1

Chemia kliniczna

Walidacja metody analitycznej: Weryfikacja danych dotyczących
charakterystyki metody wykonywanej w określonym laboratorium

Zakres roboczy: zakres zastosowania metody w którym precyzja metody,
poprawność i liniowość mieści się w przyjętych granicach

Liniowość: zakres metody gdzie wykres kalibracji określony poprzez
obliczanie współczynnika regresji liniowej metodą najmniejszych kwadratów r
> 0,999

Czu

łość analityczna: jest to najmniejsza ilość substancji, która może być

miarodajnie oznaczona za pomoc

ą wybranej metody w określonej ilości

materia

łu badanego. [ wz , 20%]

Specyficzno

ść / selektywność metody: specyficzność lub swoistość metody

to zdolno

ść metody do reagowania (oznaczania) tylko substancji badanej.

Zwykle oznaczenia prowadzimy u

żywając materiału o bardzo złożonym

sk

ładzie chemicznym (krew, mocz, PMR itp.)

Poprawność: stopień zgodności pomiędzy średnią wartością zmierzoną a
wartością oczekiwaną (nominalną).

Obciążenie (bias): różnica pomiędzy wartością oczekiwaną wyniku a przyjętą
wartością odniesienia (nominalną)

Chemia kliniczna

Strategia wyboru metody analitycznej

polega na uwzględnieniu jej:

użyteczności diagnostycznej = pomoc w określeniu
występowania i stopnia zaawansowania choroby

użyteczności praktycznej = dostępność aparatury, odczynników,
koszty, trwałość odczynników itp).

swoistość metody = analityczna specyficzność wobec
oznaczanego składnika. Mała swoistość to możliwość
inteferencji z innymi składnikami próbki.

dokładność metody = zgodność uzyskanego wyniku z wartością
rzeczywistą ( wartość rzeczywistą ustala się przez pomiar
bardzo dokładnymi metodami referencyjnymi = odniesienia).

Błąd dopuszczalny

Kryteria dopuszczalno

ści błędu metody:

B

łąd dopuszczalny - maksymalny błąd pomiaru

kt

óry nie zmienia w istotny sposób

analitycznego i klinicznego znaczenia wyniku.

2. Wed

ług klinicystow: błąd nie powinien

przekracza

ć klinicznie istotnej różnicy pomiędzy

grup

ą chorych i grupą odniesienia - nie

zalecane

3. Okre

ślenie błędu dopuszczalnego w oparciu

o informacje na temat zmienno

ści biologicznej

okre

ślonych parametrow.

• Zmienność wewnątrzosobnicza badanego

parametru wyraża różnice
wewnątrzosobnicze, występujące w czasie.
Są one spowodowane między innymi dietą,
wysiłkiem fizycznym, lekami, położeniem
ciała, godziną pobrania próbki.

• Zmienność zewnątrzosobnicza wyraża

różnice, występujące między badanymi
osobami. Wynikają one z wieku, płci, rasy,
uwarunkowania genetycznego i.t.d.

Błąd dopuszczalny

Błąd dopuszczalny

Przykłady zmienności wewnątrzosobniczej i międzyosobniczej

Parametr

Wewnątrz-(%)

Między-(%)

1.Aminotransferaza aspartylowa

24,3

41,6

2.Fosfataza alkaliczna

32,6

39,0

4.Dehydrogenaza mleczanowa

6,6

14,7

5.Bilirubina

25,6

30,5

7.Kreatynina

4,3

12,9

8.Albumina

3,1

4,2

9.Wapń

1,9

2,8

11.Potas

13,6

13,4

12.Sód

0,7

1,0

Dopuszczalny błąd precyzji

CV

A

≤ 0,5 x CV

1

CV

A

-

współczynnik zmienności określający

dopuszczalny błąd precyzji

CV

1

-

współczynnik zmienności określający

zmienność wewnątrzosobniczą

Współczynnik zmienności dopuszczalnego

błędu precyzji nie powinien przekraczać

połowy zmienności wewnątrzosobniczej

badanego parametru

.

Błąd dopuszczalny

2

Dopuszczalny błąd dokładności

B

A

=

%

A

≤ 0,25 x CV

1

2

+

CV

G

2

CV

1

-

współczynnik zmienności określający zmienność

wewnątrzosobniczą

CV

G

-

współczynnik zmienności określający zmienność

międzyosobniczą

B

A

=



%

A

– względna różnica określająca dopuszczalny błąd dokładności

Wyznaczanie dopuszczalnego błędu w oparciu o kryteria

zmienności biologicznej mogą być korygowane w zależności

od możliwości technicznych (precyzja analityczna) metody.

