ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2008 z. 530: 405-418

SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE

JAKO POTENCJALNY PREBIOTYK

Joanna

Le Thanh

, Aneta

Burchardt

, Joanna

Menclewicz

, Anna

Sip

,

Grażyna

Lewandowicz

Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii śywności,
Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

Wstęp

Ważnym czynnikiem bezpośrednio zależnym od zachowań konsumenta, tj. jego

warunków ekonomicznych, upodobań i nawyków żywieniowych, jest rodzaj stosowanej
diety. Jej skład decyduje o właściwościach składników, które docierają do jelita
grubego. Wiele produktów żywnościowych zawiera składniki, które nie są trawione w
górnej części przewodu pokarmowego (na odcinku żołądek - jelito cienkie). Przykładem
takich składników jest skrobia oporna, nieskrobiowe polisacharydy (błonnik
pokarmowy) oraz oligosacharydy

[F

OOKS

i in. 1999; L

ESZCZYŃSKI

2004]

. Składniki, które

w postaci niestrawionej docierają do jelita grubego mogą być metabolizowane przez
mikroflorę jelitową i niejednokrotnie stymulować jej rozwój. Źródłem składników
wykorzystywanych przez bakterie jelitowe jest wiele produktów dietetycznych

[G

IDLEY

i

in. 1995; L

EWANDOWICZ

,

S

ORAL

-Ś

MIETANA

2004].

Na skład mikroflory jelitowej można oddziaływać nie tylko za pośrednictwem

diety ale również poprzez stosowanie preparatów probiotycznych zawierających
wyselekcjonowane szczepy bakterii Lactobacillus czy Bifidobacterium. Powszechnie
wiadomo, że dodatek drobnoustrojów probiotycznych do diety wywiera korzystny
wpływ na zdrowie, przede wszystkim z uwagi na ich zdolność do antagonistycznego
działania na drobnoustroje chorobotwórcze oraz bakterie gnilne. Liczebność
korzystnych bakterii w produktach spożywczych podczas ich przechowywania, a
następnie podczas pasażu jelitowego obniża się. Z tego też względu bakterie
probiotyczne często nie są w stanie utrzymać przewagi populacyjnej w przewodzie
pokarmowym. W związku z tym w ostatnich latach uwaga naukowców koncentruje się
na identyfikacji, a także opracowywaniu funkcjonalnych składników żywności, za
pośrednictwem których można by manipulować składem mikroflory jelitowej w taki
sposób by korzystnie oddziaływała ona na nasze zdrowie. Modyfikacja składu
mikroflory jelitowej jest zatem możliwa zarówno poprzez doustne podanie żywych
drobnoustrojów w postaci preparatów probiotycznych lub żywności probiotycznej oraz
za pośrednictwem żywności zawierającej nietrawione w przewodzie pokarmowym
składniki, które selektywnie stymulują wzrost i/lub aktywność określonych grup
drobnoustrojów.

Pierwotnie błonnik zawarty w ścianach komórkowych roślin uważany był za

główne źródło materiału opornego na hydrolizę enzymatyczną (trawienie), jednakże
niedawno okazało się, że również oligosacharydy, jak i „oporne” frakcje skrobi,

J. Le Thanh i inni

406

stanowią interesujące źródło węglowodanów wykorzystywanych przez mikroorganizmy
w jelicie grubym

[ASP 1996; L

ESZCZYŃSKI

2004].

Wśród tego typu produktów szczególne

miejsce zajmują substancje o działaniu prebiotycznym, takie jak polisacharydy
nieskrobiowe, a także tzw. „resistant starch” czyli skrobia oporna na enzymy
amylolityczne. Substancje te nie są trawione przez enzymy amylolityczne w przewodzie
pokarmowym człowieka, natomiast stanowią źródło węglowodanów dla mikroflory
jelitowej. W wyniku zachodzących tam procesów fermentacyjnych tworzą się
krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe uczestniczące w formowaniu nabłonka jelitowego
i wykazujące udowodnione działanie antykancerogenne

[B

ROUNS

i in. 2002]

. Prebiotyki

stymulują zatem rozwój probiotyków. Prebiotyki w sposób pośredni wpływają więc na
skład mikroflory jelitowej, motorykę jelit, gospodarkę mineralną, syntezę witamin z
grupy B oraz poziom cholesterolu i syntezy triglicerydów. Są pomocne w profilaktyce
nowotworów, a także mogą zmniejszać ryzyko powstawania wielu chorób
cywilizacyjnych takich jak: osteoporoza (poprzez poprawę wchłaniania wapnia),
otyłość (obniżenie indeksu glikemicznego), wrzodziejące zapalenie jelita grubego,
zaparcia, czy choroba wieńcowa

[G

IBSON

2004].

Pomimo szeregu dostępnych

komercyjnie preparatów prebiotycznych i coraz większej ilości informacji na temat
mikroflory jelitowej, wiedza dotycząca przemian jakim zarówno w warunkach in vitro
jak i in vivo ulegają prebiotyki jest nadal niewielka. Pierwszą próbę opracowania
ilościowej, a tym samym porównywalnej, metody oceny przebiegu fermentacji
substancji prebiotycznych w warunkach in vitro opracowali Palframan i wsp., którzy

wprowadzili pojęcie indeksu prebiotycznego PI

[V

ULEVIC

i in. 2004].

Do wyznaczenia PI

zaproponowali równanie, określające zmiany liczebności populacji kluczowych grup
bakterii bytujących w jelicie grubym (Bifidobacterium, Lactobacillus, Clostridium oraz
Bacteroides)

[V

ULEVIC

i in. 2004].

