1

Rola epidemiologii molekularnej w

ocenie czynników ryzyka występowania

chorób. Molekularne i cytogenetyczne

markery skutku biologicznego

i podatności osobniczej.

Epidemiologia

Analityczna – czynniki etiologiczne/

ryzyka

czynniki sprawcze, czynniki

osobnicze, ekspozycje środowiskowe,

styl życia

Opisowa- rozpowszechnienie choroby

Opis –w odniesieniu do osób, miejsca

i czasu, konsekwencje w odniesieniu

do populacji

Medycyna zapobiegawcza

Zdrowie publiczne

Przyczyna

Choroba

brak choroby

Epidemiologia

molekularna

?

Epidemiologia molekularna

• zajmuje się wpływem potencjalnych genetycznych

i środowiskowych czynników ryzyka, identyfikowanych na

poziomie molekularnym, na etiologię, rozpowszechnienie

i możliwość zapobiegania chorobom wśród osób

spokrewnionych i populacjach

• bazuje na epidemiologii klasycznej, ale wykorzystuje narzędzia

biologii molekularnej do oceny częstości występowania chorób

w populacji oraz do poszukiwania potencjalnych czynników

sprawczych

podstawowym założeniem jest istnienie kontinuum pomiędzy

narażeniem na czynniki toksyczne (kancerogeny), ich

metabolizmem (aktywacja lub deaktywacja), powstawaniem

adduktów z białkami lub kwasami DNA, zmianami w DNA

(uszkodzenia chromosomów, mutacje), gromadzeniem się

tych zmian i wreszcie pojawieniem się raka

Proces kancerogenezy w ujęciu

epidemiologii molekularnej

:

Znaczenie biologicznych markerów w pomiarze
ekspozycji i jej skutków (choroby)

dawka
wewnętrzna

dawka
biologicznie
skuteczna

wczesna reakcja
biologiczna

zmiana struktury
i funkcji

kliniczna postać
choroby

czynniki

środowiskowe

styl życia

EKSPOZYCJA

biomarkery
podatności

biomarkery
ekspozycji

biomarkery
skutku

addukty, wirusy

mutacje,

przeciwciała

geny, enzymy

diagnoza na poziomie

molekularnym

wg WHO

biomarkerem jest każdy pomiar interakcji

zachodzącej w systemach biologicznych z potencjalnymi

zagrożeniami, mogącymi mieć charakter chemiczny,

fizyczny lub biologiczny. Mierzona odpowiedź organizmu

wywołana tą interakcją może mieć charakter funkcjonalny,

fizjologiczny, biochemiczny na poziomie komórkowym lub

molekularny na poziomie sub-

komórkowym.

2

• Biomarkery ekspozycji są to obecne wewnątrz organizmu

mierzalne egzogenne substancje

lub ich metabolity lub też produkty

interakcji między czynnikiem szkodliwym i docelowymi komórkami lub

cząsteczkami.

• Biomarkery skutków to mierzalne biochemiczne, fizjologiczne,

behawioralne i inne

zmiany zachodzące wewnątrz organizmu, które - w

zależności od wielkości – mogą być rozpoznawane jako łączące się z już

obecnymi lub mogącymi się pojawić później zaburzeniami zdrowotnymi i

chorobami.

•Biomarkery wrażliwości są wskaźnikami wrodzonej lub nabytej

zdolności organizmu do odpowiedzi wywołanej ekspozycją na

specyficzny czynnik szkodliwy.

• biomarkery dawki wewnętrznej:

-

pomiar stężenia substancji egzogennej lub jej metabolitów w

poszczególnych tkankach (krew, mocz, mleko, płyn nasienny,

tkanki uzyskane za pomocą biopsji )

• biomarkery dawki biologicznie skutecznej:

-

oznaczanie adduktów substancji egzogennych lub ich

metabolitów z białkami lub DNA (krew, tkanki uzyskane za

pomocą biopsji, złuszczone komórki płuc)

Ocena ekspozycji

•addukty z białkami – brak systemów naprawczych -nie ulegają

naprawie:

-

głównie hemoglobina (erytrocyt żyje ~120 dni) - wskaźnik

narażenia skumulowanego; identyfikacja za pomocą

chromatografii gazowej z detekcją masową (GC-MS)

- albuminy (~ 28 dni)

metody immunochemiczne lub hydroliza przyłączonych związków

• addukty z DNA – charekter przedmutacyjny, mogą zostać

naprawione lub dać początekmutacjom

•Całkowita liczba LC ~ 50x10

9

, z tego tylko 2% LKOC, reszta w tkankach

i

narządach.

