Pobieranie i przygotowanie materiałów od chorych do badań immunofluorescencyjnych w kierunku zakażeń

wirusami oddechowymi

•

Celem badania jest wykazanie antygenów wirusów oddechowych w komórkach nabłonka dróg
oddechowych. Materiałem do badań jest pobrany dość energicznie wymaz z tylnej ściany gardła,
lub odessana wydzielina z dróg oddechowych. Wymaz z gardła powinien być pobrany jałowym
wacikiem i umieszczony w około 0,5-1 ml soli fizjologicznej. Wacik powinien być wykonany z czystej
waty, wszelkie komercyjne waciki zawierające węgiel aktywowany lub podłoża transportowe nie
nadają się do tego celu. Umieszczony w soli fizjologicznej wacik powinien być jak najszybciej
dostarczony do laboratorium.

•

W przypadku, gdy materiał nie może być dostarczony tego samego dnia do laboratorium (np. musi
być przesłany z innego miasta) najlepiej przesyłać go w postaci utrwalonych preparatów. W tym celu
pobrane od pacjenta komórki nabłonka tylnej ściany gardła należy zawiesić w niewielkiej ilości (0,5-
1,0 ml) soli fizjologicznej i umieścić w postaci kropli o średnicy 4-5 mm na szkiełku podstawowym.
Użyte do wykonania preparatu szkiełko powinno być dobrej jakości - nie grubsze niż 0,4 mm - w
przeciwnym razie występują znaczne trudności podczas oglądania w mikroskopie fluorescencyjnym.
Do badania w kierunku każdego wirusa konieczna jest jedyna kropla zawiesiny komórek. Na
pojedynczym szkiełku podstawowym można umieścić 3-4 krople. Tak przygotowane preparaty
należy pozostawić w temperaturze pokojowej do całkowitego wyschnięcia. Po wyschnięciu
preparaty należy utrwalić przez zanurzenie ich na 15 minut w acetonie. Utrwalone preparaty mogą
być dostarczone do laboratorium w ciągu kilku dni po pobraniu.

Materiały do diagnostyki zakażeń wirusowych

Zespół objawów

chorobowych

Wirus

wywołujący

Sezono

-wość

Badanie w

kierunku

obecności

przeciwciał

Materiały do badań bezpośrednich wirusologicznych i izolacji wirusa

krtań gardło jama

nosowo-gardłowa

Kał

Płyn

mózgowo-

rdzeniowy

Mocz

Inne

I Objawy zakażenia

ze strony dróg

oddechowych

Adenowirusy cały

rok

tak (pary

surowic)

wymaz z gardła

+ + + +

Wirus grypy A

i B

zima tak (pary

surowic)

wymaz z gardła

+ + + + też plwocina

i BAL

Wirus

paragrypy

cały

rok

nie

wymaz z gardła

+ + + + też BAL

RSV

zima tak

wymaz z jamy nosowo-

gardłowej

+ + + + oraz

popłuczyny i aspiraty z

jamy nosowo-gardłowej

Rinowirusy

cały

rok

nie

nos + + +

Wirus

nagminnego

zaplenia

przyusznic

cały

rok

tak (+ + +)

wymaz z gardła

z przewodu Stensena

+ +

CMV

cały

rok

tak

wymaz z gardła,

plwocina BAL

+ +

krew

heparynizowana

(5 ml)

Enterowirus

jesień,

wiosna nie

wymaz z gardła

HSV

cały

rok

tak

wymaz z gardła

i plwocina

Zespół objawów

chorobowych

Wirus

wywołujący

Sezono

-wość

Badanie w

kierunku

obecności

przeciwciał

Materiały do badań bezpośrednich wirusologicznych i izolacji wirusa

Krtań gardło jama

nosowo-gardłowa

Kał

Płyn

mózgowo-

rdzeniowy

Mocz

Inne

II. Zakażenia

przebiegające z

wysypką:
1.plamisto-

grudkową

Adenowirus

cały

rok

tak

wymaz

z gardła

Wirus różyczki cały

rok

tak + + +

+ +

Wirus odry

cały

rok

tak + + +

wymaz

z gardła + +

+ +

Parwowirus

B19

cały

rok

tak + + +

płyn owodniowy

(PCR)

Enterowirus

jesień,

lato

nie

wymaz

z gardła

+ + +

wymaz

z odbytu, kał

+ +

Wirus

paragrypy

cały

rok

nie

wymaz

z gardła

2.pęcherzykową

RSV

zima

tak

aspiraty, popłuczyny,

wymaz

z nosogardzieli

HSV

cały

rok

tak

płyn

z pęcherzyków

+ + + (IF)

