Komórki somatyczne
~ 1 ~
Oznaczanie przydatności mleka surowego do skupu i
przetwórstwa
Mastitis – zapalenie wymienia
•
Spowodowane urazem mechanicznym lub zakaŜeniem bakteryjnym.
•
Bakterie namnaŜając się w wymieniu wydzielają produkty przemiany materii i toksyny.
•
Odpowiedzią na stan zapalny jest przenikanie białych ciałek krwi do wnętrza wymienia.
•
Liczba leukocytów w mleku wzrasta z około 100 000/ml do kilku milionów w 1 ml mleka.
Skład chemiczny mleka jest jego miarą normalności i zaleŜy od stanu
fizjologicznego wymienia!
zaburzenia fizjologii gruczołu mlekowego ⇒ tłuszcz, kazeina, laktoza
w większych ilościach pojawiają się ⇒ albuminy, globuliny
↑↑↑↑
spadek zawartości suchej masy (12,3 - 12,5%) ⇒ 11% - 9%
↓↓↓↓
spadek zawartości tłuszczu ⇒ do ok. 3% - 2,5%
↓↓↓↓
zmiana stopnia dyspersji ⇒ do 3nm
↓↓↓↓
wzrost poziomu białka ogólnego ⇒ forma subkliniczna 3,5 – 3,8%, ostra 6%
↑↑↑↑
spadek kazeiny
↓↓↓↓
spadek laktozy z poziomu 4,5 – 4,9% ⇒ 4,3 – 4,5%, a nawet do 1%
↓↓↓↓
zmiany składników mineralnych:
o
wzrost zawartości chloru i sodu
↑↑↑↑
o
obniŜenie zawartości potasu, wapnia i fosforu
↓↓↓↓
wzrost wartości liczby chlorocukrowej ⇒ powyŜej 2,5
↑↑↑↑
Komórki somatyczne
~ 2 ~
spadek gęstości mleka
↓↓↓↓
zmiany kwasowości mleka ⇒ pH 6,7 i więcej
↑↑↑↑
skrócenie odbarwiania barwników w próbach reduktazowych
zmniejszenie stabilności termicznej
obniŜenie zdolności podpuszczkowego krzepnięcia
surowiec nieprzydatny w produkcji Ŝywności
moŜe stanowić zagroŜenie dla zdrowia konsumentów
W mleku pochodzącym ze zdrowego gruczołu mlekowego jak teŜ w wydzielinie
zapalnej znajdują się komórki somatyczne do których zaliczamy:
• Limfocyty
• Leukocyty
• Monocyty « Plazmocyty
• Erytrocyty
• Granulocyty wielojądrzaste
• Makrofagi
• Komórki nabłonkowe płaskie pochodzące z:
- powierzchni wymienia
- kanału strzykowego
- zatoki mlecznej
• Komórki nabłonka cylindrycznego
• Komórki olbrzymie
• Ciałka Nissena
ROZPORZĄDZENIE (WE) NR 853/2004
i) w odniesieniu do surowego mleka krowiego:
Liczba drobnoustrojów w 30
o
C (na ml)
Liczba komórek somatycznych (na ml)
≤ 100 000
(
*
)
≤ 400 000
(
**
)
(
*
)
Wyliczając średnią geometryczną z okresu dwóch miesięcy,
przy pobraniu
przynajmniej dwóch próbek w miesiącu.
(
**
)
Wyliczając średnią geometryczną z okresu trzech miesięcy,
przy pobraniu
przynajmniej jednej próbki w miesiącu, o ile
właściwe władze nie określą innej
metody uwzględniania odchyleń w
poziomie produkcji.
Komórki somatyczne
~ 3 ~
OBLICZANIE ŚREDNIEJ GEOMETRYCZNEJ LICZBY KOMÓREK
SOMATYCZNYCH
Średnia geometryczna z trzech badań z okresu trzech miesięcy wynosi:
Wynik oznaczania liczby komórek somatycznych:
a
1
– w pierwszym miesiącu
a
2
- w drugim miesiącu
a
3
– w trzecim miesiącu
OZNACZANIE LICZBY KOMÓREK SOMATYCZNYCH W MLEKU
Metoda mikroskopowa – metoda referencyjna
PN-EN-ISO 13366-1 z 2000 r.
metoda najbardziej wiarygodna
Komórki somatyczne:
komórki jądrzaste
– wszystkie leukocyty i komórki nabłonkowe
Zasada metody
polega na
wykonaniu, wysuszeniu i zabarwieniu rozmazu, a następnie
policzeniu zabarwionych komórek pod mikroskopem
. PomnoŜenie liczby
komórek policzonych na określonej powierzchni przez współczynnik roboczy daje
liczbę komórek w 1 ml.
