M

ATERIAŁY DODATKOWE

Bacillus

Wśród bakterii Bacillus znane są gatunki mezofilne, termofilne, psychrofile, a

nawet psychrotrofowe. Większość dobrze rośnie w temperaturze pokojowej oraz w 37ºC (B.

licheniformis

, B. subtilis). Gatunki termofilne nie rosną w temperaturze poniżej 45ºC, należą

do nich m.in. Bacillus stearothermophilus, Bacillus thermoruber, B. acidocaldarius, B.

schlegelii.

Do typowych psychrofilnych bakterii zalicza się Bacillus macquariensis, B.

globisporus, B. insolitus, B. marinus B. megaterium, B. polymyxa,

B. psychrophilus i B.

psychrosaccharolyticus

. Liczne gatunki z rodzaju Bacillus mogą bez wyraźnych zmian

metabolicznych adaptować się do warunków środowiska, np. gatunki mezofilne (B.

licheniformis

, B. subtilis, B. coagulans, B. badius, B. smithii) mogą rosnąć w temperaturach

sięgających 60-70ºC. Są to tzw. termotolerancyjne laseczki.

Bakterie Bacillus, w zależności od gatunku wymagają do wzrostu środowiska o

różnym pH (pH 1-11). Grupa laseczek alkalofilnych (B. alkalophilus, B. firmus, B.

alcalphilus

, B. lentus, B. pasteurii) preferują pH zasadowe (pH 8-11), natomiast B. subtilis, B.

licheniformis

, B. circulans, B. laterosporus, B. pumilus lepiej rosną w pH obojętnym.

Ś

rodowisko kwaśne (acidofile) lubią B. acidocaldarius, B. coagulans i B. polymyxa. Niektóre

laseczki są halofilne (B. pantothenticus, B. pasteurii, B. globisporus, B. marinus, B.

halophilus

), wytrzymują nawet 10% stężenie NaCl.

Metabolizm Bacillus

Bacillus

należą do grupy wybitnie heterogennych chemoorganotrofów. Dobrze rosną

na podłożach bulionowych (wyj. B. larvae). Na agarze rosną w postaci dużych kolonii o

rozmiarach 3-10 mm, płaskich, zwykle matowych, o postrzępionych brzegach (choć zdarzają

się kolonie błyszczące i śluzowe). W płynnym bulionie rosną w postaci kożucha lub tworzą

zmętnienie w całej objętości pożywki.

Wymagania pokarmowe są bardzo zróżnicowane gatunkowo. Są gatunki, którym

wystarczają pojedyncze źródła węgla, azotu i energii (B. cereus, B. licheniformis, B. pumilus,

B. subtilis

), inne potrzebują kompleksowych podłoży z dodatkowymi czynnikami wzrostu

(witaminy, aminokwasy) np. B. azotofixans, B. macerans, B. polymyxa, B.

psychrosaccharolyticus

.

Wykorzystywane do wzrostu substancje organiczne, metabolizowane są w komórkach

Bacillus

w procesach tlenowych i/lub fermentacyjnych. U niektórych gatunków tlen, jako

akceptor elektronów, może być zastąpiony przez jony NO

3

-

(NO

3

do NO

2

redukują

bakterie denitryfikujące: B. azotoformans, B. cereus, B. laterosporus, B. licheniformis, B.

pasteurii, B. stearothermophilus)

. Niektóre gatunki (B. polymyxa, B. macerans i B.

azotofixans

) mogą wiązać azot atmosferyczny.

Gatunki oddychające beztlenowo przeprowadzają fermentację sacharydów. B.

cereus

i B. licheniformis wytwarzają 2,3-butandiol, glicerol, CO

2

i niewielkie ilości mleczanu

oraz etanolu. B.

polymyxa i B. macerans rozkładają skrobię i pektyny, przy czym B. polymyxa

daje 2,3-butandiol, CO

2

H

2

i etanol, a B. macerans – etanol, aceton, octan i mrówczan, CO

2

i

H

2

. Właśnie na podstawie produktów fermentacji rozróżnia się poszczególne gatunki z

rodzaju Bacillus. Alkalofilna bakteria B. pasteurii może rozkładać mocznik.

Podczas wzrostu wegetatywnego bakterie Bacillus gromadzą kwasy organiczne

powodując zakwaszanie środowiska nawet do pH 4,0-5,0. Jest to spowodowane tym, że

powstający w glikolizie pirogronian nie jest włączany jako acetylo-CoA do cyklu Krebsa

(niektóre enzymy tego cyklu są zablokowane – represja kataboliczna), tylko wchodzi w cykl

glioksalowy. Cykl Krebsa jest uruchamiany dopiero w trakcie przygotowania do sporulacji.