VZV

cały

rok

tak

płyn

z pęcherzyków

+ + + (IF)

Enterowirusy

lato,

jesień

nie

+ +

+ + +

Zespół objawów

chorobowych

Wirus

wywołujący

Sezono

-wość

Badanie

w kierunku

obecności

przeciwciał

Materiały do badań bezpośrednich wirusologicznych i izolacji wirusa

Krtań gardło jama

nosowo-gardłowa

Kał

Płyn

mózgowo-

rdzeniowy

Mocz

Inne

III. Zakażenia

przebiegające z

objawami ze strony

ośrodkowego

układu nerwowego
1.zapalenie opon

mózgowo-

rdzeniowych
i mózgu
2.porażenia
3.poliomyelitis

HSV

cały

rok

tak

wymaz

z gardła

+ + + +

płyn mózgowo-

rdzeniowy –

wykrywanie

przeciwciał

Arbowirusy

lato,

jesień

tak

płyn mózgowo-

rdzeniowy –

wykrywanie

przeciwciał

Enterowirusy

(Polio 1, 2, 3)

(Coxsackie A

1, 2, 4, 7, 9,

Coxsackie B 2-

5) (ECHO 2, 4,

6, 9,11, 30)

Enterowirus 71

lato,

jesień

nie

wymaz

z gardła

+ + +

kał, wymaz

z odbytu +

+

+ + + +

Wirus

nagminnego

zapalenia

przyusznic

cały

rok

tak

wymaz z gardła + +

(przewód Stensena)

+ +

+ +

Polyomawirus

(JC)

cały

rok

nie

biopsja mózgu (ME)

Wirus odry

cały

rok

tak

płyn mózgowo-

rdzeniowy –

wykrywanie

przeciwciał

Zespół objawów

chorobowych

Wirus

wywołujący

Sezono

-wość

Badanie

w kierunku

obecności

przeciwciał

Materiały do badań bezpośrednich wirusologicznych i izolacji wirusa

Krtań gardło jama

nosowo-gardłowa

Kał

Płyn

mózgowo-

rdzeniowy

Mocz

Inne

IV. Zakażenia

przebiegające z

objawami ze strony

układu

pokarmowego

Rotawirusy

zima,

wiosna

+ + + +

EIA, lateks

Adenowirusy

40,41

cały

rok

+ + + +

EIA, lateks

Astrowirusy

cały

rok

EIA

Wirus Norwalk wiosna

ME

V. Zakażenia

przebiegające z

objawami ze strony

układu sercowo-

naczyniowego

Coxsackie B

lato,

jesień

wymaz

z gardła

+ + +

Płyn z worka

osierdziowego + +

+ +

VI. Zapalenia

spojówki i/lub

rogówki

Adenowirusy cały

rok

tak

Zeskrobiny ze zmian

spojówkowych i/lub

rogówkowych + +

+ + (hodowla i IF)

HSV

cały

rok

tak (tylko
w przypadku

pierwotnego

zakażenia)

Zeskrobiny ze zmian

spojówkowych i/lub

rogówkowych + +

+ + (hodowla i IF)

VZV

cały

rok

tak (tylko
w przypadku

pierwotnego

zakażenia)

Zeskrobiny ze zmian

spojówkowych i/lub

rogówkowych + +

+ + (hodowla i IF)

Wirus odry

cały

rok

tak

Zespół objawów

chorobowych

Wirus

wywołujący Sezonowość

Badanie w

kierunku

obecności

przeciwciał

Materiały do badań bezpośrednich wirusologicznych i izolacji wirusa

Krtań gardło

jama nosowo-

gardłowa

Kał

Płyn

mózgowo-

rdzeniowy

Mocz

Inne

VII. Zakażenia

u osób

poddanych

leczeniu

immunosupre-

syjnemu

CMV

cały rok

tak

+ + +

+ +

Krew

(antygenemia),

tkanki

+ + + +

HSV

cały rok

tak

+ +

Płyn z

pęcherzyków

+ + + +,

tkanki + + +

VZV

cały rok

Płyn z

pęcherzyków

+ + + +,

tkanki + + +

EBV

cały rok

tak

+ + + +

Tkanki (PCR)

HHV-6

cały rok

tak

Krew (PCR)

VIII. Zakażenie

wewnątrz-

maciczne
i

okołoporodowe

Wirus

różyczki

cały rok

tak (IgM)

+ +

CMV

cały rok

tak (IgM)

wymaz

z gardła

+ + +

+ + +

HSV

cały rok

tak (IgM)

wymaz

z gardła

+ + +

Płyn

z pęcherzyków

Metody diagnostyki zakażeń wirusowych w oparciu

o własności biologiczne (I), bezpośrednie wykrycie lub jego podjednostek

(M), jego białek (B) lub materiału genetycznego(G) oraz odpowiedzi

immunologicznej (S)

Grupa

Metoda

Omówienie metody

Wady i ograniczenia

I

Izolacja

Zdolność wywoływania

zmian w zakażonych

organizmach lub

hodowlach komórkowych;

potwierdzenie obecności

aktywnego patogenu.