mleko do badania pobiera się do jałowych probówek
moŜna konserwować 0,6% kwasem borowym, ale max. na 24h
wykonanie preparatu w czasie nie dłuŜszym niŜ 6h od pobrania próbki
mleko podgrzewamy w łaźni do temp. 36ºC
schładzamy do temp pokojowej
dokładnie wymieszać, pobrać przy pomocy mikrostrzykawki 0,01 ml mleka i
nanieść na odtłuszczone szkiełko podstawowe, wykonując rozmaz o wymiarach
20mm x 5 mm
szkiełko kładziemy na szablon papieru milimetrowego, na którym są 4 prostokąty
o wymaganych wymiarach – dokładnie i równomiernie w obrębie prostokąta
rozprowadzamy mleko
z kaŜdej próbki mleka wykonuje się przynajmniej
2 rozmazy
Komórki somatyczne
~ 4 ~
preparaty suszy się w temp. pokojowej przez 24h
barwienie 10 min barwnikiem o składzie:
o
etanol 95% 54,0 ml
o
tetrachloroetan 40,0 ml
o
błękit metylenowy 0,6 g
o
kw. octowy lodowaty 6,0 ml
3 razy płuczemy i suszymy na przemian
oglądanie pod imersją w powiększeniu 500x lub 1000x
określenie średnicy pola widzenia liczenie elementów komórkowych (jądra
komórek, co najmniej połowa jądra powinna być widoczna w polu widzenia
mikroskopu)
liczymy z góry na dół (trzeba liczyć ilość zliczonych pasków)
omija się paski brzeŜne
liczymy co najmniej 400 komórek w jednym rozmazie
w drugim liczymy tyle pasków co w pierwszym (bez względu na liczbę komórek)
gdy w 1 rozmazie nie ma 400 komórek, liczy się komórki na wszystkich rozmazach
badanej próbki
wyniki z rozmazów dodaje się i wyznacza średnią liczbę komórek w badanym
preparacie
z jednego rozmazu wychodzi ok. 12 pasków
wyznaczenie współczynnika roboczego
długość poszczególnych pasm, w których liczone są jądra komórkowe wynosi 5
mm, a ich szerokość odpowiada średnicy pola widzenia mikroskopu
obliczyć współczynnik roboczy
wf
, a następnie liczbę komórek somatycznych
gdzie:
d – średnica pola widzenia mikroskopu,
b – liczba pasm policzonych w całości.
Liczba komórek w 1 ml mleka to
liczba policzonych komórek
somatycznych pomnoŜona przez współczynnik roboczy
pasek
rozmaz
Komórki somatyczne
~ 5 ~
INNE METODY OZNACZANIA KOMÓREK SOMATYCZNYCH
TOK terenowy odczyn komórkowy
•
Zasada polega na specyficznej reakcji kwasów nukleinowych komórek ze
związkiem powierzchniowo czynnym, który razem ze wskaźnikiem zmian pH
wchodzi w skład odczynnika testowego (np. Mastirapid – laurylosiarczan).
•
Odczynnik dodajemy w stosunku 1:1
•
Ocena wyglądu powstałej mieszaniny:
Wynik:
+
lekkie śluzowacenie
++
widoczne śluzowacenie
+++
„galaretka”
+/-
miejscami słabo widoczne galaretkowate smuŜki znikające po dłuŜszym
mieszaniu
mleko ze
zdrowego wymienia
– barwa
fiołkowo-czerwona
bez zmian konsystencji
mleko
mastitowe
–
– barwa
fioletowa
, czasami moŜe być
Ŝółta
lub
Ŝółto-zielona
CMT CALIFORNIA MASTITIS TEST Odpowiednik TOKu
BMR Test Brabancki
•
Mało dokładny
•
Barwnik jak w TOK
•
Przeprowadzany w kapilarach
•
Fotografowane jest lustro mieszaniny w lejku – zdjęcie co 5, 10, 20, 60 sek.
•
Korzystając z krzywej wzorcowej określa się (na podstawie średnicy lustra cieczy
w lejku) LKS
•
Oceniany jest czas, w jakim określona ilość mleka przeszła przez kapilarę
WMT WISCONSIN MASTITIS TEST
•
Odczynnik – laurylosiarczan
•
Wykorzystuje wzrost lepkości mleka w przypadku podwyŜszonej liczby komórek
•
Zasada jak w wiskozymetrze probówkowym
•
Probówki połączone z kapilarami
•
Mierzenie czasu przechodzenia przez kapilary
•
Dobra korelacja z FOSSOMATIC ale dopiero powyŜej 500000.
TECHNIKA CYFROWA
•
Metoda elektroniczna z uŜyciem elektronicznego liczenia cząstek
•
Opisana w normie PN-EN-ISO 13366-2 z 2001 r.
•
Utrwalenie komórek somatycznych formaldehydem
Komórki somatyczne
~ 6 ~
•
Rozpuszczenie tłuszczu
•
Odczyt liczby komórek somatycznych przy uŜyciu elektronicznego licznika cząstek
•
W metodzie przyjmuje się, Ŝe komórki somatyczne to komórki
oznaczone przez licznik po ustaleniu najniŜszej progowej wartości oraz
eliminacji kuleczek tłuszczowych
•
Mleko przepływa przez szczelinę znajdującą się między elektrodami
•
Cząsteczka przechodząc przez szczelinę wypiera równowaŜną objętość płynu o
wyŜszej przewodności.
•
Zwiększony opór podnosi napięcie, co wywołuje impulsy proporcjonalne do
wielkości cząstek.
•
Liczba impulsów odpowiada liczbie cząstek
LICZNIK COULTERA
•
Działa na zasadzie prawa Coultera, czyli cząstki – komórki przechodząc przez
szczelinę między elektrodami w środowisku elektrolitu powodują zmianę oporu
na drodze prądu
•
Wielkość tej zmiany jest proporcjonalna do wymiarów objętościowych cząstek lub
komórek
•
Liczba zmian w jednostce czasu jest proporcjonalna do liczby cząstek w mleku.
•
Kuleczki tłuszczowe muszą być rozbite.
FOSSOMATIC
•
Czyli cytometr przepływowy.
•
Próbkę mleka dokładnie wymieszać przed liczeniem, aby uzyskać moŜliwie
jednorodny rozkład komórek przenieść do naczynia pomiarowego i policzyć
komórki somatyczne z uŜyciem elektronicznego licznika cząstek
•
Wykorzystuje się zjawisko fluorescencji kompleksów DNA połączonych z
etylobromkiem.
•
Powstają impulsy świetlne zliczane przez fotopowielacz.
•
Zaleta – łatwość i szybkość wykonania badania. Nawet do 360 pomiarów na
godzinę.
MILKOSCAN
•
Działa na tej samej zasadzie co FOSSOMATIC.