M
ATERIAŁY DODATKOWE
Bacillus
Wśród bakterii Bacillus znane są gatunki mezofilne, termofilne, psychrofile, a
nawet psychrotrofowe. Większość dobrze rośnie w temperaturze pokojowej oraz w 37ºC (B.
licheniformis
, B. subtilis). Gatunki termofilne nie rosną w temperaturze poniżej 45ºC, należą
do nich m.in. Bacillus stearothermophilus, Bacillus thermoruber, B. acidocaldarius, B.
schlegelii.
Do typowych psychrofilnych bakterii zalicza się Bacillus macquariensis, B.
globisporus, B. insolitus, B. marinus B. megaterium, B. polymyxa,
B. psychrophilus i B.
psychrosaccharolyticus
. Liczne gatunki z rodzaju Bacillus mogą bez wyraźnych zmian
metabolicznych adaptować się do warunków środowiska, np. gatunki mezofilne (B.
licheniformis
, B. subtilis, B. coagulans, B. badius, B. smithii) mogą rosnąć w temperaturach
sięgających 60-70ºC. Są to tzw. termotolerancyjne laseczki.
Bakterie Bacillus, w zależności od gatunku wymagają do wzrostu środowiska o
różnym pH (pH 1-11). Grupa laseczek alkalofilnych (B. alkalophilus, B. firmus, B.
alcalphilus
, B. lentus, B. pasteurii) preferują pH zasadowe (pH 8-11), natomiast B. subtilis, B.
licheniformis
, B. circulans, B. laterosporus, B. pumilus lepiej rosną w pH obojętnym.
Ś
rodowisko kwaśne (acidofile) lubią B. acidocaldarius, B. coagulans i B. polymyxa. Niektóre
laseczki są halofilne (B. pantothenticus, B. pasteurii, B. globisporus, B. marinus, B.
halophilus
), wytrzymują nawet 10% stężenie NaCl.
Metabolizm Bacillus
Bacillus
należą do grupy wybitnie heterogennych chemoorganotrofów. Dobrze rosną
na podłożach bulionowych (wyj. B. larvae). Na agarze rosną w postaci dużych kolonii o
rozmiarach 3-10 mm, płaskich, zwykle matowych, o postrzępionych brzegach (choć zdarzają
się kolonie błyszczące i śluzowe). W płynnym bulionie rosną w postaci kożucha lub tworzą
zmętnienie w całej objętości pożywki.
Wymagania pokarmowe są bardzo zróżnicowane gatunkowo. Są gatunki, którym
wystarczają pojedyncze źródła węgla, azotu i energii (B. cereus, B. licheniformis, B. pumilus,
B. subtilis
), inne potrzebują kompleksowych podłoży z dodatkowymi czynnikami wzrostu
(witaminy, aminokwasy) np. B. azotofixans, B. macerans, B. polymyxa, B.
psychrosaccharolyticus
.
Wykorzystywane do wzrostu substancje organiczne, metabolizowane są w komórkach
Bacillus
w procesach tlenowych i/lub fermentacyjnych. U niektórych gatunków tlen, jako
akceptor elektronów, może być zastąpiony przez jony NO
3
-
(NO
3
do NO
2
redukują
bakterie denitryfikujące: B. azotoformans, B. cereus, B. laterosporus, B. licheniformis, B.
pasteurii, B. stearothermophilus)
. Niektóre gatunki (B. polymyxa, B. macerans i B.
azotofixans
) mogą wiązać azot atmosferyczny.
Gatunki oddychające beztlenowo przeprowadzają fermentację sacharydów. B.
cereus
i B. licheniformis wytwarzają 2,3-butandiol, glicerol, CO
2
i niewielkie ilości mleczanu
oraz etanolu. B.
polymyxa i B. macerans rozkładają skrobię i pektyny, przy czym B. polymyxa
daje 2,3-butandiol, CO
2
H
2
i etanol, a B. macerans – etanol, aceton, octan i mrówczan, CO
2
i
H
2
. Właśnie na podstawie produktów fermentacji rozróżnia się poszczególne gatunki z
rodzaju Bacillus. Alkalofilna bakteria B. pasteurii może rozkładać mocznik.
Podczas wzrostu wegetatywnego bakterie Bacillus gromadzą kwasy organiczne
powodując zakwaszanie środowiska nawet do pH 4,0-5,0. Jest to spowodowane tym, że
powstający w glikolizie pirogronian nie jest włączany jako acetylo-CoA do cyklu Krebsa
(niektóre enzymy tego cyklu są zablokowane – represja kataboliczna), tylko wchodzi w cykl
glioksalowy. Cykl Krebsa jest uruchamiany dopiero w trakcie przygotowania do sporulacji.
