1

B

ADANIE WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH AMINOKWASÓW

I

DENTYFIKACJA AMINOKWASÓW

B

IAŁKA

,

JAK I WOLNE AMINOKWASY REAGUJĄ ZA POŚREDNICTWEM GRUP

:

-NH

2

I

–COOH

Z

NINHYDRYNĄ

,

DINITROFLUOROBENZENEM I KWASEM AZOTOWYM

(III).

W

YSTĘPOWANIE W STRUKTURZE AMINOKWASÓW

INNYCH GRUP FUNKCYJNYCH

,

OPRÓCZ AMINOWEJ I KARBOKSYLOWEJ

,

UMOŻLIWIA IDENTYFIKACJĘ TYCH

AMINOKWASÓW NA PODSTAWIE CZUŁYCH REAKCJI BARWNYCH

.

Reakcja biuretowa

Nazwa pochodzi od biuretu, związku powstającego przy ogrzewaniu mocznika do 180

O

C. Reakcję

biuretową dają wszystkie połączenia zawierające w cząsteczce co najmniej 2 grupy -CO-NH- połączone ze sobą
bezpośrednio (np. w diamidzie kwasu szczawiowego NH

2

-CO-CO-NH

2

), poprzez azot (w biurecie) lub poprzez

atom węgla (w diamidzie kwasu malonowego, bursztynowego, w produktach hydrolizy białek). W wyniku
utworzenia połączenia koordynacyjnego Cu

2+

z dwoma przyległymi wiązaniami –CO-NH- powstaje barwny

produkt. Dodatniego odczynu reakcji biuretowej nie dają wolne aminokwasy i dipeptydy.

Wykonanie:

Do 1 ml danej próby dodać 1 ml NaOH i kilka kropli 0,5% CuSO

4

W obecności białka powstaje fioletowe

zabarwienie. Uwaga: ponieważ niebieska barwa odczynnika może maskować właściwy odczyn należy
unikać nadmiaru CuSO

4

.

Reakcja ninhydrynowa

Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu poprzez iminokwasy do amoniaku, dwutlenku

węgla i aldehydu uboższego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji cząsteczki zredukowanej i utlenionej
ninhydryny z amoniakiem powstaje niebiesko-fioletowe zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do
zawartości azotu aminowego aminokwasów.

2

R

C

COOH

NH

2

H

+

C

C

C

O

O

OH

OH

zredukowana

ninhydryna

R

CH

NH

+

+

C

C

C

O

O

H

OH

CO

2

ninhydryna

+

R

CH

NH

H

2

O

+

R

C

O

NH

3

+

H

C

C

C

O

O

OH

OH

2

NH

3

+

+

C

C

C

O

O

H

HO

C

C

C

O

O

C

C

C

O

O

N

3H

2

O

H

2

O

+

NH

4

+

barwny kompleks

Wykonanie:

Do 1 ml próby badanej dodać 3-4 krople 0,1% roztworu ninhydryny w 50% etanolu. Po wymieszaniu próbę

ogrzać do wrzenia. Wszystkie aminokwasy (oprócz proliny) reagują z ninhydryną tworząc niebieskie
zabarwienie.

Reakcja ksantoproteinowa

Aminokwasy aromatyczne oraz fenole ulegają reakcji nitrowania w czasie ogrzewania ze stężonym HNO

3

,

dając żółto zabarwione pochodne nitrowe (fenyloalanina wymaga do nitrowania dodatku H

2

SO

4

).

+

2H

2

O

H

2

C

NH

3

COOH

2HNO

3

OH

H

2

C

NH

3

COOH

OH

O

2

N

Wykonanie:

Do 1 ml próby badanej dodać 0,5 ml stężonego HNO

3

i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez 2 min.

Wytrąca się żółty osad.

Reakcja Adamkiewicza

Jest to reakcja charakterystyczna dla tryptofanu zawierającego pierścień indolowy. W obecności kwasu

siarkowego i formaldehydu (kwas glioksalowy) dwie grupy indolowe ulegają kondensacji z wydzieleniem
cząsteczki wody i dają barwny fioletowy związek. Schemat przebiegu reakcji:

3

Wykonanie:

Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli formaldehydu. Po wymieszaniu roztwór podwarstwić (po

ściance) stężonym H

2

SO

4

. Na granicy cieczy powstaje fioletowy pierścień.

Reakcja Millona

Reakcja na wykrywanie tyrozyny jest mało specyficzna, ponieważ dodatni wynik dają również związki

zawierające reszty fenolowe.

Wykonanie:

Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli odczynnika Millona. Mieszaninę ogrzewać w łaźni wodnej przez

kilka minut. W przypadku obecności tyrozyny pojawia się biały osad, który zabarwia się na żółto, a później na
czerwono (lub powstaje czerwone zabarwienie roztworu).

Wykrywanie cysteiny i cystyny

Zawarta w cysteinie i cystynie siarka w silnie zasadowym środowisku ulega uwolnieniu w postaci jonów

siarczkowych, które z jonami Pb

2+

dają czarny osad PbS. Metionina nie daje dodatniego wyniku w tej reakcji.

Schemat przebiegu reakcji:

HC

NH

2

COOH

H

2

C

SH

2OH

+

C

O

COOH

CH

3

S

+

2

NH

3

+

H

2

O

+

S

2

PbS

Pb

2

+

Wykonanie:

Do 1 ml próby badanej dodać 1 ml roztworu octanu ołowiu i 3 ml 10% roztworu NaOH (roztwór powinien

być klarowny). Próbkę ogrzewać na łaźni wodnej, po kilku minutach pojawia się czarny osad.

4

Wykrywanie glutaminy

Próba na obecność glutaminy wykorzystuje obecność w jej cząsteczce ugrupowania amidowego, z którego

w warunkach hydrolizy zasadowej uwalnia się gazowy amoniak. Dodatni wynik tej reakcji dają też asparagina
i sole amonowe.

Wykonanie:

Do 3 ml próby badanej dodać 3 ml 10% NaOH (roztwór dodać do probówki pipetą, tak aby nie dotknąć jej

wylotu). Całość umieścić we wrzącej łaźni wodnej a do wylotu probówki zbliżyć zwilżony uniwersalny papierek
lakmusowy. W przypadku obecności glutaminy papierek zmienia zabarwienie na niebieski Uwaga: należy
uważać, aby nie dotknąć papierkiem brzegu probówki. wówczas zmiana zabarwienia papierka następuje
na skutek obecności NaOH a nie amoniaku.