Komórki somatyczne

~ 1 ~

Oznaczanie przydatności mleka surowego do skupu i

przetwórstwa

Mastitis – zapalenie wymienia

•

Spowodowane urazem mechanicznym lub zakażeniem bakteryjnym.

•

Bakterie namnażając się w wymieniu wydzielają produkty przemiany materii i toksyny.

•

Odpowiedzią na stan zapalny jest przenikanie białych ciałek krwi do wnętrza wymienia.

•

Liczba leukocytów w mleku wzrasta z około 100 000/ml do kilku milionów w 1 ml mleka.

Skład chemiczny mleka jest jego miarą normalności i zależy od stanu

fizjologicznego wymienia!

zaburzenia fizjologii gruczołu mlekowego ⇒ tłuszcz, kazeina, laktoza

w większych ilościach pojawiają się ⇒ albuminy, globuliny

↑↑↑↑

spadek zawartości suchej masy (12,3 - 12,5%) ⇒ 11% - 9%

↓↓↓↓

spadek zawartości tłuszczu ⇒ do ok. 3% - 2,5%

↓↓↓↓

zmiana stopnia dyspersji ⇒ do 3nm

↓↓↓↓

wzrost poziomu białka ogólnego ⇒ forma subkliniczna 3,5 – 3,8%, ostra 6%

↑↑↑↑

spadek kazeiny

↓↓↓↓

spadek laktozy z poziomu 4,5 – 4,9% ⇒ 4,3 – 4,5%, a nawet do 1%

↓↓↓↓

zmiany składników mineralnych:

o

wzrost zawartości chloru i sodu

↑↑↑↑

o

obniżenie zawartości potasu, wapnia i fosforu

↓↓↓↓

wzrost wartości liczby chlorocukrowej ⇒ powyżej 2,5

↑↑↑↑

Komórki somatyczne

~ 2 ~

spadek gęstości mleka

↓↓↓↓

zmiany kwasowości mleka ⇒ pH 6,7 i więcej

↑↑↑↑

skrócenie odbarwiania barwników w próbach reduktazowych

zmniejszenie stabilności termicznej

obniżenie zdolności podpuszczkowego krzepnięcia

surowiec nieprzydatny w produkcji żywności

może stanowić zagrożenie dla zdrowia konsumentów

W mleku pochodzącym ze zdrowego gruczołu mlekowego jak też w wydzielinie

zapalnej znajdują się komórki somatyczne do których zaliczamy:

• Limfocyty
• Leukocyty
• Monocyty « Plazmocyty
• Erytrocyty
• Granulocyty wielojądrzaste

• Makrofagi
• Komórki nabłonkowe płaskie pochodzące z:

- powierzchni wymienia
- kanału strzykowego
- zatoki mlecznej

• Komórki nabłonka cylindrycznego
• Komórki olbrzymie
• Ciałka Nissena

ROZPORZĄDZENIE (WE) NR 853/2004

i) w odniesieniu do surowego mleka krowiego:

Liczba drobnoustrojów w 30

o

C (na ml)

Liczba komórek somatycznych (na ml)

≤ 100 000

(

*

)

≤ 400 000

(

**

)

(

*

)

Wyliczając średnią geometryczną z okresu dwóch miesięcy,

przy pobraniu

przynajmniej dwóch próbek w miesiącu.

(

**

)

Wyliczając średnią geometryczną z okresu trzech miesięcy,

przy pobraniu

przynajmniej jednej próbki w miesiącu, o ile

właściwe władze nie określą innej

metody uwzględniania odchyleń w

poziomie produkcji.

Komórki somatyczne

~ 3 ~

OBLICZANIE ŚREDNIEJ GEOMETRYCZNEJ LICZBY KOMÓREK

SOMATYCZNYCH

Średnia geometryczna z trzech badań z okresu trzech miesięcy wynosi:

Wynik oznaczania liczby komórek somatycznych:

a

1

– w pierwszym miesiącu

a

2

- w drugim miesiącu

a

3

– w trzecim miesiącu

OZNACZANIE LICZBY KOMÓREK SOMATYCZNYCH W MLEKU

Metoda mikroskopowa – metoda referencyjna



PN-EN-ISO 13366-1 z 2000 r.



metoda najbardziej wiarygodna

Komórki somatyczne:

komórki jądrzaste

– wszystkie leukocyty i komórki nabłonkowe

Zasada metody

polega na

wykonaniu, wysuszeniu i zabarwieniu rozmazu, a następnie

policzeniu zabarwionych komórek pod mikroskopem

. Pomnożenie liczby

komórek policzonych na określonej powierzchni przez współczynnik roboczy daje
liczbę komórek w 1 ml.



mleko do badania pobiera się do jałowych probówek



można konserwować 0,6% kwasem borowym, ale max. na 24h



wykonanie preparatu w czasie nie dłuższym niż 6h od pobrania próbki



mleko podgrzewamy w łaźni do temp. 36ºC



schładzamy do temp pokojowej



dokładnie wymieszać, pobrać przy pomocy mikrostrzykawki 0,01 ml mleka i
nanieść na odtłuszczone szkiełko podstawowe, wykonując rozmaz o wymiarach
20mm x 5 mm



szkiełko kładziemy na szablon papieru milimetrowego, na którym są 4 prostokąty
o wymaganych wymiarach – dokładnie i równomiernie w obrębie prostokąta
rozprowadzamy mleko



z każdej próbki mleka wykonuje się przynajmniej

2 rozmazy

Komórki somatyczne

~ 4 ~



preparaty suszy się w temp. pokojowej przez 24h



barwienie 10 min barwnikiem o składzie:

o

etanol 95% 54,0 ml

o

tetrachloroetan 40,0 ml

o

błękit metylenowy 0,6 g

o

kw. octowy lodowaty 6,0 ml



3 razy płuczemy i suszymy na przemian



oglądanie pod imersją w powiększeniu 500x lub 1000x



określenie średnicy pola widzenia liczenie elementów komórkowych (jądra
komórek, co najmniej połowa jądra powinna być widoczna w polu widzenia
mikroskopu)



liczymy z góry na dół (trzeba liczyć ilość zliczonych pasków)



omija się paski brzeżne



liczymy co najmniej 400 komórek w jednym rozmazie



w drugim liczymy tyle pasków co w pierwszym (bez względu na liczbę komórek)



gdy w 1 rozmazie nie ma 400 komórek, liczy się komórki na wszystkich rozmazach
badanej próbki



wyniki z rozmazów dodaje się i wyznacza średnią liczbę komórek w badanym
preparacie



z jednego rozmazu wychodzi ok. 12 pasków



wyznaczenie współczynnika roboczego



długość poszczególnych pasm, w których liczone są jądra komórkowe wynosi 5
mm, a ich szerokość odpowiada średnicy pola widzenia mikroskopu



obliczyć współczynnik roboczy

wf

, a następnie liczbę komórek somatycznych

gdzie:

d – średnica pola widzenia mikroskopu,

b – liczba pasm policzonych w całości.

Liczba komórek w 1 ml mleka to

liczba policzonych komórek

somatycznych pomnożona przez współczynnik roboczy

pasek

rozmaz

Komórki somatyczne

~ 5 ~

INNE METODY OZNACZANIA KOMÓREK SOMATYCZNYCH

TOK terenowy odczyn komórkowy

•

Zasada polega na specyficznej reakcji kwasów nukleinowych komórek ze
związkiem powierzchniowo czynnym, który razem ze wskaźnikiem zmian pH
wchodzi w skład odczynnika testowego (np. Mastirapid – laurylosiarczan).

•

Odczynnik dodajemy w stosunku 1:1

•

Ocena wyglądu powstałej mieszaniny:

Wynik:
+

lekkie śluzowacenie

++

widoczne śluzowacenie

+++

„galaretka”

+/-

miejscami słabo widoczne galaretkowate smużki znikające po dłuższym

mieszaniu

mleko ze

zdrowego wymienia

– barwa

fiołkowo-czerwona

bez zmian konsystencji

mleko

mastitowe

–

– barwa

fioletowa

, czasami może być

żółta

lub

żółto-zielona

CMT CALIFORNIA MASTITIS TEST Odpowiednik TOKu

BMR Test Brabancki

•

Mało dokładny

•

Barwnik jak w TOK

•

Przeprowadzany w kapilarach

•

Fotografowane jest lustro mieszaniny w lejku – zdjęcie co 5, 10, 20, 60 sek.

•

Korzystając z krzywej wzorcowej określa się (na podstawie średnicy lustra cieczy
w lejku) LKS

•

Oceniany jest czas, w jakim określona ilość mleka przeszła przez kapilarę

WMT WISCONSIN MASTITIS TEST

•

Odczynnik – laurylosiarczan

•

Wykorzystuje wzrost lepkości mleka w przypadku podwyższonej liczby komórek

•

Zasada jak w wiskozymetrze probówkowym

•

Probówki połączone z kapilarami

•

Mierzenie czasu przechodzenia przez kapilary

•

Dobra korelacja z FOSSOMATIC ale dopiero powyżej 500000.

TECHNIKA CYFROWA

•

Metoda elektroniczna z użyciem elektronicznego liczenia cząstek

•

Opisana w normie PN-EN-ISO 13366-2 z 2001 r.

•

Utrwalenie komórek somatycznych formaldehydem

Komórki somatyczne

~ 6 ~

•

Rozpuszczenie tłuszczu

•

Odczyt liczby komórek somatycznych przy użyciu elektronicznego licznika cząstek

•

W metodzie przyjmuje się, że komórki somatyczne to komórki
oznaczone przez licznik po ustaleniu najniższej progowej wartości oraz
eliminacji kuleczek tłuszczowych

•

Mleko przepływa przez szczelinę znajdującą się między elektrodami

•

Cząsteczka przechodząc przez szczelinę wypiera równoważną objętość płynu o
wyższej przewodności.

•

Zwiększony opór podnosi napięcie, co wywołuje impulsy proporcjonalne do
wielkości cząstek.

•

Liczba impulsów odpowiada liczbie cząstek

LICZNIK COULTERA

•

Działa na zasadzie prawa Coultera, czyli cząstki – komórki przechodząc przez
szczelinę między elektrodami w środowisku elektrolitu powodują zmianę oporu
na drodze prądu

•

Wielkość tej zmiany jest proporcjonalna do wymiarów objętościowych cząstek lub
komórek

•

Liczba zmian w jednostce czasu jest proporcjonalna do liczby cząstek w mleku.

•

Kuleczki tłuszczowe muszą być rozbite.

FOSSOMATIC

•

Czyli cytometr przepływowy.

•

Próbkę mleka dokładnie wymieszać przed liczeniem, aby uzyskać możliwie
jednorodny rozkład komórek przenieść do naczynia pomiarowego i policzyć
komórki somatyczne z użyciem elektronicznego licznika cząstek

•

Wykorzystuje się zjawisko fluorescencji kompleksów DNA połączonych z
etylobromkiem.

•

Powstają impulsy świetlne zliczane przez fotopowielacz.

•

Zaleta – łatwość i szybkość wykonania badania. Nawet do 360 pomiarów na
godzinę.

MILKOSCAN

•

Działa na tej samej zasadzie co FOSSOMATIC.