W końcowej fazie wzrostu wykładniczego, gdy wyczerpaniu ulegają łatwo przyswajalne

ź

ródła węgla i energii, a komórki zaczynają się przygotowywać do wytworzenia endospor,

odblokowywane są enzymy cyklu Krebsa i acetylo-CoA ulega całkowitemu utlenieniu do CO

2

.

Powstaje też wtedy dużo ATP niezbędnego przy sporulacji. Wtedy też, w warunkach

tlenowych, zostają utlenione nagromadzone wcześniej kwasy organiczne, pH środowiska

wzrasta.

Clostridium

Nie mają wysokich wymagań pokarmowych. Zwykle hoduje się je na pożywkach

agarowych z dodatkiem krwi – w celu obserwacji właściwości hemolitycznych (typ

β) lub na

pożywkach zapewniających niski potencjał redukcyjny – podłoże VL (do badania zdolności

fermentacji cukrów, np. glukozy, maltozy, sacharozy), czasem na pożywkach wybiórczych z

antybiotykami, na podłożu Wilson-Blaira (do izolacji i wykrywania beztlenowych bakterii

przetrwalnikujących, redukujących siarczany).

Bakterie istotne z punktu widzenia klinicznego

hoduje się w temp. 35-37°C, inne 30-40°C. Kolonie są duże 3-8 mm, płaskie, okrągłe lub

nieregularne, brzeg może być postrzępiony, powierzchnia matowa, szorstka, barwa szarawa

do szarożółtawej.

Do wykrywania aktywności metabolicznej stosuje się takie pożywki jak w przypadku innych bakterii, przy czym należy inkubować w

warunkach beztlenowych (anaerostat).

agar z żółtkiem jaja kurzego – do analizy lecytynazy, lipazy i proteazy,

pożywka z żelatyną i kazeiną – właściwości proteolityczne,

testy komercyjne,

chromatografia gazowa – kwasy tłuszczowe.

Fermentacja masłowa

Fermentację masłową wywołują gł. bakterie masłowe należące do rodzaju Clostridium.

Jest to typowy proces beztlenowy w wyniku, którego przy rozkładzie węglowodanów

powstaje kwas masłowy (CH

3

CH

2

CH

2

COOH). Jest to heterofermentacja, mikroorganizm

produkuje więc także i inne związki. Najczęściej wytwarzane są również: butanol, aceton,

metanol, propan, 2-propanol, kwas octowy i inne kwasy organiczne itp.

Synteza maślanu

powstaje w wyniku kondensacji dwóch cząsteczek acetylo-CoA z

wytworzeniem acetoacetylo-CoA (enzym tiolaza). Acetoacetylo-CoA jest w obecności NADH

2

redukowany przez dehydrogenazę

β

-hydroksybutyrylową do

β

-hydroksybutyrylo-CoA, który

pod wpływem krotonazy ulega dehydratacji i powstaje krotonylo-CoA. Ten jest redukowany

przez dehydrogenazę butyrylo-CoA do butyrylo-CoA, a następnie transferaza CoA przenosi

CoA na octan, a maślan zostaje usunięty z komórki. Acetylo-CoA może być wykorzystywany

do odtworzenia ATP z powstaniem octanu. W czystej fermentacji masłowej wodór pochodzący

z utleniania pirogronianu do acetylo-CoA zostaje uwolniony w formie gazowej.

Równanie sumaryczne fermentacji masłowej

C

6

H

12

O

6

+ bakterie masłowe → CH

3

CH

2

CH

2

COOH + 2CO

2

+ 2H

2

+ ok. 15 kcal/mol

glukoza

kwas masłowy

Jeśli fermentacja zachodzi zgodnie z tym równaniem to ustala się równowaga wodorowa i na

każdy mol wykorzystanej glukozy przypadają powstające 3 mole ATP.

Wytwarzanie kwasu masłowego przez gatunki z rodzaju Clostridium

•

C. butyricum – kwas masłowy, octowy, CO

2

, H

2

(substraty – glukoza, skrobia, dekstryna),

•

C. tyrobutyricum – kwas masłowy, octowy, CO

2

, H

2

(substraty – glukoza lub mleczan,

glicerol + octan),

•

C. pasteurianum – kwas masłowy, octowy, CO

2

(substraty – glukoza, skrobia, mannoza,

inulina),

•

C. pectinovorum – kwas masłowy, octowy (substraty – pektyna, skrobia, glikogen,

dekstryna),

•

C. felsineum

– kwas masłowy, octowy, CO

2

, H

2

(substraty – pektyna, kwas

galakturonowy),

•

C. acetobutylicum – kwas masłowy, octowy, CO

2

, H

2

, butanol, acetoina, etanol (substraty

– glukoza, glicerol, pirogronian),

•

C. kluyveri – kwas kapronowy, H

2

, masłowy (substraty – etanol + octan + CO

2

),

•

C. tetanomorphum – kwas masłowy, octowy, NH

3

, CO

2

, H

2

(substraty – glutaminian,

histydyna).