STABILNOŚĆ KWASU ASKORBINOWEGO
Przygotować dwa roztwory kwasu askorbinowego:

A: 1,0 mg/ cm

3

kwasu askorbinowego w buforze glicynowym 0,1 mol/ dm

3

pH 2,0

B: 1,0 mg/ cm

3

kwasu askorbinowego w buforze glicynowym 0,1 mol/ dm

3

pH 8,6

Roztwory mieszać na mieszadle magnetycznym przez 24h w temperaturze pokojowej.

Oznaczyć zawartość kwasu askorbinowego w roztworach A i B, posługując się procedurą opisaną
w pkt. 1 (uwaga: do oznaczenia pobierać 1 cm

3

roztworów A i B). Wyniki wyrazić w mg/ cm

3

roztworu.

3. WPŁYW TEMPERATURY, PH I JONÓW MIEDZI CU

2+

NA STABILNOŚĆ KWASU

ASKORBINOWEGO

Sporządzić po 10 cm

3

następujących roztworów:

a) kwas askorbinowy w buforze glicynowym pH 2,0
b) kwas askorbinowy w buforze glicynowym pH 8,6
c) kwas askorbinowy w buforze glicynowym pH 2,0 + CuSO

4

d) kwas askorbinowy w buforze glicynowym pH 8,6 + CuSO

4

W tym celu do probówek (plastikowe z nakrętką) wlać 1 cm

3

kwasu askorbinowego o stężeniu 10

mg/ cm

3

, 0,5 cm

3

CuSO

4

(roztwory c i d) i dopełnić odpowiednim buforem do objętości 10 cm

3

.

Dobrze wymieszać. Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej, gotować 15 minut, schłodzić.
Posługując się procedurą opisaną w punkcie 1, oznaczyć zawartość kwasu askorbinowego w 1 cm

3

każdego roztworu (uwaga: do oznaczenia pobierać 1 cm

3

roztworów a i b, 1- 2 cm

3

roztworów c i

d).

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 4

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

6

4. WPŁYW GOTOWANIA NA ZAWARTOŚĆ KWASU ASKORBINOWEGO W
KAPUŚCIE

a) zagotować 100 cm

3

wody destylowanej w zlewce na 250 cm

3

. Dodać 5 g pokrojonej,

surowej kapusty i gotować przez 15 minut. Po tym czasie kapustę wyciągnąć z wody,
schłodzić i osuszyć powierzchniowo bibułą. Schłodzić również wodę pozostałą po
gotowaniu i zmierzyć jej objętość.

b) 5 g pokrojonej surowej kapusty umieścić w moździerzu. Dodać 10 cm

3

kwasu

szczawiowego, szczyptę piasku i ucierać przez 3 minuty. Po tym czasie dodać kolejne 10
cm

3

kwasu szczawiowego i ponownie ucierać. Obliczyć całkowitą objętość ekstraktu,

przyjmując, że surowa i ugotowana kapusta zawiera 92% wody.

c) ekstrakt przefiltrować przez bibułę Whatmana do probówki.

d) przenieść 5 cm

3

przesączu do kolbki Erlenmeyerki na 50 cm

3

. Dodać 10 cm

3

kwasu

szczawiowego i 1 cm

3

HCl 1 mol/ dm

3

. Miareczkować 2,6- dichloroindofenolem, aby

określić zawartość kwasu askorbinowego. Oznaczenia wykonać w dwóch powtórzeniach.
Zawartość kwasu askorbinowego wyrazić w mg/ 100 g kapusty.

e) czynności opisane w pkt. b- d powtórzyć dla kapusty ugotowanej.

f) do kolbki Erlenmeyerki na 50 cm

3

przenieść 5- 20 cm

3

wody po gotowaniu. Dodać 10 cm

3

kwasu szczawiowego i 1 cm

3

HCl 1 mol/ dm

3

. Mareczkować 2,6- dichloroindofenolem.

Oznaczenie wykonać w 2 powtórzeniach. Obliczyć całkowitą zawartość kwasu
askorbinowego w wodzie po gotowaniu.

g) obliczyć jaki procent zawartości kwasu askorbinowego w surowej kapuście stanowi

zawartość tego związku w kapuście ugotowanej i w wodzie po gotowaniu.

Rysunek 6. Reakcja kwasu askorbinowego z 2,6 dichlorofenoloindofenolem