Zróżnicowanie wymagań wirusów pod

względem zakażania i patogenności dla

określonych gospodarzy linii komórkowych,

zarodków ptasich; występowanie wielu

wirusów zakażających dane komórki lub

wywołujących podobne objawy – konieczna

dalsza identyfikacja

M1

Mikroskopia

elektronowa

Bezpośrednie

zaobserwowanie wirusa
w badanym materiale (gdy

co najmniej 10

6

cząstek

wirusowych)

Konieczna znaczna liczba cząstek wirusów
w badanym materiale; możliwa tylko ocena

budowy wirionów

M2

Bierna

aglutynacja

Zlepianie przez wirusa lub

jego antygeny

opłaszczonych swoistymi

przeciwciałami krwinek lub

lateksu

Konieczna znaczna liczba cząstek wirusów
w badanym materiale; nieswoiste reakcje

wywołane przez substancje aglutynujace

krwinki

Grupa

Metoda

Omówienie metody

Wady i ograniczenia

B1

Immunofluore-

scencja

Wiązanie znakowanych przeciwciał

Przeciwciała monoklonalne mogą wykrywać

tylko wybrane subpopulacje wirusa

B2

Wykrywanie

enzymów

wirusa

Wykrywanie reaktywności odwrotnej

trnskryptazy jako potwierdzenie obecności

posiadających ją retrowirusów

Brak możliwości identyfikacji wirusa

B3

ELISA

Wiązanie antygenu przez przeciwciała i

wykrywanie innymi swoistymi przeciwciałami;

wysoka czułość

Możliwość wykrywania wybranych

subpopulacji wirusa

G1

Hybrydyzacja

DNA lub RNA

Wykrywanie sekwencji nukleotydów przez

związanie komplementarnego znakowanego

fragmentu kwasu nukleinowego

Wrażliwa na nukleazę

G2

Amplifikacje

genomu

Powielanie określonego obszaru genomu;

identyfikacja produktu metodami:

elektroforeza genomu, hybrydyzacja DNA lub

RNA, metody immunoenzymatyczne

Wrażliwe na nukleazy i inhibitory polimeraz

S1

OZH

Blokowanie przez przeciwciała występujących

na niektórych wirusach receptorów dla

krwinek

Inhibitory, brak hemglutynin u wielu wirusów,

brak rozróżniania klas immunoglobulin

S2

neutralizacja

Eliminacja zakaźności przez związanie z

wirusem przeciwciała; różnicowanie ściśle

spokrewnionych antygenowo wirusów

Długi czas wykonania; trudności z doborem

podłoża, w którym namnaża się wirus

S3

ELISA

Wiązanie znakowanych antyimmunoglobulin

z kompleksem antygen-przeciwciało; metoda

ilościowa, różnicowanie klas immunoglobulin

Fałszywie dodatnie wyniki w klasie IgM przy

obecności RF

S4

Western blot

Wykrywanie przeciwciał dla antygenów

rozdzielonych elektroforetyczni i związanych z

nośnikiem

Denaturacja epitopów przestrzennych

antygenów

Zakażenie HCMV kobiety ciężarnej

seropozytywnej

0,5-1,5% płodów ulega zakażeniu w wyniku
reaktywacji infekcji matki

0,1% noworodków wykazuje po urodzeniu
objawy kliniczne:

- upośledzenie słuchu

- opóźniony rozwój

seronegatywnej

1-5% kobiet ulega pierwotnej infekcji

30-40% płodów ulega zakażeniu

10% zakażonych noworodków
manifestuje ciężkie objawy choroby:
powiększenie wątroby i śledziony,
trombocytopenię, hiperbilirubinemię,
uszkodzenie centralnego układu
nerwowego, zapalenie płuc, drgawki i/lub
paraliż, ślepotę

U 90% tych dzieci oraz 5-15% nie
wykazujących objawów choroby po
urodzeniu występują późne następstwa
zakażenia: głuchota, upośledzenia
umysłowe, zmiany w zachowaniu,
anomalie dotyczące uzębienia i inne