DBD - Powinien wyrażać się różnicą nie przekraczającą

jednej czwartej sumy zmienności wewnątrzosobniczej i

międzyosobniczej badanego parametru.

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Na podstawie pożądanej precyzji i dokładności wyliczyć można
dopuszczalny błąd całkowity: TE

A

TE

A

= (1,65xCV

A

) + B

A

CV

A

= współczynnik zmienności określający dopuszczalny błąd

precyzji, precyzja pożądana

B

A

= względna różnica określająca dopuszczalny błąd dokładności,

dokładność pożądana

Wyznaczanie dopuszczalnego błędu w oparciu o kryteria zmienności
biologicznej mogą być korygowane w zależności od możliwości
technicznych (precyzja analityczna) metody.

Błąd dopuszczalny

Przykłady proponowanego błędu

dopuszczalnego całkowitego TE

A

(%):

1.

Sód

0,3

2. Potas

2,4

3.

Wapń

0,9

4.

Żelazo

15,9

5. Cholesterol

2,7

6. glukoza -

2,2

7. bilirubina-

11,3

8. tr

ójglicerydy -

11,5

9. kinaza kreatyny -

20.9

Wartości Referencyjne

Wartości referencyjne

Wartości referencyjne - definicja : zakres wartości badanego parametru

obserwowane lub mierzone w zdefiniowanej grupie uczestników
badania.

1.

Statystycznie

wartości obserwowane w grupie badanie które mają zwykle rozkład
„normalny” wg Gausa

2. Epidemiologiczne

Wyniki badań wykonane na dużej grupie zdrowych ochotników.
Przykład – wykazano że 95% wyników TG zawarte jest w granicach
0.6

– 2.4 mmol/L. Wiadomo, że wartości te mogą zmieniać się w

zależności od składu demograficznego grupy.

3. Kliniczne

Wartości określonego parametru spotykane w grupie pacjentów u
których nie stwierdzono określonej choroby.

Wartość mierzona (obserwowana) - wartość uzyskana w celu porównania z

wartościami referencyjnymi w celu podjęcia decyzji medycznej

Wartości referencyjne

WARTOŚCI NORMALNE, ZAKRES REFERENCYJNY

Przyczyny ustalenia wartości normalnych:

1.

tworzenie układu odniesienia dla wyników laboratoryjnych,

2.

wskazówka do określenia błędu dopuszczalnego analizy,

3.

ocena wartości diagnostycznej testu analitycznego.

Warunki konieczne

do właściwego pomiaru wartości normalnych:

1.

dobór osób referencyjnych wg ustalonego kryterium zdrowia,

2.

odpowiednio duża liczebność grup o wyodrębnionych cechach

(wiek, płeć, rasa, itd.),

3.

określone warunki pobierania, z uwzględnieniem zmienności

okołodobowej,

4.

określone warunki transportowania, przechowywania,

postępowania analitycznego,

5.

kontrola jakości wyników: dokładności i precyzji wg ustalonego BD,

6. profesjonalne opracowanie statystyczne.

3

Wartości referencyjne

Warunki tworzenia grupy referencyjnej

:

1.

Precyzyjna definicja grupy badanej (wiek, płeć, rasa
itp.)

2.

Badana grupa referencyjna powinna charakteryzować
się podobnymi cechami demograficznymi jak
potencjalna grupa pacjentów

3. Standaryzowane metody pobierania, przechowywania i

transportu materiału

4.

Ten sam rodzaj materiału badanego

5.

Standaryzowane metody analizy materiału

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Triglicerydy – 95% CE

Na

+

= x

śr

± 2 OS

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Cel kontroli wewnątrz i zewnątrzlaboratoryjnej:.

-

wykrywa niezgodności w kalibracji metod

-

pomaga ustalić listę rekomendowanych metod

-

normy ustalone dla określonego laboratorium stają się

normami ogólnymi (identyczne dla każdego lab.)

- wzrasta zaufanie lekarza do pracy laboratorium

-

wzrasta prawdopodobieństwo otrzymania identycznych

wyników kiedy materiał od tego samego pacjenta

zostanie oznaczony w kilku laboratoriach

-

licencjonowanie laboratoriów

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Materiał kontrolny: liofilizowany, rozpuszczany przed oznaczaniem
przygotowywany przez firmy, biologicznie bezpieczny

Materiał kontrolny komercyjny - normalny oraz patologiczny (lipemiczne,
glikemiczne), m

ateriał kontrolny ma stabilny skład w seriach i między seriami.