-LKOC to populacja

komórek o dominującej fazie G

0

, w

której procesy

biofizyczne i biochemiczne

są zminimalizowane.

•Skład LKO : L małe; 80 - 90% średnie; ~ 5%, duże do 15%,

~~70% LKOC to limfocyty-T,

pozostałe typu B,

T/B zmienia

się z wiekiem.

•W warunkach in vivo tylko 0.2% LKOC podlega stymulacji pod wpływem
antygenów i przechodzi do fazy syntezy DNA.

•Czas życia LC jest zróżnicowany:

-

90% LC jest długo życiowych (T

1/2

~ 3lata, kilka a nawet dziesiątki lat)

-

10 % jest krótko życiowych (T

1/2

~ 1-10 dni).

Limfocyty krwi obwodowej człowieka (LKOC)

•LKOC należą w 80% do grupy wymiennej, tzn opuszczają
krew obwodową, wędrują do śledziony, węzłów itp. i wracają do
KO.

 średni czas obecności "wędrującego" limfocytu w KO
~ 30 min.

 czas recyrkulacji grupy wymiennej ~ 12 godz,

Dlaczego Limfocyty krwi obwodowej człowieka (LKOC) informują o
uszkodzeniach DNA wywołanych ekspozycją środowiskową?

oznacza to, że uszkodzenie DNA prowadzące w konsekwencji
do mutacji lub aberracji chromosomowej wywołane
gdziekolwiek w organizmie, będzie prezentowane również w
krwi obwodowej człowieka

Ocena uszkodzeń DNA opiera się na ocenie obrazu w mikroskopie
fluorescencyjnym przy użyciu kamery cyfrowej i systemu automatycznej
analizy obrazu

% DNA

Moment ogonowy (tail moment )TM = %DNA x TL-DNA

TL-DNA

– długość ogona komety

Ocena uszkodzeń materiału genetycznego metodą

elektroforezy DNA jądrowego pojedynczych komórek

single cell gel electrophoresis - SCGE assay /COMET

3

Analiza cytogenetyczna
aberracji chromosomowych

Zaburzenia monitorowane w limfocytach krwi obwodowej:

II mitoza: częstość wymian chromatyd siostrzanych (SCE),
procent komórek ze znamiennie wyższym poziomem częstości wymian

(HFC – high frequency cells)

I mitoza: częstość aberracji chromosomowych (CSA), aberracji
chromatydowych (CTA), częstość wszystkich aberracji TAbF, procent
komórek z aberracjami - AbC.

OCENA PODATNOSCI

•ocena polimorfizmu genów odpowiedzialnych za procesy

biotransformacji i detoksykacji (transferaza S-glutationowa, N-

acetylotransferaza, indukcja enzymu CYP1A1)

• test kometowy zastosowany do oceny wydajności procesów

naprawczych

Wydajność naprawy DNA oceniona w oparciu o

odpowiedź komórek na dawkę pobudzającą

promieniowania i zmierzona szybką metodą kometową

może być pomocna w diagnozie który z pacjentów jest

bardziej podatny na terapię i jaką mocną dawkę można

dla niego zastosować

Epidemiologia molekularna

•Pozwala na lepsze zrozumienie patomechanizmów choroby

•określenie podatności genetycznej na podstawie markerów molekularnych,

a nie informacji zastępczych (np. rodzinna historia występowania choroby)

•poprawia trafność i redukuje błędy przy oszacowaniu narażenia

środowiskowego

• stwarza możliwość szacowania subklinicznych lub wczesnych wskaźników

choroby

• dostarcza nowych standardów dla epidemiologii opisowej : redukuje

niejednorodność w klasyfikacji choroby (testy molekularne stosowane do

identyfikacji przypadków choroby – grupy bardziej homogenne)

• poprawia dokładność badań analitycznych – wpływ czynników

genetycznych i środowiskowych oraz ich interakcji dla rozwoju choroby może

być znacznie precyzyjniej określony.