W końcowej fazie wzrostu wykładniczego, gdy wyczerpaniu ulegają łatwo przyswajalne
ź
ródła węgla i energii, a komórki zaczynają się przygotowywać do wytworzenia endospor,
odblokowywane są enzymy cyklu Krebsa i acetylo-CoA ulega całkowitemu utlenieniu do CO
2
.
Powstaje też wtedy dużo ATP niezbędnego przy sporulacji. Wtedy też, w warunkach
tlenowych, zostają utlenione nagromadzone wcześniej kwasy organiczne, pH środowiska
wzrasta.
Clostridium
Nie mają wysokich wymagań pokarmowych. Zwykle hoduje się je na pożywkach
agarowych z dodatkiem krwi – w celu obserwacji właściwości hemolitycznych (typ
β) lub na
pożywkach zapewniających niski potencjał redukcyjny – podłoże VL (do badania zdolności
fermentacji cukrów, np. glukozy, maltozy, sacharozy), czasem na pożywkach wybiórczych z
antybiotykami, na podłożu Wilson-Blaira (do izolacji i wykrywania beztlenowych bakterii
przetrwalnikujących, redukujących siarczany).
Bakterie istotne z punktu widzenia klinicznego
hoduje się w temp. 35-37°C, inne 30-40°C. Kolonie są duże 3-8 mm, płaskie, okrągłe lub
nieregularne, brzeg może być postrzępiony, powierzchnia matowa, szorstka, barwa szarawa
do szarożółtawej.
Do wykrywania aktywności metabolicznej stosuje się takie pożywki jak w przypadku innych bakterii, przy czym należy inkubować w
warunkach beztlenowych (anaerostat).
agar z żółtkiem jaja kurzego – do analizy lecytynazy, lipazy i proteazy,
pożywka z żelatyną i kazeiną – właściwości proteolityczne,
testy komercyjne,
chromatografia gazowa – kwasy tłuszczowe.
Fermentacja masłowa
Fermentację masłową wywołują gł. bakterie masłowe należące do rodzaju Clostridium.
Jest to typowy proces beztlenowy w wyniku, którego przy rozkładzie węglowodanów
powstaje kwas masłowy (CH
3
CH
2
CH
2
COOH). Jest to heterofermentacja, mikroorganizm
produkuje więc także i inne związki. Najczęściej wytwarzane są również: butanol, aceton,
metanol, propan, 2-propanol, kwas octowy i inne kwasy organiczne itp.
Synteza maślanu
powstaje w wyniku kondensacji dwóch cząsteczek acetylo-CoA z
wytworzeniem acetoacetylo-CoA (enzym tiolaza). Acetoacetylo-CoA jest w obecności NADH
2
redukowany przez dehydrogenazę
β
-hydroksybutyrylową do
β
-hydroksybutyrylo-CoA, który
pod wpływem krotonazy ulega dehydratacji i powstaje krotonylo-CoA. Ten jest redukowany
przez dehydrogenazę butyrylo-CoA do butyrylo-CoA, a następnie transferaza CoA przenosi
CoA na octan, a maślan zostaje usunięty z komórki. Acetylo-CoA może być wykorzystywany
do odtworzenia ATP z powstaniem octanu. W czystej fermentacji masłowej wodór pochodzący
z utleniania pirogronianu do acetylo-CoA zostaje uwolniony w formie gazowej.
Równanie sumaryczne fermentacji masłowej
C
6
H
12
O
6
+ bakterie masłowe → CH
3
CH
2
CH
2
COOH + 2CO
2
+ 2H
2
+ ok. 15 kcal/mol
glukoza
kwas masłowy
Jeśli fermentacja zachodzi zgodnie z tym równaniem to ustala się równowaga wodorowa i na
każdy mol wykorzystanej glukozy przypadają powstające 3 mole ATP.
Wytwarzanie kwasu masłowego przez gatunki z rodzaju Clostridium
•
C. butyricum – kwas masłowy, octowy, CO
2
, H
2
(substraty – glukoza, skrobia, dekstryna),
•
C. tyrobutyricum – kwas masłowy, octowy, CO
2
, H
2
(substraty – glukoza lub mleczan,
glicerol + octan),
•
C. pasteurianum – kwas masłowy, octowy, CO
2
(substraty – glukoza, skrobia, mannoza,
inulina),
•
C. pectinovorum – kwas masłowy, octowy (substraty – pektyna, skrobia, glikogen,
dekstryna),
•
C. felsineum
– kwas masłowy, octowy, CO
2
, H
2
(substraty – pektyna, kwas
galakturonowy),
•
C. acetobutylicum – kwas masłowy, octowy, CO
2
, H
2
, butanol, acetoina, etanol (substraty
– glukoza, glicerol, pirogronian),
•
C. kluyveri – kwas kapronowy, H
2
, masłowy (substraty – etanol + octan + CO
2
),
•
C. tetanomorphum – kwas masłowy, octowy, NH
3
, CO
2
, H
2
(substraty – glutaminian,
histydyna).