Częściej jednak badania nad prebiotykami dotyczą

określenia ich wpływu na liczebność wybranego szczepu bakterii probiotycznych np.
Bifidobacterium

[S

ORAL

-Ś

MIETANA

i in. 2005]

lub Lactobacillus

[L

IBUDZISZ

2006

]. W

badaniach tych ocenia się także ilość powstających krótkołańcuchowych kwasów
tłuszczowych oraz tempo asymilacji substratu i na ich podstawie określa się tzw. efekt
prebiotyczny

[S

ORAL

-Ś

MIETANA

i in. 2005; L

IBUDZISZ

2006].

Ze względu na właściwości fizykochemiczne skrobi oraz jej znaczenie w ży-

wieniu człowieka, ogromne nadzieje wiąże się z produktami jej modyfikacji jako
produktami dietetycznymi

[L

E

T

HANH

, L

EWANDOWICZ

2007].

W szczególności duże

oczekiwania istnieją w odniesieniu do procesów modyfikacji fizycznej, które
w odróżnieniu od sposobów polegających na reakcjach chemicznych nie budzą za-
strzeżeń z punktu widzenia żywieniowego. W Katedrze Biotechnologii i Mikrobiologii
ś

ywności Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu opracowano metodę otrzymywania

skrobi

o

podwyższonej

oporności

na

enzymy

amylolityczne

na

drodze

wysokociśnieniowej homogenizacji kleiku

[G

RAJEK

i in. 2004]

. Metodą tą można

otrzymać produkt o strawności obniżonej do 50%.

Celem niniejszej pracy było ustalenie czy skrobia modyfikowana fizycznie

otrzymana w wyniku wysokociśnieniowej homogenizacji kleików skrobiowych jest
metabolizowana przez probiotyczne szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus. Uzy-
skanie tych informacji może w przyszłości doprowadzić do opracowania na ich bazie
preparatów prebiotycznych i/lub gotowych symbiotyków.

Materiały i metody

Materiał badawczy stanowiła skrobia ziemniaczana modyfikowana fizycznie

otrzymana na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji kleiku skrobiowego

[G

RAJEK

i

SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE ...

407

in. 2004].

Do celów porównawczych zastosowano także maltodekstrynę niskoscukrzoną

(DE = 4,9) pochodzącą z Przedsiębiorstwa Przemysłu Ziemniaczanego w Łobzie oraz
skrobię ziemniaczaną natywną wyprodukowaną przez WWPZ w Luboniu.

Masę cząsteczkową skrobi ziemniaczanej, maltodekstryny N oraz homogenizatu

oznaczano techniką GFC (ang. Gel Filtration Chromatography). Użyto trzech
sprzężonych szeregowo kolumn Ultrahydrogel

TM

(Waters). Analizy wykonano aparatem

firmy Waters (Alliance HPLC System 2695) z detektorem refraktometrycznym (RI)
Waters 2414. Dane przetwarzano za pomocą oprogramowania Empower Pro w opcji
GPC. Analizę chromatograficzną prowadzono w następujących warunkach: temperatura
injektora 25

°

C, temperatura kolumn 40

°

C, temperatura celi pomiarowej 35

°

C, przepływ

rozpuszczalnika (woda dejonizowana) 0,700 ml/min. Krzywą kalibracyjną otrzymano
przy użyciu standardów mas cząsteczkowych dekstranu (Polymer Standards Service-
USA, Inc.).

Badaniom poddano probiotyczne szczepy bakterii Lactobacillus acidophilus, L.

casei, L. plantarum oraz L. ramnosus. Wszystkie badane bakterie pochodziły z kolekcji
czystych kultur Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii śywności Uniwersytetu
Przyrodniczego w Poznaniu.

Hodowle probiotycznych bakterii Lactobacillus prowadzono bez regulacji pH w

temperaturze 37

°

C w płynnym podłożu MRS (standardowym podłożu dla bakterii z

rodzaju Lactobacillus) oraz w zmodyfikowanych podłożach MRS. Modyfikacja podłoża
MRS polegała na usunięciu z niego glukozy i zastąpieniu jej równoważną ilością -
maltodekstryny, naturalnej skrobi ziemniaczanej lub skrobi modyfikowanej fizycznie
(homogenizatu). Sterylizację podłoży prowadzono po dodaniu do nich alternatywnych
w stosunku do glukozy źródeł węgla. W trakcie hodowli, w określonych interwałach
czasowych, oznaczano liczebność komórek Lactobacillus metodą rozcieńczeń
dziesiętnych i wyrażano ją w jtk/ml. Wszystkie oznaczenia wykonywano w trzech
powtórzeniach. Na podstawie otrzymanych danych określano maksymalną liczbę
komórek badanych bakterii, obliczano ilość podziałów, czas generacji, maksymalną
szybkość wzrostu (częstość podziałów) oraz czas trwania fazy wykładniczej. Hodowlę
kontrolną (klasyczne podłoże MRS) prowadzono przez 50 godz., natomiast hodowle
testowe (zmodyfikowane podłoża MRS) przez 75 godz. Czas hodowli testowych
wydłużono o 50% by dokładnie prześledzić sposób oddziaływania zastosowanych
ź

ródeł węgla na ich przebieg.

Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych SCFA oznaczono wy-

korzystując technikę wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC. Oznaczenia
wykonano na chromatografie cieczowym Merck-Hitachi L-7250, wyposażonym w
kolumnę Amnimex

HPX-87H

300

x 7,8mm oraz prekolumnę i detektor

refraktometryczny typ

DAD MERCK-HITACHI L-7455

. Jako eluent stosowano 0,005M

H

2

SO

4

, przy przepływie 0,6 ml

⋅

min

-1

. Próby sączono przez sączki 0,45 µ m (Milipore) i

nanoszono na kolumnę w ilości 30 µl. Identyfikacji jakościowej oraz ilościowej
dokonano metodą standardu zewnętrznego z wykorzystaniem powierzchni pików
(pomiar i integracja komputerowa).

Wyniki i dyskusja

Skrobia modyfikowana fizycznie na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji

kleiku skrobiowego wykazuje obniżoną do 50% strawność czyli zaledwie połowa
skrobi ulega hydrolizie do glukozy po 16-tu godzinach inkubacji w obecności

α

-

amylazy trzustkowej i glukoamylazy. Pod względem strukturalnym preparat ten w
niewielkim stopniu różni się od naturalnej skrobi ziemniaczanej, a najpoważniejszą

J. Le Thanh i inni

408

zmianą jaką powoduje zastosowany sposób obróbki jest częściowa degradacja
makrocząsteczek tego polisacharydu (rys. 1). Na wykresie obrazującym rozkład mas
cząsteczkowych naturalnej skrobi ziemniaczanej można zaobserwować ostry pik
amylopektyny dla czasu retencji 16,6 min, oraz trzy szerokie piki (czas retencji 22,5;
24,9; 30,7 min) odpowiadające amylozie (rys. 1). Handlowa maltodekstryna
niskoscukrzona DE = 4,9 (co odpowiada stopniowi polimeryzacji DP

≅

20) wykazuje

duży szeroki pik z dwoma maksimami dla czasów retencji 40,5 i 36,2 min
odpowiadający dominującej frakcji niskocząsteczkowej, oraz mały pik dla czasu
retencji 17,9 min, wskazujący na obecność w produkcie niewielkiej ilości relatywnie
wysokocząsteczkowej frakcji polisacharydowej. W odróżnieniu od pozostałych
zastosowanych wielkocząsteczkowych źródeł węgla, homogenizat skrobiowy wykazuje
trimodalny rozkład mas cząsteczkowych. Najbogatszą frakcję stanowi niezdegradowana
amylopektyna, ponadto występują frakcje odpowiadające zdegradowa.ym cząsteczkom
skrobiowym. Charakterystyczny jest fakt, iż pik amylopektyny homogenizatu występuje
przy nieco niższym czasie retencji (16,4 min) niż pik amylopektyny naturalnej skrobi
ziemniaczanej

(16,7

min).

Powyższa

obserwacja

wskazuje,

iż

proces

wysokociśnieniowej homogenizacji spowodował nie tylko degradację makrocząsteczek
skrobiowych, ale również pewną zmianę konformacyjną frakcji amylopektyny
poprawiającą termodynamiczną zgodność polimer-rozpuszczalnik w układzie
homogenizat-woda co w konsekwencji przesunęło pik GPC w kierunku niższych
czasów retencji.

Rys. 1. Rozkład mas cząsteczkowych określony metodą filtracji żelowej (GPC), 1 - skrobia,
2- homogenizat skrobi, 3 - maltodekstryna N

Fig. 1.

Molecular mass distribution determined by the gel permeation chromatography
method (GPC), 1 - starch, 2 - homogenised starch, 3 - maltodextrin N

Zastąpienie glukozy w pożywce MRS poliglukanami skrobiowymi o różnej masie

cząsteczkowej czyli: maltodesktryną, naturalną skrobią ziemniaczaną oraz skrobią
modyfikowaną fizycznie wpłynęło na przebieg hodowli badanych bakterii z rodzaju
Lactobacillus (tab. 1). W trakcie fazy wzrostu wykładniczego składniki odżywcze w
komercyjnych podłożach hodowlanych występują zwykle w nadmiarze dlatego
szybkość wzrostu bakterii jest największa, a zarazem maksymalna i charakterystyczna
dla poszczególnych gatunków. Zdolność bakterii do wzrostu zależy jednak nie tylko od
indywidualnych właściwości bakterii ale w dużej mierze jest uzależniona od
stosowanego substratu

[V

ULEVIC

i in. 2004].

Jak wynika z danych zamieszczonych w

tabeli 1, w przypadku hodowli prowadzonych na podłożu z glukozą maksymalna
liczebność komórek wykazywała niewielkie zróżnicowanie gatunkowe i wynosiła dla L.
acidophilus 9,8

⋅

10

8

jtk

⋅

ml

-1

, dla L. casei 9,0

⋅

10

8

jtk

⋅

ml

-1

oraz dla L. plantarum i L.

ramnosus 2,0

⋅

10

9

jtk

⋅

ml

-1

. Maltodekstryna, która charakteryzowała się stopniem

polimeryzacji DP

≅

20 była również źródłem węgla bardzo efektywnie

wykorzystywanym przez bakterie z rodzaju Lactobacillus. Umożliwiła ona wszystkim

SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE ...