Kontrola wewnątrzlaboratoryjna: kontrola metody przez personel laboratorium.

Kontrola międzylaboratoryjna: centralnie rozdzielane jest ten sam materiał
kontrolny do szeregu laboratoriów (laboratoria nie znają stężenia) - jednostka
centralna zbiera wyniki i porównuje je.

Metoda referencyjna (porównawcza) - ten sam materiał testowany identyczną
metodą w wyselekcjonowanych laboratoriach. Średnia wartość jest uważana za
wartość prawdziwą. Laboratorium referencyjne: laboratorium wykonujące testy
dla metody referencyjnej.

Wartość średnia grupy kontroli: wartość średnia danego parametru oznaczonego
w tym samym materiale w rutynowych lab. dysponujących tym samym
wyposażeniem technicznym. Zazwyczaj pośrednikiem I jednostką zbierającą
wyniki jest laboratorium naukowe firmy produkującej sprzęt laboratoryjny

.

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Warunkiem prawidłowego wyznaczenia powtarzalności a szczególnie
odtwarzalności metody jest używanie odpowiedniego materiału kontrolnego.

Materiałem (surowicą) kontrolną jest płynna lub stała (liofilizowana) surowica
ludzka lub bydlęca która zachowuje stały stężenie (aktywność) badanych
parametrów przez dłuższy okres czasu. Zwykle duża partia surowicy
podzielona jest na porcje o identycznym składzie. Stosuje się zwykle materiał
kontrolny zawierający stężenie składników spotykanych u osób zdrowych
(poziom N) oraz osób chorych (poziom P).

Preparaty krwi pełnej do kontroli jakości badań hematologicznych przygotowuje
się analogicznie - trzy poziomy stężenia poszczególnych komórek.

Surowica kontrola może być:

1. mianowana – laboratorium referencyjne fabrycznie oznaczyło stężenie
określonych składników w surowicy kontrolnej.

2. niemianowana – znane są jedynie przybliżone wartości stężenia badanych
składników.

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Kontrola jakości badań laboratoryjnych

1.

Kontrola precyzji metody – polega na wielokrotnym oznaczeniu

stężenia określonej substancji w tym samym materiale.

Kontrolujemy powtarzalność metody – zgodność wyników
oznaczania w tej samej próbce w jednej serii pomiarowej na tym
samym aparacie i stosując ten sam system kalibracji aparatu –
określamy najmniejszą możliwą zmienność analityczną jaką można
osiągnąć za pomocą określonej metody analitycznej, określonego
zestawu odczynników i określonego sprzętu.

Kontrolujemy odtwarzalność metody

– zgodność wyników oznaczeń

w poszczególnych dniach pracy aparatu.

Wyniki odtwarzalności oznaczeń określonego parametru przez 21-
30 dni pozwalają na wyliczenie średniej arytmetycznej i odchylenia
standardowego (rozproszenie wyników wokół wartości średniej).
Karty kontroli Levy-Jenningsa.

4

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Kontrola odtwarzalności (międzyseryjnej)

materiałem kontrolnym jest liofilizowana surowica bydlęca -
porcjowane, przechowywane w - 20

o

C . Materiał nie jest

metrykowany.

Metrykowanie materiału kontrolnego - oznaczanie parametrów
przez 21 dni, określenie WZ, powinna być < niż 0,5 DGB

Postępowanie z próbą kontrolną:

a. włączenie jej do każdej serii badań

b. włączenie do każdego wyniku badań - dyżur, cito

obliczanie błędu = Xi x 100 / Xśr = bł(%)

Materiał kontrolny

Matryca analityczna:

Materia

ł biologiczny o bardzo złożonym składzie

chemicznym np. krew, mocz, PMR, ka

ł itp. zawiera szereg

substancji chemicznych po

łączonych ze sobą w postaci

kompleks

ów, soli złożonych, miceli woda-lipid.

Wyst

ępowanie tego rodzaju połączeń może przeszkadzać w

reakcji chemicznej lub immunochemicznej.

Wyst

ępujący w materiale badanym określony układ

substancja badana - substancje towarzysz

ące nazywamy

matryc

ą analityczną.

Zmiany sk

ładu chemicznego podczas reakcji chemicznej

np. wytr

ącanie białka z surowicy przed oznaczaniem

niekt

órych leków mogą mieć wpływ na ostateczny wynik

badania.