409

badanym bakteriom intensywny wzrost, jednak maksymalna gęstość ich populacji była
się nieco niższa od otrzymywanej w podłożu z glukozą. Wzrost bakterii z rodzaju
Lactobacillus w pozostałych podłożach był słabszy niż w kontroli glukozowej, co
można tłumaczyć bardziej skomplikowaną strukturą wchodzących w ich skład
substratów. Ze względu na to, iż pozostałymi źródłami węgla były cukry złożone,
badane bakterie, do ich rozkładu musiały uruchomić syntezę specyficznych enzymów.
To z kolei powodowało stopniową zmianę ich metabolizmu. Zmiana ta wpłynęła na
obniżenie liczebności komórek oraz na wydłużenie niektórych faz wzrostu - głównie
fazy wykładniczego wzrostu (tab. 1). W przypadku skrobi ziemniaczanej czas trwania
fazy wykładniczej wydłużył się do 13 godz. dla Lactobacillus acidophilus (tab. 1),
natomiast dla pozostałych bakterii aż do 24 godz. (tab. 1). Maksymalna liczebność
komórek wszystkich badanych lactobacillusów w podłożu ze skrobią ziemniaczaną była
niższa niż w podłożu z glukozą i wynosiła średnio 8,2

⋅

10

8

jtk

⋅

ml

-1

(tab. 1). Wyjątek

stanowiły bakterie Lactobacillus plantarum, których populacja w podłożu ze skrobią
ziemniaczaną osiągnęła liczebność porównywalną do klasycznego podłoża MRS
(tab. 1). Gęstość komórek w podłożu z homogenizatem była natomiast zbliżona do
wartości uzyskiwanych dla skrobi natywnej, co może być spowodowane zbliżoną masą
cząsteczkową obu związków. Na uwagę zasługuje również fakt, że czas trwania fazy
wykładniczej wszystkich badanych probiotycznych szczepów Lactobacillus na
podłożach z homogenizatem był dwu- trzykrotnie krótszy niż na podłożach ze skrobią
natywną.

Tabela 1; Table 1

Parametry wzrostu bakterii z rodzaju Lactobacillus w klasycznym podłożu MRS

z glukozą oraz w zmodyfikowanych podłożach MRS

Parameters of Lactobacillus growth

in classic as well as modified MRS broth

Wyszczególnienie; Specification

Glukoza

Glucose

Maltodek-

stryna

Maltodextrin

Skrobia

Potato

starch

Homogenizat

skrobi

Homogenised

starch

1

2

3

4

5

Lactobacillus acidophilus

Log maksymalnej liczebności komórek (jtk

⋅

ml

-1

)

The log of maximum cells viability (cfu

⋅

ml

-1

)

8,99

8,6

7,97

7,85

Czas trwania fazy wykładniczej - t (godz.)
Time of exponential phase - t (h)

10

8

13

8

1

2

3

4

5

Liczba podziałów (pokoleń) - n
Number of generations - n

9,9

4,8

3,7

2,7

Maksymalna właściwa szybkość wzrostu - v (godz.)
Maximum specific growth rate - v (h)

1,0

0,6

0,3

0,3

Czas generacji - g (godz.)
Generation time - g (h)

1,0

1,7

3,3

3,3

Lactobacillus casei

Log maksymalnej liczebności komórek (jtk

⋅

ml

-1

)

The log of maximum cells viability (cfu

⋅

ml

-1

)

8,82

8,58

7,74

7,39

Czas trwania fazy wykładniczej - t (godz.)
Time of exponential phase - t (h)

10

13

24

8

Liczba podziałów (pokoleń) - n

5,14

6,5

4,5

4,9

J. Le Thanh i inni

410

Number of generations - n

Maksymalna właściwa szybkość wzrostu - v (godz.)
Maximum specific growth rate - v (h)

0,5

0,5

0,2

0,6

Czas generacji - g (godz.)
Generation time - g (h)

2,0

2,0

5

1,7

Lactobacillus plantarum

Log maksymalnej liczebności komórek (jtk

⋅

ml

-1

)

The log of maximum cells viability (cfu

⋅

ml

-1

)

9,15

8,99

9,16

8,75

Czas trwania fazy wykładniczej - t (godz.)
Time of exponential phase - t (h)

13

8

24

8

Liczba podziałów (pokoleń) - n
Number of generations - n

10,5

4,8

9,4

6,4

Maksymalna właściwa szybkość wzrostu - v (godz.)
Maximum specific growth rate - v (h)

0,8

0,6

0,4

0,8

Czas generacji - g (godz.)
Generation time - g (h)

1,2

1,6

2,5

1,25

Lactobacillus ramnosus

Log maksymalnej liczebności komórek (jtk

⋅

ml

-1

)

The log of maximum cells viability (cfu

⋅

ml

-1

)

9,13

8,83

7,95

7,86

Czas trwania fazy wykładniczej - t (godz.)
Time of exponential phase - t (h)

10

5

24

8

Liczba podziałów (pokoleń) - n
Number of generations - n

5,8

6,9

4,3

3,4

Maksymalna właściwa szybkość wzrostu - v (godz.)
Maximum specific growth rate (h)

0,6

1,4

0,2

0,4

Czas generacji - g (godz.)
Generation time - g (h)

1,6

0,7

5,6

2,5

Wytwarzanie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) jest typową

cechą fizjologiczną bakterii z rodzaju Lactobacillus i jedną z przyczyn korzystnego
oddziaływania tych mikroorganizmów na organizm człowieka. W związku z tym, że
krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe wytwarzane podczas fermentacji wywierają
pozytywny wpływ na organizm ludzki podwyższone stężenia tych kwasów w jelicie
grubym są uznawane za pożądane. Wszystkie kwasy tłuszczowe wytwarzane przez
Lactobacillus obniżają pH jelit powodując tym samym zmniejszenie ilości
niekorzystnej dla nas mikroflory. SCFA mogą także stymulować rozwój nabłonka
jelitowego (kwas masłowy), a nawet wpływać korzystnie na rozwój hepatocytów
(głównie kwas propionowy)

[L

IBUDZISZ

2006].

Jak wykazały przeprowadzone badania

ilość kwasów wydzielanych przez cztery probiotyczne szczepy bakterii Lactobacillus
zależała od rodzaju źródła węgla obecnego w podłożu. Na rysunku 2 przedstawiono
profil zmian stężenia najważniejszych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w
hodowli bakterii Lactobacillus acidophilus na podłożu zawierającym glukozę jako
ź

ródło węgla. Rysunek ten obrazuje sposób w jaki bakterie Lactobacillus wytwarzały

krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe w sytuacji gdy zapewniono im optymalne warunki
wzrostu. Fermentacja glukozy, będącej preferowanym źródłem węgla przez bakterie,
dała stosunkowo wysoką produkcję kwasu mlekowego. Jego stężenie w 50 godz.
hodowli oscylowało w granicach 25 g

⋅

dm

-3

. Drugim, pod względem ilościowym,

metabolitem wydzielanym podczas fermentacji do podłoża był kwas octowy. Jego ilość
rosła stopniowo do wartości 5 g

⋅

dm

-3

. W mniejszych ilościach wytwarzane były inne

SCFA. Maksymalne stężenie kwasu propionowego w podłożu hodowlanym

SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE ...

411

zarejestrowano w 50 godz. hodowli. Wynosiło ono 1,7 g

⋅

dm

-3

. Kwas masłowy był

natomiast wydzielany w śladowych ilościach. Produkcja wszystkich SCFA zaczynała
się około 6 godziny hodowli, czyli mniej więcej w połowie fazy wzrostu
wykładniczego. Analizując dane zamieszczone na rysunku 2 stwierdzono również, że
przez cały czas trwania hodowli bakterie Lactobacillus nie utylizowały
krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych.

-
- kwas mlekowy; lactic acid

-- kwas octowy; acetic acid

-- kwas propionowy; propionic acid

-

×

- kwas masłowy; butyric acid

Rys. 2. Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas hodowli Lactobacillus

acidophilus w pożywce zawierającej glukozę jako źródło węgla

Fig. 2.

The short chain fatty acids concentration during Lactobacillus acidophilus growth in
the medium with glucose as a carbon source

Zastosowanie do hodowli L. acidophillus podłoża z maltodekstryną zamiast

glukozy obniżyło produkcję wszystkich SCFA (rys. 3). Maksymalne uzyskane stężenie
kwasu mlekowego wynosiło 8,44 g

⋅

dm

-3

, kwasu octowego 3,79 g

⋅

dm

-3

, natomiast kwasu

propionowego 1,03 g

⋅

dm

-3

. Jedynie kwas masłowy podczas hodowli na podłożu z

maltodekstryną był produkowany w porównywalnych ilościach jak w trakcie hodowli
kontrolnych (podłoża z glukozą). W podłożu MRS zmodyfikowanym maltodekstryną L.
acidophillus potrzebowały jednocześnie znacznie więcej czasu na wykorzystanie
substratu stąd też produkcja SCFA zaczynała się znacznie później w porównaniu z
hodowlami kontrolnymi.

J. Le Thanh i inni

412

-
- kwas mlekowy; lactic acid

-- kwas octowy; acetic acid

-- kwas propionowy; propionic acid

-

×

- kwas masłowy; butyric acid

Rys. 3.

Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas hodowli Lacto-
bacillus acidophilus w pożywce zawierającej maltodekstrynę jako źródło węgla

Fig. 3.

The short chain fatty acids concentration during Lactobacillus acidophilus growth in
the medium with maltodekstrin as a carbon source

Zastosowanie naturalnej skrobi ziemniaczanej jako źródła węgla spowodowało

zmianę

proporcji

ilościowych

wytwarzanych

krótkołańcuchowych

kwasów

tłuszczowych w porównaniu z kontrolą glukozową (rys. 4). W trakcie hodowli na
podłożu ze skrobią ziemniaczaną L. acidophillus produkowały najwięcej kwasu
octowego. Kolejnym pod względem ilości wytwarzanym SCFA był kwas mlekowy, a
następnie kolejno kwas propionowy i masłowy.

Poziom produkcji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w podłożu

zawierającym homogenizat różnił się wyraźnie od stwierdzonego w pozostałych typach
podłoży (rys. 5). Największe zmiany nastąpiły w produkcji kwasu mlekowego, mniejsze
natomiast w produkcji kwasu octowego oraz propionowego. Bakterie L. acidophilus
hodowane w podłożu z homogenizatem, podobnie jak w podłożu ze skrobią,
produkowały, więcej kwasu octowego niż kwasu mlekowego. Podobne wyniki uzyskała

W

RONKOWSKA

i in. [2006]

, w badaniach 24-godzinnej fermentacji różnych substratów

skrobiowych z udziałem wybranych szczepów Bifidobacterium, gdzie w przypadku
próby kontrolnej, czyli podłoża z glukozą głównym metabolitem fermentacji był kwas
mlekowy, a fermentacja pozostałych substratów (tj. skrobi natywnych i skrobi
modyfikowanych, opornych na enzymy amylolityczne) dała wysokie stężenia kwasu
octowego

[W

RONKOWSKA

i in. 2006

].

SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE ...

413

-
- kwas mlekowy; lactic acid

-- kwas octowy; acetic acid

-- kwas propionowy; propionic acid

-

×

- kwas masłowy; butyric acid

Rys. 4. Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas hodowli Lactobacillus

acidophilus w pożywce zawierającej skrobię jako źródło węgla

Fig. 4.

The short chain fatty acids concentration during Lactobacillus acidophilus growth in
the medium with potato starch as a carbon source

-
- kwas mlekowy; lactic acid

-- kwas octowy; acetic acid

-- kwas propionowy; propionic acid

-

×

- kwas masłowy; butyric acid

Rys. 5.

Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas hodowli Lacto-
bacillus acidophilus w pożywce zawierającej homogenizat skrobi jako źródło węgla

Fig. 5.

The short chain fatty acids during Lactobacillus acidophilus growth in the medium
with homogenized starch as a carbon source

W badaniach

V

ULEVIC

’

A

i in. [2004]

zaobserwowano wyższą produkcję kwasu octowego

niż mlekowego przy zastosowaniu jako źródła węgla zamiast glukozy trans-galakto-
oligosacharydów, frukto-oligosacharydów, sacharozy, czy też gumy guar

[V

ULEVIC

i in.

2004].

Kwas octowy, który okazał się być głównym metabolitem fermentacji natywnej

skrobi ziemniaczanej oraz skrobi modyfikowanej fizycznie prowadzonej przez
probiotyczne szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus jest związkiem wykazującym
silną antagonistyczną aktywność względem wielu bakterii, drożdży i pleśni. Ponadto
ustalono, że jest absorbowany z jelita grubego i stanowi zapasowe źródło energii dla
tkanek

[W

RONKOWSKA

i in. 2006].

J. Le Thanh i inni

414

Proces produkcji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych przez pozostałe

badane szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus miał podobny przebieg jak
w przypadku L. acidophilus. Ponadto charakter zmian wywołanych obecnością różnych
ź

ródeł węgla w podłożu był analogiczny (tab. 2).

Tabela 2; Table 2

Ilości krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych wytworzonych

przez bakterie z rodzaju Lactobacillus w klasycznym podłożu MRS

z glukozą oraz podłożach zmodyfikowanych po 50 godz. fermentacji

Production of short chain fatty acids by Lactobacillus in classic

as well as modified MRS broth after 50h fermentation

Ź

ródło węgla w podłożu

Carbon source

Stężenie kwasu w podłożu po 50 godz. fermentacji

Concentration of acids in broth after 50 h fermentation

(g

⋅

dm

-3

)

mlekowy

lactic

octowy

acetic

propionowy

propionic

masłowy

butyric

L. acidophilus

Glukoza; Glucose

24,71

5,12

1,66

0,02

Maltodekstryna; Maltodextrin

7,98

3,69

1,00

0,09

Skrobia; Starch

1,46

3,33

1,08

0,09

Homogenizat skrobi; Homogenised starch

1,19

3,32

0,91

0,03

L. casei

Glukoza; Glucose

26,47

5,15

1,69

-

Maltodekstryna; Maltodextrin

8,54

2,15

1,02

0,06

Skrobia; Starch

1,67

2,65

1,02

0,12

Homogenizat skrobi; Homogenised starch

1,05

2,69

0,85

0,05

L. plantarum

Glukoza; Glucose

14,89

2,56

0,73

0,05

Maltodekstryna; Maltodextrin

19,40

2,80

0,81

0,06

Skrobia; Starch

10,67

4,41

1,33

0,06

Homogenizat skrobi; Homogenised starch

0,59

4,03

1,50

0,01

L. ramnosus

Glukoza; Glucose

15,08

1,97

0,99

0,05

Maltodekstryna; Maltodextrin

9,80

2,55

0,86

0,06

Skrobia; Starch

0,87

2,15

0,59

0,03

Homogenizat skrobi; Homogenised starch

1,07

3,60

1,07

0,05

Podsumowanie

Skrobia modyfikowana fizycznie na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji

kleiku skrobiowego wykazuje obniżoną do 50% strawność in vitro. Zastosowany
sposób obróbki powoduje częściową degradację makrocząsteczek tego polisacharydu
oraz zmianę konformacyjną frakcji amylopektyny poprawiającą termodynamiczną
zgodność polimer-rozpuszczalnik w układzie polimer-woda. Zastąpienie glukozy w
podłożu MRS skrobią modyfikowaną fizycznie zmienia przebieg hodowli czterech
badanych probiotycznych szczepów bakterii Lactobacillus. Użycie jako źródła węgla
maltodekstryny, nie wpływa w wyraźny sposób na intensywność wzrostu żadnego z
badanych szczepów. Podczas hodowli w podłożu ze skrobią ziemniaczaną natywną

SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE ...