Materiał kontrolny

Przykładem matrycy analitycznej jest surowica bydlęca
lub surowica ludzka osób zdrowych stosowana do
przygotowania „materiałów kontrolnych”

Materiał kontrolny

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Kontrola dokładności:

metrykowany materiał kontrolny: Serostandard N i
P, Europe Control Serum Hyland itp.

cel: określenie błędu dokładności:

% bł. = [X(śr z 3 ozn) - Xrz] x 100 / Xrz

Kontrolę prowadzi się na karcie kontroli odkładając
% bł - data bad.

Materiał nie służy jako wzorzec lub kalibrator.

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

5

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Reguły Westegarda:

reakcja

1

2S

- > X + 2 OS

(ostrzeżenie)

1

3 S

- > X + 3 OS

(odrzucenie)

(RE)

2

2S

- dwukrotnie > X + 2 OS

(odrzucenie)

(SE)

lub > X - 2 OS

R

4S

- jedna

> X + 2 OS

(odrzucenie)

(RE)

następnie jedna > X - 2 OS

4

1S

- czterokrotnie

> X + 1 OS

lub czterokrotnie

> X - 1 OS

10

X

-

dziesięciokrotnie wynik będzie powyżej lub poniżej średniej

Karta kontrolna -

nanosi się wynik jako % odchylenia od wartości

nominalnej.

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Kontrola powtarzalności - stosowana gdy są trudności w uzyskaniu
trwałego materiału kontrolnego np. pełna krew

„metoda nieznanego dubletu”

-

oznacza się dwukrotnie, niezależnie badany składnik

-

oblicza różnicę w wyniku

-

przygotowuje zbiór 21 dubletów, oblicza 21 różnic, wylicza średnią

2.5 x R(średnie) = 95% oznaczeń = 2S

-

oblicza odsetkową wartość wsp. R

[2.5 x R(średnie)] x 100

--------------------------------

= błąd oznaczenia < DGB

X(średnie)

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Przykład:

Oznaczanie hematokrytu:

X 1

X 2

R 1

1

46,5

47,3

0,8

...

...

...

21

43,0

43,5

0,5

----------------------------------------------------------

n=21

Xśr=46,0

Rśr=0,64

2.5 x Rśr = 2.5 x 0,64 = 1,6

1,6 x 100 / 46 =

3,5 %

( DGB dla Ht = 10%)

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Zapobieganie błędom w medycznym laboratorium

diagnostycznym to QA (Quality Assurance) „system

zapewniania jakości” w laboratorium.

Definicja QA = Zespół działań powodujących że wynik

badania jest wiarygodny i może spełnić określone

zadania diagnostyczne umożliwiającą

podejmowanie decyzji związanych z praktyką

medyczną.

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Funkcjonowanie procedur zapewnienia jakości QA

polega na identyfikacji i wyeliminowaniu tych

czynności w postępowaniu przedanalitycznym które

mogą zmienić własności fizyko-chemiczne próbki.

Rozwiązaniem jest standaryzacja wszystkich procedur.

Przygotować należy instrukcję zapewnienia jakości

badań QAM – SOP która opisuje sposób

postępowania z:

a. Pacjentem

b. Próbką materiału pobraną od pacjenta

c. Wynikiem badania

6

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Wymagania stawiane procedurom badawczym (np. w formie SOP

– standard

operational procedure)

- minimum informacji:

1.

cel badania;

2.

zasada wykorzystywanej procedury;

3.

analityczne cechy metody:



liniowość,



precyzja,



dokładność wyrażona jako standardowa niepewność pomiaru,
próg wykrywalności,



zakres pomiarowy,



błąd systematyczny,



czułość



swoistość analityczna);

4.

rodzaj próbki pierwotnej (z uwzględnieniem rodzaju pojemnika i
substancji dodatkowych);

KONTROLA JAKOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH

Wymagania stawiane procedurom badawczym (np. w formie SOP)

- minimum informacji:

1.

wymagane wyposażenie i odczynniki lub system badań;

2.

procedury kalibracyjne

3.

etapy postępowania;

4.

procedury kontroli jakości;

5.

interferencje (np. lipemia, hemoliza, bilirubinemia) i reakcje krzyżowe;

6.

podstawy procedury obliczania wyników,

7.

zakres biologicznych wartości referencyjnych;

8.

zakres wartości wydawanych wyników,

9.

wartości alarmowe/krytyczne, gdzie ma to zastosowanie;

10. interpretacja laboratoryjna;

11.

środki ostrożności;

12.

potencjalne źródła zmienności