415

następuje natomiast obniżenie liczebności komórek oraz wydłużenie fazy wzrostu
wykładniczego w stosunku do pozostałych testowanych w pracy źródeł węgla. W
przypadku zastosowania podłoża ze skrobią modyfikowaną fizycznie zaobserwowano
niższą liczebność komórek wszystkich Lactobacillus, w porównaniu do uzyskiwanej w
podłożu z formą natywną skrobi. Maksymalna szybkość wzrostu komórek była jednak
porównywalna w obu podłożach. Zastosowanie wysokocząsteczkowych źródeł węgla,
takich jak naturalna skrobia ziemniaczana oraz skrobia modyfikowana na drodze
wysokociśnieniowej homogenizacji wyraźnie obniżyło produkcję kwasu mlekowego
oraz zmieniło proporcje ilościowe pomiędzy pozostałymi SCFA wytwarzanymi przez
Lactobacillus. W podłożach ze skrobią modyfikowaną fizycznie kwas octowy był
głównym produktem fermentacji. Skrobia modyfikowana fizycznie na drodze
wysokociśnieniowej homogenizacji powodowała podobne zmiany metabolizmu bakterii
probiotycznych jak znane substancje o charakterze prebiotycznym, tj. trans-galakto-oli-
gosacharydy, frukto-oligosacharydy oraz preparaty skrobi opornej.

Literatura

ASP, N-G. 1996.

Dietary carbohydrates: classification by chemistry and physiology.

Food Chem. 57(1): 9-14.

B

ROUNS

F., K

ETTLITZ

B., A

RRIGONI

E. 2002.

Resistant starch and the butyrate revolu-

tion”. Trends in Food Sci. and Techn. 13(8): 251-261.

F

OOKS

L.J., F

ULLER

R., G

IBSON

G.R. 1999.

Prebiotics, probiotics and human gut

microbiology. Intern. Dairy J. 9: 53-61.

G

IBSON

G.R. 2004.

Prebiotics. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology

18(2): 287-298.

G

IDLEY

M.J., C

OOKE

D., D

ARKE

A.H., H

OFFMANN

R.A., R

USSELL

A.L., G

REENWELL

P. 1995.

Molecular order and structure in enzyme-resistant retrograded starch. Carbohydrate
Polymers 28(1): 23-31.

G

RAJEK

W., J

ANKOWSKI

T., L

EWANDOWICZ

G. 2004.

Sposób otrzymywania produktu

skrobiowego o podwyższonej odporności na enzymy amylolityczne. Zgłoszenie pa-
tentowe RP nr P. 368472 z dnia 8 czerwca 2004.

L

E

T

HANH

J., L

EWANDOWICZ

G. 2007.

Dietetyczne produkty skrobiowe. Przem. Spoż.

61(8): 54-58; 88.

L

ESZCZYŃSKI

W. 2004.

Resistant starch - classification, structure, production. Polish J.

of Food and Nutrition Sci. 13/54(1): 37-50.

L

EWANDOWICZ

G. S

ORAL

-Ś

MIETANA

M. 2004.

Starch modification by iterated syneresis.

Carbohydrate Polymers 56(4): 403-413.

L

IBUDZISZ

Z. 2006.

Mikroflora przewodu pokarmowego człowieka i jej wpływ na orga-

nizm, w: Mikroorganizmy w żywności i żywieniu. Wydawn. AR w Poznaniu: 31-41.

V

ULEVIC

J., R

ASTALL

R.A., G

IBSON

G.R. 2004.

Developing a quantitative approach for

determining the in vitro prebiotic potential of dietary oligosaccharides. FEMS Micro-
biology Letters 236: 153-159.

S

ORAL

-Ś

MIETANA

M., W

RONKOWSKA

M., B

IEDRZYCKA

E., B

IELECKA

M., O

CICKA

K. 2005.

Native and physically-modified starches-utilization of resistant starch by Bifidobacteria
(In Vitro). Polish J. of Food and Nutrition Sci. 14(55): 3.273-279.

W

RONKOWSKA

M., S

ORAL

-Ś

MIETANA

M., K

RUPA

U., B

IEDRZYCKA

E. 2006.

In vitro fer-

mentation of new modified starch preparations - changes of microstructure and bac-

J. Le Thanh i inni

416

terial end-products. Enzyme and Microbial Techn. 40: 93-99.



Słowa kluczowe:

skrobia, prebiotyk, Lactobacillus, krótkołańcuchowe kwasy
tłuszczowe

Streszczenie

ś

ywność funkcjonalna czyli produkty spożywcze wykazujące pozytywny (ponad

efekt odżywczy) wpływ na organizm człowieka budzą coraz większe zainteresowanie,
zarówno konsumentów, jak i technologów żywności. Szczególną rolę odgrywają
wchodzące często w jej skład substancje o charakterze prebiotycznym, tj. niestrawne
węglowodany, które selektywnie stymulują wzrost i/lub aktywność jednego lub kilku
szczepów bakterii probiotycznych (Bifidobacterium, Lactobacillus) obecnych w jelicie
grubym. Przykładem produktów będących źródłem substancji prebiotycznych są
produkty skrobiowe zawierające tzw. skrobię oporną. Wcześniejsze prace wykonane w
Katedrze Biotechnologii i Mikrobiologii śywności Uniwersytetu Przyrodniczego w
Poznaniu wykazały, że skrobia modyfikowana fizycznie na drodze wysokociśnieniowej
homogenizacji kleiku wykazuje strawność in vitro rzędu 50%. Celem pracy była ocena
prebiotycznych właściwości skrobi modyfikowanej fizycznie otrzymanej na drodze
wysokociśnieniowej homogenizacji kleików skrobiowych poprzez określenie zdolności
mikroorganizmów z rodzaju Lactobacillus do wykorzystywania jej jako źródła węgla.

Cztery probiotyczne szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus (L. acidophilus, L.

casei, L. plantarum, L. ramnosus) hodowano w podłożach MRS zawierających jako
ź

ródło

węgla

zamiennie:

glukozę,

maltodekstrynę

niskoscukrzoną,

skrobię

ziemniaczaną natywną, oraz skrobię modyfikowaną fizycznie na drodze homogenizacji
wysokociśnieniowej. Zakres badań obejmował określanie intensywności wzrostu
badanych mikroorganizmów oraz poziomu produkcji krótkołańcuchowych kwasów
tłuszczowych metodą HPLC. Oznaczono ponadto rozkład mas cząsteczkowych
wszystkich badanych preparatów skrobiowych.

Stwierdzono, że wysokociśnieniowa homogenizacja kleiku powoduje częściową

degradację makrocząsteczek skrobi oraz zmianę konformacyjną frakcji amylopektyny
poprawiającą termodynamiczną zgodność polimer-rozpuszczalnik w układzie polimer-
woda. Wprowadzenie skrobi modyfikowanej fizycznie do podłoża MRS zamiast
glukozy powodowało zmianę przebiegu hodowli wszystkich badanych szczepów
Lactobacillus. Użycie jako źródła węgla maltodekstryny zamiast glukozy nie wpłynęło
zarówno na maksymalną szybkość wzrostu jak i na liczebność komórek Lactobacillus.
Hodowlana w podłożu ze skrobią ziemniaczaną natywną charakteryzowała się niższą
intensywnością wzrostu badanych bakterii oraz najdłuższym czasem trwania fazy
wzrostu wykładniczego w odniesieniu do pozostałych źródeł węgla. W przypadku
zastosowania podłoża ze skrobią modyfikowaną fizycznie jako źródłem węgla,
maksymalna liczebność komórek Lactobacillus była niższa od uzyskiwanej w
podłożach z formą natywną skrobi, natomiast szybkość wzrostu komórek była
porównywalna dla obu substratów. Zastosowanie wysokocząsteczkowych źródeł węgla,
takich jak naturalna skrobia ziemniaczana oraz skrobia modyfikowana na drodze
wysokociśnieniowej homogenizacji powodowało intensywniejszą produkcję kwasu
octowego niż mlekowego. Skrobia modyfikowana fizycznie na drodze wy-
sokociśnieniowej homogenizacji wywołuje podobne zmiany metabolizmu bakterii
probiotycznych jak znane substancje o charakterze prebiotycznym, tj. trans-galakto-
oligosacharydy, frukto-oligosacharydy oraz preparaty skrobi opornej.

SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE ...

417

PHYSICALLY MODIFIED STARCH AS A POTENTIAL PREBIOTIC

Joanna Le Thanh, Aneta Burchardt, Joanna Menclewicz,

Anna Sip, Grażyna Lewandowicz

Department of Biotechnology and Food Microbiology,

University of Life Sciences, Poznań

Key words:

starch, prebiotic, Lactobacillus, short chain fatty acids

Summary

The identification and development of food ingredients that beneficially affect

human organism have attracted much interest recently. Prebiotics i.e. nondigestible
carbohydrates that selectively stimulate the growth and/or activity of one, or a limited
number of probiotic bacteria (e.g. Bifidobacterium, Lactobacillus) present in the colon
seem to be especially important. Several starch products, particularly the so called
resistant starch, are recommended earlier as the health beneficial food ingredients. The
earlier researches performed in the Department of Biotechnology and Food
Microbiology of Poznań University of Life Sciences demonstrated that the process of
high-pressure homogenization of starch pastes led to obtain a product characterised by
the in vitro digestibility of about 50%. The aim of the work was to evaluate the prebiotic
potential of this type of physically modified starch.

In order to estimate the prebiotic potential of physically modified starch, the

growth of four probiotic species of Lactobacillus (L. acidophilus, L. casei, L.
plantarum, & L. ramnosus) was investigated. Maltodextrin (DE = 4.9), native potato
starch, as well as the homogenised starch were applied as the alternative (instead of
glucose) carbon source in the MRS fermentation broth. Moreover, the short chain fatty
acids (SCFA) production was determined. Molecular mass distribution of all starch
preparations was also analysed.

It was found that a high pressure homogenisation of starch pastes resulted in

partial degradation of macromolecules of this polysaccharide, as well as in con-
formational change which improved the thermodynamic compatibility in polymer-water
system. The application of physically modified starch as a carbon source in the modified
MRS broth affected the growth of all Lactobacilli strains not only in comparison to
glucose, but also to maltodextrin and native starch. The application of maltodextrin as a
carbon source resulted neither in the decrease of the maximal growth rate, nor the
maximum cell vialibility.

In the case of the Lactobacilus culture on the MRS broth containing native potato

starch, the lowering of maximum cell population, the longest duration of exponential
growth phase in comparison to other carbon source as well as the decrease of maximal
growth rate were observed. If modified starch is used as an alternative carbon source,
the decrease of maximum cell population in comparison to native starch is observed, but
the maximal growth rate was the same. The application of high molecular weight carbon
sources i.e. native potato starch and starch modified physically by a high pressure
homogenisation causes more effective production of acetic rather than lactic acid.

Physically modified starch applied as a carbon source in the MRS broth caused

similar changes in the metabolism of Lactobacillus probiotic strains as popular prebiotic
substances i.e. trans-galacto-oligosaccharides, fructo- oligosaccharides and resistant
starch preparations.

J. Le Thanh i inni

418

Mgr Joanna Le Thanh
Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii śywności
Uniwersytet Przyrodniczy
ul. Wojska Polskiego 48
60-627 POZNAŃ
e-mail: maithanh@up,poznan.pl